楊明鳳冉利梅*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,貴陽 550004; 2.黔南州婦幼保健院,貴州黔南 558000)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一種臨床綜合征,主要表現(xiàn)為腎功能快速下降[1]。 大量研究報告了不同研究人群和臨床環(huán)境中AKI 的發(fā)生率、風(fēng)險特征和轉(zhuǎn)歸[2-3]。 對于婦女而言,懷孕是一種獨特的狀態(tài), 在這種狀態(tài)下, 妊娠高血壓(pregnancy induced hypertension,PIH)引起的腎疾病可能會同時影響產(chǎn)婦和后代的腎健康。 AKI 是妊娠期間罕見但嚴(yán)重的并發(fā)癥,與不良結(jié)局的風(fēng)險增加息息相關(guān)[4],其病理生理基礎(chǔ)及其并發(fā)癥包括炎癥,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[5]。 姜黃(Curcumin,Cur)是一種傳統(tǒng)藥物,主要用于治療各種疾病,例如風(fēng)濕病,糖尿病性潰瘍,厭食癥,咳嗽和鼻竇炎[6]。 據(jù)報道,姜黃素抗炎,抗氧化,抗癌,和抗感染等[7-8]廣泛的治療作用。 姜黃素可以調(diào)節(jié)酶、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、受體、微核糖核酸、信號分子和活性氧,從而對炎癥和氧化應(yīng)激產(chǎn)生積極影響。 姜黃素可以鈍化炎癥分子的產(chǎn)生或作用并減輕腎病的進(jìn)程。 因此,本研究將以妊娠高血壓大鼠為模型,探討姜黃素對急性腎損傷的保護(hù)效果,并試圖闡明其分子機(jī)制,為妊娠高血壓急性腎損傷的藥物開發(fā)提供思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley 雄性大鼠(230~300 g,4 只)和雌性大鼠(210~280 g,36 只)(SPF 級)(8~10 周齡)購買自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(黔)2018-0001]。 所有動物均飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的動物房中[SYXK(黔)2018-0023],房間在22℃~25℃保持恒溫,并提供充足的食物和飲用水。 第2 天,進(jìn)行陰道涂片檢查精子。 觀察到許多精子細(xì)胞則表明發(fā)生成功性交。 發(fā)現(xiàn)精子的首日算為懷孕的第0 天。 本實驗總共選擇了32 只妊娠大鼠用于實驗。 動物實驗遵循3R 原則,并得到了貴州省人民醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)(IACUC-20180604-01)。 所有實驗程序均嚴(yán)格遵循國際疼痛研究協(xié)會的動物保護(hù)原則執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(西格瑪,美國圣路易斯);NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,西格瑪,美國圣路易斯);凋亡檢測試劑盒(Promega,Madison,WI);抗 TGF-β1(sigma,圣路易斯,密蘇里州);抗 p-Smad3 和抗Smad3(Cell Signaling Technology,Beverly,MA);抗GAPDH(SantaCruz Biotechnology);NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,西格瑪,美國圣路易斯)。

臨床自動生化分析儀7600(日立,日本);光學(xué)顯微鏡(Leica DM3000LED,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

選擇32 只懷孕的Sprague-Dawley 雌性大鼠,隨機(jī)均分為四組:正常組、姜黃素組、PIH 組和PIH+姜黃素組。 從妊娠第14 天開始,正常組和姜黃素組大鼠每天連續(xù)靜脈注射尾靜脈0.8 mL 生理鹽水,連續(xù)4 d,而PIH 組和PIH+姜黃素組大鼠則每天注射26 mol/L NG-硝基-L-精氨酸甲酯以誘導(dǎo)PIH 模型,連續(xù)4 d。 在懷孕的第14 和17 天,測量各組的收縮壓。 觀察到收縮壓增加30 mmHg 以上,則認(rèn)為成功建立了PIH 模型大鼠,并在第18 天選擇了該模型進(jìn)行干預(yù)治療。 姜黃素組和PIH+姜黃素組大鼠自第18 天起,喂食姜黃素204.8 mol/L(懸浮在2%CMC 中),持續(xù) 7 d[9]。

1.3.2 臨床自動生化分析儀檢測腎腎功能和氧化應(yīng)激水平

使用臨床自動生化分析儀7600 測量大鼠腎組織中的血尿素氮、肌酐、24 h 尿白蛋白排泄率和肌酐清除率。 使用Roche Diagnostics(曼海姆,德國)提供的套件檢測大鼠腎組織中丙二醛(malondialdehyde ,MDA)和一氧化氮(NO)水平。

1.3.3 組織病理學(xué)方法評估腎腎損傷

將腎組織固定在4%中性低聚甲醛溶液中,包埋石蠟,切成4 μm 切片,并用蘇木精-伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下(Leica DM3000LED,德國)檢查整個冠狀切片,并根據(jù)損傷程度根據(jù)腎受累百分比進(jìn)行分級。 使用以下參數(shù)對腎組織對應(yīng)的10 個區(qū)域的損傷定量進(jìn)行分級:腎小管細(xì)胞壞死,凋亡,胞質(zhì)液泡形成,出血和腎小管擴(kuò)張(1,組織病理學(xué)變化<10%;2,10%~25%;3,25%~50%;4,50%~75%;5,75%~100%)[10]。 計算每個大鼠的平均得分,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.4 免疫熒光染色法檢測caspase-3 的活化

在4%多聚甲醛中將3 μm 厚度的腎切片固定15 min,然后在室溫下用0.2% TritonX-100 的PBS透化5 min。 用2%驢血清封閉60 min 后,將玻片用抗裂解的 caspase-3(目錄號:9664,Cell Signaling Technology,Beverly,MA)的一抗進(jìn)行免疫染色。 然后將載玻片用 TRITC 綴合的第二抗體染色。 用Nikon Eclipse 80i Epifluorescence 顯微鏡觀察并拍照。 用Image J 進(jìn)行灰度值分析并統(tǒng)計。

1.3.5 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色檢測凋亡

通過使用凋亡檢測系統(tǒng)(Promega,Madison,WI)使用末端環(huán)氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記染色來確定凋亡細(xì)胞的死亡。 陽性細(xì)胞用FITC 標(biāo)記,記錄每個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法分析TGF-β1 和p-Smad3的表達(dá)和分布

將4 μm 石蠟包埋切片去石蠟并在檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 6.0)中加熱;然后將切片置于3%過氧化氫中,并與TGF-β1 和p-Smad3 的一級抗體(1 ∶200;Cell Signaling Technology) 在 4℃ 孵育過夜。 將切片與相應(yīng)的二抗在37℃下孵育30 min。使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色,并用蘇木精復(fù)染色核。 用 Nikon Eclipse 80i Epifluorescence 顯微鏡觀察并拍照。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測 TGF-β1、p-Smad3 和Smad3 的表達(dá)

將腎組織用含有1% NP40、0.1% SDS,100 mg/mL PMSF,1%蛋白酶抑制劑混合物以及1%磷酸酶I和II 抑制劑混合物(Sigma,圣路易斯,密蘇里州)的RIPA 溶 液 溶 解。 在 4℃ 下 以 13000 r/min 離 心30 min后收集上清液。 通過二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。 將等量的蛋白質(zhì)上樣到10%或15% SDS-PAGE 中,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。 一抗如下:抗 TGF-β1(Sigma,圣路易斯,密蘇里州), 抗 p-Smad3 和 抗 Smad3 ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA), 抗 GAPDH (SantaCruz Biotechnology)。 視野 National Health Institute 圖像軟件包測量信號強(qiáng)度,并進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對妊娠高血壓大鼠的腎功能的影響

如圖1 所示,與正常對照組和姜黃素組相比,PIH 組大鼠的血肌酐、尿素氮和尿白蛋白/肌酐比顯著升高(P<0.001),肌酐清除率則顯著下降(P<0.001)。 姜黃素治療可以使血肌酐、尿白蛋白/肌酐比顯著回落(P<0.01),而肌酐清除率則有效改善(P<0.01)。 這些結(jié)果表明姜黃素可以改善妊娠高血壓大鼠的腎功能損傷。

圖1 不同組大鼠的腎功能變化( ,n=8)Note. A, Blood creatinine. B, Blood urea nitrogen. C, Urinary albumin/creatinine ratio. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01.Figure 1 Renal function changes in different groups of rats

2.2 姜黃素對PIH 大鼠腎小管的組織病理學(xué)的影響

與正常對照組和姜黃素組的腎組織相比,PIH組大鼠腎腎小管顯著擴(kuò)張,腫脹,管腔充血和核固縮,甚至部分區(qū)域發(fā)生變性,姜黃素治療可以有效減輕上述變化(圖2A)。 與組織學(xué)觀察相一致,在用姜黃素治療的大鼠組織病理學(xué)損傷的總評分顯著降低(P<0.01)(圖2B)。

圖2 組織病理學(xué)水平觀察各組大鼠腎損傷( ,n=8)Note. A, Hematoxylin-eosin stained kidney section. B, Histopathological scores of rats in each group. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01.Figure 2 Histopathological observation of kidney injury in each group

2.3 姜黃素對PIH 大鼠腎中的腎小管細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

腎小管細(xì)胞凋亡是PIH 誘導(dǎo)的急性腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 在這項研究中,我們通過TUNEL 染色法和cleaved caspase-3 免疫染色來觀察腎小管細(xì)胞的凋亡水平。 如圖3A~3C 所示,在對照或姜黃素組的大鼠的腎組織中,幾乎沒有檢測到凋亡細(xì)胞,cleaved caspase-3 染色也是陰性的。 但是,PIH 誘導(dǎo)的AKI 大鼠腎中, TUNEL 染色陽性和 cleaved caspase-3 免疫染色陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,而姜黃素治療后,細(xì)胞凋亡顯著減少(P<0.01)。 為了評估姜黃素在PIH 大鼠腎氧化應(yīng)激中的作用,我們在腎組織中檢測了MDA 和NO 的水平。 如圖3D~3E所示,與 PIH 組相比,PIH+Cur 組的 MDA 和 NO含量均顯著下降(P<0. 01)。 這些結(jié)果,表明姜黃素可以減輕妊娠高血壓誘導(dǎo)的大鼠腎小管細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

圖3 姜黃素可以減少PIH 大鼠腎中的腎小管細(xì)胞凋亡并減輕氧化應(yīng)激水平( ,n=8)Note. A, Representative pictures of TUNEL staining and immunostaining images of lysed caspase3 of rats in each group. B, Quantitative analysis of the number of TUNEL staining positive cells in each group of rats. C, Quantitative analysis of the number of clear-caspase 3 staining positive cells in each group of rats. D,The content of MDA in the kidneys of rats in each group. E,NO content in the kidneys of rats in each group. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,#P <0.05,##P <0.01.Figure 3 Curcumin can reduce renal tubular cell apoptosis and reduce the level of oxidative stress in PIH rat kidneys

2.4 姜黃素對PIH 大鼠腎中TGF-β1 和p-Smad3的影響

如圖4 所示,與正常對照和姜黃素組相比,PIH組的TGF-β1 和p-Smad3 的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。 而姜黃素治療組的 TGF-β1 和 p-Smad3 的水平顯著降低(P<0.01),同時,蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示,姜黃素治療后,大鼠腎Smad3 的表達(dá)并沒有顯著改變。 以上結(jié)果表明,用姜黃素治療可顯著逆轉(zhuǎn) PIH 大鼠腎中 TGF-β1 和 Smad3 的表達(dá)水平。

圖4 姜黃素對PIH 大鼠腎轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和smad3 表達(dá)和分布的影響( ,n=8)Note. A, Immunohistochemical staining was used to observe the expression and distribution of TGF-β1 and p-smad3 in rat kidney slices. B,Western blot was used to detect the expression levels of TGF-β1,p-smad3 and smad3 in rat kidney. C,Analysis of relative gray value of TGF-β1. D, The ratio of p-smad3/smad3. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01. TGF-β1:Transforming growth factor-β1.Figure 4 Effect of curcumin on the expression and distribution of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and smad3 in PIH rats kidney

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn),PIH 大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h 尿白蛋白排泄率顯著增加,而肌酐清除率則顯著下降,同時,PIH 誘導(dǎo)的AKI 導(dǎo)致大鼠腎組織學(xué)改變,包括腎小管顯著擴(kuò)張,腫脹,管腔充血和核固縮,甚至部分區(qū)域發(fā)生變性,這種腎損傷同時伴隨氧化應(yīng)激相關(guān)分子水平和腎小管上皮細(xì)胞凋亡率上升,并進(jìn)一步加劇了腎損傷。 值得注意的是,應(yīng)用姜黃素治療后,大鼠的腎功各項指標(biāo)均有所回落,組織學(xué)損傷減輕,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平也均顯著下降,這表明,姜黃素可以有效保護(hù)妊娠高血壓大鼠的急性腎損傷。

到目前為止,妊娠高血壓引起的急性腎損傷損傷的具體機(jī)理尚未完全闡明。 研究表明,PIH 引起的急性腎損傷的主要原因是腎氧自由基的增加,細(xì)胞內(nèi)鈣超載,能量代謝紊亂和激素分泌紊亂。 在這種復(fù)雜的病理生理過程中,氧化應(yīng)激相關(guān)分子對腎組織的損害 AKI 的主要病原體之一[11]。 MDA 和NO 水平是氧化應(yīng)激的兩個主要指標(biāo)[12]。 在我們的研究中發(fā)現(xiàn),PIH 大鼠腎組織中MDA 和NO 升高,這表明存在氧化應(yīng)激損傷。 同時,姜黃素可以通過抑制cleaved caspase-3 的活化來抑制凋亡,這進(jìn)一步證實了姜黃素的抗凋亡作用。 炎癥促進(jìn)進(jìn)行性腎損傷,并且TGF-β1 被認(rèn)為是腎損傷進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)。 我們的結(jié)果表明,PIH 組中 TGF-β1 表達(dá)顯著上調(diào),但應(yīng)用了姜黃素后其表達(dá)會顯著下降。 因此,我們研究了Smad3 的磷酸化,發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著降低了Smad3 的磷酸化。 因此,姜黃素的腎保護(hù)作用與TGF-β1 信號通路的下調(diào)有關(guān)。 綜上所述,我們的研究表明,姜黃素可顯著改善PIH 引發(fā)的急性腎損傷,這是通過抑制TGF-β1 信號通路來實現(xiàn)的,由于姜黃素具有抗氧化和凋亡的作用,可以為臨床藥物開發(fā)提供參考。