劉鵬飛胡艷婷姜靜雯趙 晟鄧 會(huì)薛新穎潘 磊崔 磊王 勇喬 輝李天佐趙斌江*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院,北京 100038;2.北京急救中心,北京 100038)

低壓低氧導(dǎo)致的認(rèn)知障礙及腦水腫是高原環(huán)境急性期一種常見的表現(xiàn)類型,也是高原相關(guān)性腦病的病理基礎(chǔ)[1]。 大腦對(duì)缺氧的耐受力差,低氧會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)異常,炎癥與應(yīng)激反應(yīng),代謝紊亂[2]。部分患者可以出現(xiàn)神經(jīng)心理障礙,包括焦慮、抑郁、睡眠障礙,認(rèn)知損傷,反射遲鈍等[3]。 既往研究表明,高海拔暴露引起的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是高原腦病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[4-5]。 嚴(yán)重的炎癥導(dǎo)致炎癥因子的過度釋放,包括白細(xì)胞介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6[5-6]。 這些介質(zhì)可進(jìn)一步誘發(fā)血腦屏障損傷、腦水腫和細(xì)胞凋亡。 這些細(xì)胞因子受到 TLR-4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控[7],所以本研究選擇 TLR-4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路與高原腦病之間的關(guān)系。

通心絡(luò)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的中藥制劑,主要成分包括人參,水蛭,全蝎等[8]。 近年來研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)可以抗氧化應(yīng)激,抗炎,改善內(nèi)皮功能,目前臨床中廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病[9-10]。 但是其對(duì)低壓低氧導(dǎo)致的腦水腫及認(rèn)知障礙并無明確報(bào)道。 因而本研究擬建立低壓低氧環(huán)境模擬高原模型,從TLR-4/MyD88/NF-κB角度揭示可能的作用機(jī)制,為臨床高原腦病的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠 64 只(8 周齡,180~220 g,清潔級(jí))購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 所有大鼠飼養(yǎng)于北京世紀(jì)壇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,所有操作均在世紀(jì)壇醫(yī)院動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(京)2017-0025]。 本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過北京世紀(jì)壇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019 年科研倫審第(49)號(hào))。 本實(shí)驗(yàn)方案符合中國(guó)衛(wèi)生部《動(dòng)物管理規(guī)定》(2001 年第55 號(hào)文),并且按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

通心絡(luò)購(gòu)置于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)為090226),經(jīng)高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)分析鑒定,通心絡(luò)的主要化學(xué)成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷b1、異龍腦、冰片、芍藥苷、紅棗苷A、紅棗苷B,具有多種生物活性。 兔抗TLR-4 多克隆抗體(ab217274,Abcam,英國(guó));兔抗 MyD88(ab2064,Abcam,英國(guó));兔抗 p-NF-κB p65 多克隆抗 體 ( ab16502, Abcam, 英 國(guó) ); 兔 抗-IκB-α(ab32518,Abcam,英國(guó))單克隆抗體;兔抗-AQP4 多克隆抗體(ab125049,Abcam,英國(guó));兔抗-MMP9-單克隆抗體(ab58803,Abcam,英國(guó));β-actin 一抗(ab8227,Abcam,英國(guó));白介素(IL)-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)置于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司(批號(hào):E-EL-R0012c,E-EL-R0896c,E-EL-R2856c);光學(xué)顯微鏡(Olympus,徠卡,德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)開始前,64 只成年雄性Sprague-Dawley 大鼠在溫度(23±2)℃、濕度(55%~60%)、光照/暗循環(huán)12 h 的空調(diào)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,并飼喂實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。 適應(yīng)期結(jié)束后,所有大鼠在水迷宮(morris water maze,MWM)中進(jìn)行5 d 的定位航行訓(xùn)練,形成記憶。 然后隨機(jī)分為四組,每組16 只。正常組(C):飼養(yǎng)在常壓常氧環(huán)境中,給予0.9%生理鹽水灌胃 7 d,每天1 次,作為對(duì)照;通心絡(luò)組(TXL):飼養(yǎng)在常壓常氧環(huán)境中,予1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)灌胃7 d,每天1 次;低壓低氧組(HH):飼養(yǎng)在低壓低氧環(huán)境中,予0.9%生理鹽水灌胃7 d,每天1 次;低壓低氧+通心絡(luò)組(HH-TXL):飼養(yǎng)在低壓低氧環(huán)境中,予1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)灌胃7 d,每天1 次。 低壓低氧暴露7 d 后,每組隨機(jī)取6 只大鼠進(jìn)行腦水含量測(cè)定,其余大鼠大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 低壓低氧環(huán)境建立

通過動(dòng)物減壓艙模擬海拔6000 m 高空,保持光照/黑暗循環(huán)12 h,氣壓為50 kPa,含氧量為10%(與海拔6000 m 相同)的環(huán)境,溫度和濕度保持在25℃~27℃,55%~60%。 用新鮮空氣(5~6 L/min)持續(xù)沖洗,補(bǔ)充大鼠消耗的O2,去除大鼠產(chǎn)生的CO2。 在30 min 的時(shí)間內(nèi),開始上升到目標(biāo)高度的速率為 3 m/s。 每天上午 10 ∶00 打開腔室 1 h,補(bǔ)充食物、水、填充物和通心絡(luò)處理。 大鼠連續(xù)7 d 暴露于6000 m 的環(huán)境中。

1.3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將大鼠置于曠場(chǎng)(100 cm×100 cm×50 cm)中央(上海玉研科學(xué)儀器有限公司,上海),內(nèi)壁涂成黑色。 活動(dòng)由視頻跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)記錄,曠場(chǎng)分為中心區(qū)域和周圍區(qū)域。 所有大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)探索5 min,記錄大鼠走行的全程距離,記錄大鼠在中心區(qū)域停留的時(shí)間。 每只大鼠在測(cè)試結(jié)束時(shí),用75%的乙醇擦拭曠場(chǎng),以避免嗅覺線索的出現(xiàn)。

1.3.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮實(shí)驗(yàn)包括兩部分,定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)。 采用Morris 水迷宮(上海玉研科學(xué)儀器有限公司,上海)(MWM)進(jìn)行定位航行和空間探索測(cè)試。 圓形水池直徑180 cm,深度60 cm,注水至50 cm 高度(溫度22℃~24℃)。 水迷宮在概念上被平均劃分為四個(gè)象限,標(biāo)記為:I,II,III,IV。 在第III 象限中心,水面以下2 cm 處有一逃生平臺(tái)。 水迷宮裝置上方設(shè)置了攝像頭和視頻跟蹤系統(tǒng),監(jiān)控并記錄大鼠的游泳軌跡。 在低壓低氧環(huán)境暴露前,所有大鼠均進(jìn)行5 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)。 在每次實(shí)驗(yàn)中,大鼠面對(duì)池壁,被隨機(jī)放置在四個(gè)象限之一的水中。在每次實(shí)驗(yàn)中,初始象限的順序是不同的。 所有老鼠允許在60 s 內(nèi)找到隱藏的平臺(tái)。 如果老鼠在60 s內(nèi)沒有找到平臺(tái),則引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái),并在平臺(tái)上停留10 s。 記錄并計(jì)算大鼠的逃逸潛伏期(s)、游泳距離(cm)和平均速度(mm/s)。 在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),將大鼠擦干放進(jìn)籠子里。 在7 d 低壓低氧環(huán)境暴露結(jié)束后,進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。 撤掉平臺(tái),將大鼠面向池壁,從第I 象限放入池中,跟蹤60 s。 記錄大鼠通過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù),原平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間(s),及游泳速度(mm/s)。

1.3.5 腦水含量測(cè)定

采用干濕重法測(cè)定大鼠大腦含水量。 每組隨機(jī)取6 只,處死,然后完整游離出兩個(gè)大腦半球,稱重記錄濕重。 然后在100℃電熱鼓風(fēng)烘箱中烘干24 h,測(cè)定干重。 腦含水量(%)的計(jì)算公式為:(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.6 蛋白印跡

在行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后,大鼠處死,然后完整游離海馬組織,置于-80℃?zhèn)溆谩?取部分海馬組織駕馭組織裂解液,研磨,12000 r/min×5 min 離心,取上清。 采用Bradford 法檢測(cè)相對(duì)蛋白濃度。 然后加入緩沖液,取50 μg 蛋白質(zhì)樣品采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。 然后用5%脫脂奶粉封閉,TBST 漂洗,加入兔抗 TLR-4 多克隆抗體(1 ∶500,Abcam,英國(guó)),兔抗 MyD88(1 ∶1000,Abcam,英國(guó)),兔抗 p-NF-κB p65 多克隆抗體(1 ∶2000,Abcam,英國(guó)),兔抗-IκB-α(1 ∶2000,Abcam,英國(guó))單克隆抗體,兔抗-AQP4 多克隆抗體(1 ∶2000,Abcam,英國(guó)),兔抗-MMP9-多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam,英國(guó))以及 β-actin 一抗(l:1000,Abcam,英國(guó))。 然后與膜在4℃孵育過夜。 再用辣根過氧化物酶結(jié)合山羊抗兔IgG 抗體(1 ∶500,Abcam,英國(guó))或辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗小鼠IgG抗體(1 ∶500,Abcam,英國(guó))二抗孵育膜,用含0.1%Tween 20(TBST)的Tris 緩沖鹽水洗三次后1 h。 使用凝膠成像和分析系統(tǒng)(Amersham 公司,美國(guó))捕獲和分析波段的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(ECL kit,Thermo Fisher Scientific,美國(guó))進(jìn)行曝光,拍照。 研究中采用Image J 軟件分析條帶,將目的條帶灰度值與內(nèi)參βactin 條帶灰度值比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3.7 腦組織病理染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后,每組取2 只大鼠,麻醉后,暴露心臟,在右心耳剪切一小口,依次用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)升主動(dòng)脈進(jìn)行灌注,清除組織中血液。 然后迅速游離大腦并置于4%多聚甲醛固定,經(jīng)100%、90%、70%分級(jí)乙醇脫水,二甲苯玻璃化,石蠟包埋,制成5 μm 厚的石蠟切片備用。 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,分級(jí)乙醇浸泡,蘇木精染色5 min,伊紅染色2 min,脫水。 在×400 放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)形態(tài)。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后采集血液2 mL,海馬30 mg。 應(yīng)用特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)血液及海馬組織中的白介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和IL-6 水平。 具體操作依照試劑盒中的說明執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()形式記錄。 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)、腦水含量及炎癥相關(guān)蛋白水平組間比較比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni多重檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通心絡(luò)干預(yù)及低壓低氧暴露對(duì)大鼠體重的影響

四組大鼠實(shí)驗(yàn)前體重比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),低壓低氧暴露7 d 后,四組大鼠組間比較體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 見表1。

表1 四組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重的變化(n=16, )Table 1 Body weight of rats in the four groups before and after the HH exposure

表1 四組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重的變化(n=16, )Table 1 Body weight of rats in the four groups before and after the HH exposure

注:C:對(duì)照組;TXL:1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)干預(yù);HH:低壓低氧組;HHTXL:低壓低氧+1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)組。 下同。Note. C, Control group. TXL, TXL treatment with the dose of 1.6 g/(kg·d). HH, Hypobaric hypoxia exposure. HH-TXL, Hypobaric hypoxia exposure and TXL treatment with the dose of 1.6 g/(kg·d). The same as below.

組別Groups適應(yīng)性飼養(yǎng)前(g)Before adaptive feeding適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后(g)Seven days after adaptive feeding低壓低氧暴露7 d 后(g)Seven days after hypobaric hypoxia exposure C 組 Group C 217±21 231±25 253±21 TXL 組 Group TXL 218±19 236±27 244±24 HH 組 Group HH 220±22 234±21 247±26 HH-TXL 組 Group HH-TXL 218±23 234±26 251±27

2.2 通心絡(luò)干預(yù)及低壓低氧暴露對(duì)大鼠一般行為的影響

低壓低氧暴露7 d 后,大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)其一般行為表現(xiàn)的變化。 四組間比較,低壓低氧暴露對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)的整體距離和中心區(qū)域停留時(shí)間無明顯影響(P>0.05)。 通心絡(luò)干預(yù)后,對(duì)正常組及低氧低氧組大鼠,均不影響曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中大鼠運(yùn)動(dòng)的整體距離和中心區(qū)域停留時(shí)間(P>0.05),見表2。

表2 四組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(n=10, )Table 2 Results of open field test in the four groups

表2 四組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(n=10, )Table 2 Results of open field test in the four groups

組別Groups運(yùn)動(dòng)總距離(cm)Total distance中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間(s)Time spent in the central area中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間百分比(%)Percentage of the time spent in the central area C 組 Group C 1243±57 11.3±2.4 3.8±0.7 TXL 組 Group TXL 1253±62 12.3±2.5 4.1±0.9 HH 組 Group HH 1287±106 11.7±2.3 3.9±0.8 HH-TXL 組 Group HH-TXL 1274±95 11.5±2.1 3.8±0.7

2.3 對(duì)大鼠空間記憶的影響

采用Morris 水迷宮(Morris water maze, MWM)測(cè)試評(píng)價(jià)大鼠海馬相關(guān)的空間記憶能力。 低壓低氧暴露前進(jìn)行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。 四組在同一時(shí)間點(diǎn)的逃避潛伏期比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 訓(xùn)練第5 天的潛伏期明顯短于第1 天時(shí)的潛伏期,提示通過訓(xùn)練大鼠行成記憶(P<0.05),見表3。

表3 四組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10, )Table 3 Results of navigation experiments in the MWM test of the rats

表3 四組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10, )Table 3 Results of navigation experiments in the MWM test of the rats

注:與 C 組相比,*P<0.05;HH-TXL 與 HH 組比較,#P<0.05;與 T1 時(shí)間點(diǎn)比較,△P<0.05。 下同。Note. Compared with group C,*P<0.05.Group HH-TXL compared with group HH,#P<0.05.Compared with the time of T1,△P<0.05. The same as below.

指標(biāo)Indicators組別Groups第1 天Day 1第2 天Day 2第3 天Day 3第4 天Day 4第5 天Day 5平均潛伏期(s)Average latency C 組 Group C 39.2±6.5 34.7±5.2 26.7±4.5△ 22.7±4.1△ 17.5±3.1△TXL 組 Group TXL 40.7±6.9 36.5±6.1△ 27.3±5.0△ 23.5±3.8△ 16.8±3.3△HH 組 Group HH 41.1±7.2 35.8±4.9△ 27.3±4.6△ 22.4±3.3△ 17.2±2.8△HH-TXL 組 Group HH-TXL 39.8±5.9 35.3±5.1△ 26.9±4.8△ 23.1±3.5△ 16.5±3.4△平均游泳速度(mm/s)Mean swimming speed C 組 Group C 139±27.7 141±34.3 142±28.6 143±30.5 144±27.8 TXL 組 Group TXL 143±26.3 143±27.9 144±33.3 143±29.1 145±31.5 HH 組 Group HH 142±28.6 145±31.2 146±35.1 145±31.2 146±34.3 HH-TXL 組 Group HH-TXL 142±27.5 145±29.5 145±30.7 146±33.1 144±28.7

在低壓低氧暴露結(jié)束后的空間探索實(shí)驗(yàn)中,與正常組比較,低壓低氧暴露可顯著減少大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間(P<0.05)。 而1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于低壓低氧組大鼠(P<0.05);但通心絡(luò)對(duì)正常組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)無明顯影響(P>0.05),見表4。

表4 四組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10, )Table 4 Results of probe trial in the MWM test of the rats

表4 四組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10, )Table 4 Results of probe trial in the MWM test of the rats

組別Groups原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)The time spent in the quadrant with the original platform經(jīng)過原平臺(tái)次數(shù)(次數(shù))Number of crossings (time)平均游泳速度(cm/s)Mean swimming speed C 組 Group C 36.5±6.6 5.3±1.2 143±26.8 TXL 組 Group TXL 37.1±7.1 5.1±0.8 145±31.2 HH 組 Group HH 19.7±4.1* 1.2±0.8* 143±29.7 HH-TXL 組 Group HH-TXL 28.1±4.8*# 3.3±0.9*# 147±27.3

2.4 對(duì)大鼠腦組織水腫的影響

與正常組比較,低壓低氧組大鼠腦水含量明顯升高,海馬組織水通道蛋白4(AQP4)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05);1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠腦水含量、海馬組織AQP4 及MMP-9 表達(dá)明顯低于低壓低氧組大鼠(P<0.05)。 而對(duì)正常組大鼠,通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠腦水含量、海馬組織 AQP4 及MMP-9 表達(dá)無明顯變化(P>0.05),見表5 及圖1。

圖1 Western blot 檢測(cè)大鼠海馬AQP4 及MMP-9 的表達(dá)Figure 1 Immunoblots of AQP4 and MMP-9 proteins in the hippocampus of the rats

表5 四組大鼠腦水含量及海馬組織AQP4 和MMP-9 蛋白的表達(dá)( )Table 5 The brain water content, and the expression of AQP4 and MMP-9 protein inhippocampus of the rats

表5 四組大鼠腦水含量及海馬組織AQP4 和MMP-9 蛋白的表達(dá)( )Table 5 The brain water content, and the expression of AQP4 and MMP-9 protein inhippocampus of the rats

C 組 Group C 77.5±2.4 55.6±6.4 39.7±4.4 TXL 組 Group TXL 77.8±2.9 56.4±5.2 40.3±5.5 HH 組 Group HH 86.6±3.1* 92.5±9.2* 96.8±8.3*HH-TXL 組 Group HH-TXL 81.8±2.6*# 69.7±6.5*# 71.4±5.6*#

病理染色提示,正常組及單純通心絡(luò)組海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊,邊界清晰,數(shù)量多,層次分明。 而低壓低氧組海馬區(qū)細(xì)胞稀疏,排列不規(guī)則,邊界模糊,細(xì)胞腫脹明顯。 通心絡(luò)干預(yù)后,神經(jīng)元數(shù)目層次增多,邊界相對(duì)清晰,見圖2。

圖2 大鼠海馬組織蘇木精-伊紅染色Note. C, Control group. TXL,TXL treatment with the dose of 1.6 g/(kg·d). HH,Hypobaric hypoxia exposure. HH-TXL,Hypobaric hypoxia exposure and TXL treatment with the dose of 1.6 g/(kg·d).Figure 2 Hematoxylin-eosinstaining of rat hippocampus

2.5 對(duì)大鼠海馬 TLR-4/MyD88/NF-κB p65 通路的影響

與正常組比較,低壓低氧組大鼠海馬組織TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),Iκ-Bα 的水平明顯降低(P<0.05);通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠海馬組織 Iκ-Bα 的水平明顯升高(P<0.05),TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 但是單純通心絡(luò)干預(yù)對(duì)TLR-4/MyD88/NF-κB p65 通路無明顯影響(P>0.05),見表 6 及圖3。

表6 四組大鼠海馬TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65 的表達(dá)(n=8, )Table 6 Expression of TLR-4、MyD88 and p-NF-κB p65 in hippocampus of rats

表6 四組大鼠海馬TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65 的表達(dá)(n=8, )Table 6 Expression of TLR-4、MyD88 and p-NF-κB p65 in hippocampus of rats

組別 Groups TLR-4(%) MyD88(%) p-NF-κB p6(%) Iκ-Bα(%)C 組 Group C 37.8±5.2 39.5±4.7 43.1±3.9 83.1±5.9 TXL 組 Group TXL 37.5±4.8 40.2±4.3 42.8±4.5 82.8±6.5 HH 組 Group HH 101.3±11.2* 112.7±8.8* 123.3±11.4* 23.3±3.4*HH-TXL 組 Group HH-TXL 74.4±7.8*# 79.3±5.8*# 85.6±6.7*# 58.6±6.7*#

圖3 Western blot 檢測(cè)大鼠海馬TLR-4、MyD88、NF-κB p65 和 IκB-α 的表達(dá)Figure 3 Immunoblots of TLR-4、MyD88、NF-κB p65 and IκB-α proteins in the hippocampus of the rats

2.6 對(duì)大鼠外周血及海馬炎癥因子水平的影響

與正常組比較,低壓低氧暴露后大鼠海馬及血清 IL-1β,TNF-α 及 IL-6 的 水 平 明 顯 升 高 (P<0.05);1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠血清及海馬組織的IL-1β, TNF-α 及IL-6 的水平較低壓低氧組明顯降低(P<0.05)。 單純通心絡(luò)干預(yù)對(duì)大鼠外周血及海馬炎癥因子水平無明顯影響(P>0.05),見表7。

表7 大鼠外周血及海馬組織IL-1β,TNF-α 和IL-6 的表達(dá)(n=8, )Table 7 Expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 in hippocampus and serum of rats

表7 大鼠外周血及海馬組織IL-1β,TNF-α 和IL-6 的表達(dá)(n=8, )Table 7 Expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 in hippocampus and serum of rats

樣本Sample指標(biāo)Indicators C 組Group C TXL 組Group TXL HH 組Group HH HH-TXL 組Group HH-TXL外周血(pg/mL)Blood IL-1β 52.3±4.5 53.4±5.2 90.4±7.2* 74.3±6.2*#TNF-α 76.4±5.3 77.8±6.2 122.5±9.2* 107.3±9.0*#IL-6 62.3±6.1 63.7±6.8 198.9±14.7* 155.3±10.6*#海馬(pg/mL)Hippocampus IL-1β 11.5±2.3 12.3±3.1 38.3±2.4* 27.3±3.1*#TNF-α 18.6±3.3 19.5±3.4 49.7±2.3* 33.5±3.6*#IL-6 22.2±3.8 23.4±4.4 66.3±3.5* 38.8±4.2*#

3 討論

隨著西部大開發(fā)的推進(jìn),越來越多的人因工作,旅游或其他原因暴露于高原環(huán)境下。 高原屬于低壓低氧環(huán)境,因而短期或長(zhǎng)期暴露會(huì)引起不同程度的高原反應(yīng)。 其中急性高原反應(yīng)是指在高原暴露后數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)發(fā)生高原缺氧而引起的一系列臨床綜合征,包括輕度高原反應(yīng)、急性腦水腫、急性肺水腫等[1-2];而高原腦水腫多屬于高原病的終末階段,患者表現(xiàn)為頭痛,惡心嘔吐,嚴(yán)重者可出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào),精神及認(rèn)知、意識(shí)的改變。 因而如何有效的緩解高原反應(yīng),降低高原病的發(fā)生,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究中將大鼠置于低壓低氧環(huán)境中7 d,作為急性高原暴露模型[3-5]。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,低壓低氧暴露7 d 后,腦水含量明顯增加,病理染色提示海馬區(qū)細(xì)胞腫脹,邊界模糊不清,細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 提示低壓低氧暴露7 d 后,出現(xiàn)了明顯的腦組織水腫,同時(shí)行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn),大鼠認(rèn)知功能明顯減退,這與既往研究結(jié)果相符。 早期研究同樣發(fā)現(xiàn)低壓缺氧暴露3 d、7 d 甚至14 d 后,大鼠出現(xiàn)明顯的腦組織水腫及認(rèn)知功能障礙[11]。 同時(shí)研究檢測(cè)了海馬組織AQP4 及MMP9 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)低壓低氧暴露后,海馬組織AQP4 及MMP-9 水平明顯升高。 AQP4 廣泛分布于腦組織膠質(zhì)細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞等,在維持腦水平衡,穩(wěn)定細(xì)胞微環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。 任何創(chuàng)傷,應(yīng)激,低氧均可以導(dǎo)致AQP4 的異常表達(dá),腦水腫發(fā)生[12]。 而 MMP-9 能夠有效降解細(xì)胞外基質(zhì),抑制血管基底膜蛋白表達(dá),導(dǎo)致血腦屏障受損[12]。 因此,進(jìn)一步證明低壓低氧暴露7 d 導(dǎo)致明顯的腦組織水腫。

對(duì)于高原導(dǎo)致的腦水腫如何有效的防治,目前尚無明確統(tǒng)一的定論。 前期有研究相繼報(bào)道了紅景天,七葉皂苷鈉等的保護(hù)作用。 同樣,通心絡(luò)也是中藥復(fù)方,由12 種中藥成分組成,在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛、心肌梗死、缺血性中風(fēng)等心腦血管疾病患者[13]。 多項(xiàng)研究表明,通心絡(luò)具有明顯的抗氧化、抗炎和抗血栓形成作用。 在腦缺血再灌注損傷模型等基礎(chǔ)研究中證實(shí)了通心絡(luò)可改善內(nèi)皮功能,減少細(xì)胞凋亡,保護(hù)血腦屏障[8,14]。但是該藥物是否能在急性低壓低氧暴露的大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚。 因而,本研究選擇通心絡(luò)作為干預(yù)方案。 研究顯示,與低壓低氧組相比,通心絡(luò)干預(yù)后,大鼠的空間參考記憶有明顯改善,同時(shí)海馬AQP4 及MMP-9 表達(dá)下降,腦含水量同樣明顯低于低壓低氧組。 以上結(jié)果提示,通心絡(luò)能夠有效緩解低壓低氧導(dǎo)致的腦組織水腫和認(rèn)知功能障礙。 另外,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,所有大鼠未發(fā)生通心絡(luò)的肝、腎毒性,也未發(fā)生不良反應(yīng)導(dǎo)致大鼠死亡,證明1.6 g/(kg·d)通心絡(luò)干預(yù)是安全可行的。

而對(duì)于高原腦水腫發(fā)生的分子機(jī)制尚未明確。近年來相繼有研究從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)的角度討論了急性高原腦水腫的發(fā)生機(jī)理[3-5]。 其中炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激是較為認(rèn)可的機(jī)制[5-6]。 早期研究報(bào)道急性低壓低氧暴露可促進(jìn)NK 細(xì)胞的激活,血清細(xì)胞因子(包括 IL-6、IL-1β 和CRP)濃度升高[15]。 本研究同樣發(fā)現(xiàn),急性低壓低氧暴露明顯上調(diào)海馬和血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平,提示低壓低氧急性暴露可導(dǎo)致顯著的外周及中樞炎癥反應(yīng)。 而在通心絡(luò)干預(yù)后,外周血及海馬組織 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的水平明顯下降,證明通心絡(luò)具有有效的抗炎作用。

目前已發(fā)現(xiàn)有多種信號(hào)通路參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控。 其中 Toll 樣受體(Toll like receptor,TLR)是一種天然免疫受體,廣泛分布于巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞等[16]。 TLR4 是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR 相關(guān)蛋白,其是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖應(yīng)答反映的主要受體[17]。 TLR-4 作為L(zhǎng)PS 的重要受體,通過MyD88 依賴的通路上調(diào)NF-κB 的表達(dá),激活炎癥介質(zhì)[18-19]。 MyD88 作為TLR-4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,可與 TLR-4 相互作用,激活 NF-κB。 同時(shí)反過來促進(jìn) IκB-α(NF-kappa-B 抑制劑 α)的磷酸化[20]。 IκB-α 與 REL 二聚體相互作用,抑制 NF-κB/REL 復(fù)合物參與炎癥反應(yīng)[20]。 磷酸化 NF-κB(p-NF-κB)可誘導(dǎo) IL-6、TNF-α 和 IL-1β 等細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。 在一項(xiàng)缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn),TLR4 突變小鼠進(jìn)行腦缺血再灌注損傷(I/R)造模時(shí),其神經(jīng)行為、腦水腫程度和促炎細(xì)胞因子分泌水平均有所緩解[17]。 同樣TLR-4 在應(yīng)激下的大腦氧化和炎癥損傷中發(fā)揮重要作用[18]。 因而本研究選擇TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路,探討通心絡(luò)可能的作用機(jī)制。 本研究發(fā)現(xiàn),低壓低氧暴露后,海馬組織中 TLR-4、MyD88 和 p-NF-κB 的表達(dá)明顯增加,而 IκB-α 表達(dá)水平明顯下降。 通心絡(luò)干預(yù)后,能夠明顯抑制低壓低氧誘導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB通路活化。 對(duì)于正常組大鼠,通心絡(luò)干預(yù)后對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)無明顯影響。 以上結(jié)果證實(shí)通心絡(luò)能夠有效抑制低壓低氧環(huán)境下TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的激活及海馬的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步降低腦水腫和認(rèn)知功能障礙的發(fā)生,發(fā)揮腦保護(hù)作用。

同時(shí),本研究也存在一定的局限性。 首先,本研究討論了通心絡(luò)干預(yù)對(duì)大鼠低壓低氧暴露7 d 時(shí)腦水腫及認(rèn)知功能的影響。 而低壓低氧環(huán)境中不同暴露時(shí)間(例如 第 3、7、14、21、28 天)下腦組織的變化情況尚未探討。 其次研究初步探討了通心絡(luò)的腦保護(hù)作用。 在后續(xù)的研究中,將進(jìn)一步探討不同劑量通心絡(luò)干預(yù)對(duì)腦功能的影響,提供更高質(zhì)量的證據(jù)。 另外,本研究初步從神經(jīng)炎癥角度探討了低壓低氧導(dǎo)致認(rèn)知障礙,腦水腫的可能機(jī)制,及通心絡(luò)發(fā)揮腦保護(hù)作用的抗炎機(jī)制。 但炎癥,血腦屏障,腦水腫這三部分之間如何相互作用還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述,低壓低氧可激活TLR4-MyD88-NF-κB 信號(hào)通路,引起外周及海馬炎癥,最終導(dǎo)致腦水腫及認(rèn)知障礙的發(fā)生;而通心絡(luò)干預(yù)可以有效抑制TLR4-MyD88-NF-κB 通路的活化,減輕外周和中樞炎癥反應(yīng),最終改善急性低壓低氧暴露導(dǎo)致的腦組織水腫及認(rèn)知障礙。