謝斯玉，譚曉凝，田佳緣，霍慶秀，楊 琨,2,3*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

藏羊又稱藏系羊[1]，發(fā)育成熟晚，主要分布于青藏高原，主要產(chǎn)區(qū)在青海。因其耐高寒、耐干旱、喜濕冷等習(xí)性，相比于綿羊更適合高原低氧環(huán)境而成為西北牧民的主要飼養(yǎng)畜種。此次試驗(yàn)根據(jù)藏羊自身耐缺氧的特點(diǎn)開展相關(guān)研究。

在適應(yīng)性低氧反應(yīng)的調(diào)控因子中，本試驗(yàn)所研究的低氧誘導(dǎo)因子家族（HIFs）是不可或缺的一類[2]。在1997年HIF-2α被Tian等[3]克隆出來，前期各種研究表明其mRNA幾乎僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，因此又稱為“內(nèi)皮PAS蛋白1（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）”。HIF-2α和HIF-1α的結(jié)構(gòu)相差不大，屬于異源二聚體，分別由功能型亞基HIF-2α和結(jié)構(gòu)型亞基HIF-1β所組成。HIF-2α的N端具有能與DNA結(jié)合的basic Helix-Loop-Helix（bHLH）結(jié)構(gòu)域和Per-Art-Ser（PAS）結(jié)構(gòu)域，肺血管對(duì)急性和慢性低氧做出反應(yīng)極其重要的結(jié)構(gòu)域是在其C端含有的轉(zhuǎn)錄激活作用的反式活化結(jié)構(gòu)域[4]，HIF-2α能調(diào)控血管再生，促進(jìn)細(xì)胞增殖，還具有加快血細(xì)胞成熟、肺血管發(fā)育等功能[5,6]。在藏羊的肺臟器官中為了提高其細(xì)胞對(duì)高原低氧的適應(yīng)性而增加HIF-2α在肺臟的含量，從而使ATP產(chǎn)能增加，減少氧化物產(chǎn)量[7]，進(jìn)而達(dá)到預(yù)期效果。本次研究以藏羊的肺臟為試驗(yàn)材料，檢測(cè)HIF-2α蛋白在藏羊肺臟中的表達(dá)分布情況。

1 材料與方法

1.1 材料采集

所有健康藏羊來自臨夏回族自治州屠宰場(chǎng)，其肺臟組織均在藏羊放血后用4%的多聚甲醛及時(shí)固定采集。

1.2 材料處理

將藏羊的肺臟組織（長(zhǎng)、寬均為1 cm左右，厚度不超過5 mm的小塊）進(jìn)行石蠟包埋，染色方法按具體試驗(yàn)步驟進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)試劑

所用試劑均購(gòu)自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，主要有HIF-2α兔多克隆抗體（bs-1447R）、SP試劑盒（兔）（SP-0023）、DAB染色試劑盒（C02-04001）。

1.4 HE染色法

取大約1 cm3的肺臟組織制成石蠟切片（厚4～5 μm），切片進(jìn)行HE染色觀察藏羊肺臟組織結(jié)構(gòu)的完整性及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)

將HIF-2α兔多克隆抗體作為HIF-2α抗體，抗體的稀釋比例為1∶100，當(dāng)組織切片加入一抗后，需要在37℃環(huán)境下孵育2～3 h。使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行具體操作。

1.6 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果有3種，即強(qiáng)陽性表達(dá)（顯色結(jié)果為深棕色）、弱陽性表達(dá)（顯色結(jié)果為黃棕色）、陰性表達(dá)（顯色結(jié)果為棕黃色）。

2 結(jié)果

2.1 藏羊肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

藏羊肺臟HE染色結(jié)果如圖1所示。對(duì)HE染色的肺臟組織切片并展開了組織學(xué)觀察，肺泡在單位面積中數(shù)量多且較小，肺泡壁較厚，由扁平細(xì)胞和分泌細(xì)胞圍成肺泡腔。肺泡膈較厚，其內(nèi)的毛細(xì)血管均呈擴(kuò)張狀態(tài)。

圖1 藏羊肺臟組織切片HE染色法觀察結(jié)果

2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-2α蛋白表達(dá)

藏羊HIF-2α蛋白免疫組化染色如圖2所示，在藏羊肺臟組織中，免疫組化染色結(jié)果顯示HIF-2α蛋白在終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)高于肌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)中的表達(dá)，為強(qiáng)陽性表達(dá)，在肺泡隔間充質(zhì)細(xì)胞可見少量表達(dá)。I型細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)少于肺泡Ⅱ型細(xì)胞。

圖2 藏羊肺臟組織切片免疫組化觀察結(jié)果

3 討論

藏羊已在形態(tài)和生理上適應(yīng)了高原的缺氧環(huán)境，其肺組織單位面積中不僅肺泡數(shù)量多，血管數(shù)量也多，毛細(xì)血管內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量也有隨著海拔高度升高而增加的趨勢(shì)，這些都有利于增加肺通氣量和肺血流量，從而提高藏羊肺臟的肺泡通氣量，并加快肺臟中的血氧運(yùn)輸速度。藏羊在低氧環(huán)境下肺氣體交換率的改變都是基于這些特征，這些適應(yīng)性變化為藏羊維持體循環(huán)和肺循環(huán)的正常功能提供了生理?xiàng)l件基礎(chǔ)[8,9]。

氧氣是調(diào)節(jié)HIF-2α表達(dá)的關(guān)鍵因素。Talks[10]等研究表明，正常氧濃度下除了巨噬細(xì)胞外的健康細(xì)胞基本檢測(cè)不到HIF-2α的表達(dá)外，通過低氧處理后健康未受損的細(xì)胞內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達(dá)幾乎都顯著增多。Raghavan等[11]在HPASMCs模型的鉆研中得到低氧下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是增殖的，這就是HIF-2α在低氧情況下通過誘導(dǎo)Forkhead Box M1而產(chǎn)生的效果。Cowburn等[12]發(fā)現(xiàn)通過HIF-2α能增強(qiáng)下游靶基因Arginase-1的表達(dá)，從而引起肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓，表明慢性低氧增加了HIF-2α的穩(wěn)定性。低氧能夠增強(qiáng)HIF-2α在藏羊肺臟中的表達(dá)效果，影響藏羊的肺功能，從而推測(cè)其是藏羊能在高原低氧環(huán)境下生存的重要影響因素。

4 結(jié)論

藏羊肺臟在肌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)的表達(dá)程度遠(yuǎn)低于肺泡導(dǎo)管、終末支氣管上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞的表達(dá)程度。