陳 姣，王繼森，鄧晶晶，朱宗萍，廖 婉*，陳 意，楊青松，王 琳，傅超美，朱雅寧, 3*

基于量質(zhì)傳遞及化學(xué)計(jì)量學(xué)的藥食同源名方青龍白虎湯質(zhì)量控制研究

陳 姣1，王繼森2#，鄧晶晶1，朱宗萍1，廖 婉1*，陳 意1，楊青松1，王 琳1，傅超美1，朱雅寧1, 3*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610045 3. 雅安三九藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000

建立HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，探尋青龍白虎湯凍干粉制備過(guò)程工藝和量質(zhì)傳遞規(guī)律，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)構(gòu)建其質(zhì)量控制體系。制備15批次青龍白虎湯凍干粉，采用HPLC法建立指紋圖譜，色譜結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》（2012版）并計(jì)算各部分相似度。測(cè)定15批樣品量質(zhì)傳遞過(guò)程中沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素和鞣花酸的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率和出膏率。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析，以挖掘不同產(chǎn)地樣品間對(duì)質(zhì)量控制具有顯著貢獻(xiàn)的主要成分。15批樣品指紋圖譜相似度均大于0.9，滿足規(guī)定要求，并標(biāo)定凍干粉指紋圖譜24個(gè)共有峰，對(duì)其中6種成分進(jìn)行了指認(rèn)，分別為沒食子酸（1號(hào)峰）、原兒茶酸（4號(hào)峰）、綠原酸（8號(hào)峰）、表兒茶素（14號(hào)峰）、東莨菪內(nèi)酯（19號(hào)峰）、鞣花酸（23號(hào)峰）。15批凍干粉表兒茶素、沒食子酸、鞣花酸、綠原酸、原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.724%～1.301%、2.184%～2.840%、0.607%～0.760%、0.061%～0.141%、0.017%～0.079%，轉(zhuǎn)移率分別為78.60%～89.38%、76.98%～89.88%、76.00%～89.78%、76.90%～90.49%、80.02%～90.25%，出膏率為12.87%～15.11%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)，表明煎煮、濃縮和凍干過(guò)程有效成分轉(zhuǎn)移率較穩(wěn)定。通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，找到10個(gè)對(duì)模型貢獻(xiàn)較大的成分，其中包括指認(rèn)的峰14 （VIP＝2.812）、峰1（VIP＝2.804）、峰23（VIP＝2.715）、峰8（VIP＝1.053）和峰4（VIP＝0.887），可進(jìn)一步深化青龍白虎湯質(zhì)量控制研究。通過(guò)HPLC指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測(cè)定，首次建立了藥食同源名方青龍白虎湯的質(zhì)量控制方法，此方法快速簡(jiǎn)單可行，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，能同時(shí)適用于飲片、煎煮液、濃縮液和凍干粉量質(zhì)傳遞規(guī)律的相關(guān)性考察；進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)為青龍白虎湯的質(zhì)量控制研究提供了重要參考。

青龍白虎湯；量質(zhì)傳遞；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；沒食子酸；原兒茶酸；綠原酸；表兒茶素；鞣花酸；質(zhì)量控制

青龍白虎湯（Qinglong Baihu Decoction，QBD）出自清代著名醫(yī)家王孟英《王氏醫(yī)案》卷二，全方兩味。方中青果為主藥，具清熱解毒、利咽生津之效[1-3]；萊菔又名白蘿卜，被譽(yù)為“蔬中圣品”，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素和藥用價(jià)值，能消食下氣、利尿化痰[4-6]、健脾寬中、清熱解毒，對(duì)于肺熱痰火、咳喘痰多、食停不化、脘腹脹滿等有很好的療效。此方為藥食兩用方，高度契合中醫(yī)藥學(xué)自古就有的“藥食同源”理論精髓，集預(yù)防、保健與治療等多種應(yīng)用價(jià)值于一身，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥的傳統(tǒng)特色，其以“藥極簡(jiǎn)易，性最平和，味不惡劣，易粉易服”等諸多優(yōu)勢(shì)而備受青睞。青果色青，萊菔色白，合而為劑，可消經(jīng)絡(luò)留滯之痰，解膏粱魚面之毒，喉病之可免[7]。本方最大特點(diǎn)為善于清熱利咽，主治熱毒內(nèi)盛、上灼咽喉、津液損傷所致咽喉腫痛，是預(yù)防及治療呼吸道疾病的藥食同源上佳良方。

中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)欠完善、質(zhì)量追溯性和均一性較差等問題一直是亟待解決的技術(shù)瓶頸，已成為行業(yè)發(fā)展的重中之重[8]。中藥復(fù)方質(zhì)量易受其組成藥味多基原、多品種、多產(chǎn)地、藥材來(lái)源不穩(wěn)定、多成分及相互作用復(fù)雜等因素影響，影響其質(zhì)量一致性，不利于有效控制療效的穩(wěn)定[9-12]。課題組前期圍繞QBD，已完成青龍白虎飲及利咽含片的研究，并初步建立相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系[13-14]。但QBD中的化學(xué)成分群在煎煮、濃縮、干燥過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化亟待進(jìn)一步研究，以綜合、全面的對(duì)QBD進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，本實(shí)驗(yàn)采用15批青果飲片和市售新鮮萊菔，首次以古籍記載的煎煮方法為參考依據(jù)進(jìn)行QBD的煎煮-濃縮-干燥工藝研究，以有效成分轉(zhuǎn)移率、出膏率等為質(zhì)控指標(biāo)，運(yùn)用化學(xué)指紋圖譜分析技術(shù)和多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，初步構(gòu)建QBD全過(guò)程質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系，再結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段分析QBD內(nèi)在影響因素，探尋QBD質(zhì)控影響關(guān)鍵成分，系統(tǒng)的、全方位的對(duì)工藝全過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)分析，探尋其量質(zhì)傳遞規(guī)律，以期為后續(xù)相關(guān)制劑的研究研發(fā)提供可靠的技術(shù)保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；色譜柱Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和色譜柱AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），賽默飛世而科技（中國(guó)）有限公司；UPK-I-10T型純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；AR224CN電子天平，萬(wàn)分之一，奧豪斯儀器（常州）有限公司；CPA225D型十萬(wàn)分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FTS-10A全自動(dòng)煎藥壺，潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DL-720D數(shù)控超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；色譜純磷酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司；水為超純水，自制，其它試劑均為分析純；對(duì)照品沒食子酸（CAS號(hào)149-91-7，批號(hào)wkq20010905）、原兒茶酸（CAS號(hào)99-50-3，批號(hào)wkq20020706）、綠原酸（CAS號(hào)327-97-9，批號(hào)wkq20042702）、表兒茶素（CAS號(hào)490-46-0，批號(hào)wkq20012203）、東莨菪內(nèi)酯（CAS號(hào)92-61-5，批號(hào)wkq20011001）、鞣花酸（CAS號(hào)476-66-4，批號(hào)wkq20011002），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，均購(gòu)自成都省維克奇生物科技有限公司。15批青果藥材分別購(gòu)于四川省合江縣、四川省廣安市、廣東省廣州市和福建省閩侯縣，包含道地藥材產(chǎn)地及主產(chǎn)區(qū)，均于秋季采收，保證了樣品的均一性和代表性，并根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定儲(chǔ)存于干燥處，防蛀，飲片具體信息見表1。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本中心蔣桂華教授鑒定為橄欖科橄欖屬植物橄欖Raeusch.的干燥成熟果實(shí)，藥材經(jīng)炮制得到15批青果飲片，經(jīng)檢驗(yàn)藥材和飲片均符合《中國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定[1]；萊菔市售，產(chǎn)于溫江無(wú)公害蔬菜基地農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)標(biāo)本中心蔣桂華教授定其基原為十字花科植物萊菔L.的新鮮根莖。

表1 15批青果飲片產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 QBD凍干粉的制備

結(jié)合QBD相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]參考其制備工藝參數(shù)，并通過(guò)單因素考察確定QBD最佳工藝為青果與萊菔比例為1∶1，6倍量水提取2次，每次60 min。稱取青果飲片60 g加水浸泡30 min，然后加入切制小塊的新鮮萊菔60 g，6倍量水（720 mL）煎煮2次，每次1 h，合并2次QBD煎煮液得1200 mL。取煎煮液1200 mL減壓濃縮至約150 mL，得濃縮液；對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得QBD凍干粉。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、東莨菪內(nèi)酯、鞣花酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成分別含沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、東莨菪內(nèi)酯、鞣花酸0.943、0.757、1.025、1.160、1.080、1.032 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液I，再各量取0.5 mL到5 mL量瓶中混勻，用甲醇稀釋定容，得到混合對(duì)照品儲(chǔ)備液II。

2.2.2 供試品溶液的制備

（1）單味飲片樣品供試品溶液：按照“2.1”項(xiàng)下煎煮液制備方法，分別制備青果、萊菔的單煎樣品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

（2）QBD煎煮液供試品溶液：取“2.1”項(xiàng)下所制備的QBD煎煮液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

（3）QBD濃縮液供試品溶液：精密量取“2.1”項(xiàng)下所制備的QBD濃縮液2 mL置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（4）QBD凍干粉供試品溶液：取“2.1”項(xiàng)下所制備的QBD凍干粉約0.2 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）10 min使溶解，取出，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜分析

2.3.1 色譜條件 AcclaimTM120 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相（流動(dòng)相每天新鮮制備，通過(guò)0.45 μm濾膜，注射到色譜柱之前進(jìn)行超聲脫氣），梯度洗脫：0～25 min，5%～12%乙腈；25～50 min，12%～15.4%乙腈；50～75 min，15.4%～22.5%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算不低于5000。

2.3.2 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：取QBD凍干粉供試品溶液（S1），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以表兒茶素為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012. 130723版）評(píng)價(jià)，6次進(jìn)樣的相似度均為1.00，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：按“2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份QBD凍干粉供試品溶液（S1），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以表兒茶素為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜2.5%，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012.130723版）評(píng)價(jià)，6次進(jìn)樣的相似度均為1.00，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取QBD凍干粉供試品溶液（S1），分別于0、2、4、8、12、24、48 h按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以表兒茶素為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.5%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012.130723版）評(píng)價(jià)，7次進(jìn)樣的相似度均為1.00，表明青果供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜要求。

2.3.3 化學(xué)指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)與分析 根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)15批青果飲片及QBD煎煮液、濃縮液和凍干粉的供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄各樣品色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012.130723版）對(duì)記錄的色譜圖進(jìn)行分析。以S1號(hào)樣品的特征圖譜作為參照譜進(jìn)行指紋匹配（中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1 min），確定了24個(gè)共有峰。15批青果飲片及QBD煎煮液、濃縮液和凍干粉指紋圖譜見圖1；進(jìn)行相似度計(jì)算，15批供試品的相似度均≥0.9，表明各批樣品的相似度較好，化學(xué)成分穩(wěn)定，結(jié)果見表2；選取分離度較好的表兒茶素色譜峰（14號(hào)峰）作為參照峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表3。

2.3.4 色譜峰的化學(xué)成分指認(rèn)及歸屬 通過(guò)與對(duì)照品位置比較，指認(rèn)了其中6個(gè)共有峰，分別為沒食子酸（1號(hào)峰）、原兒茶酸（4號(hào)峰）、綠原酸（8號(hào)峰）、表兒茶素（14號(hào)峰）、東莨菪內(nèi)酯（19號(hào)峰）、鞣花酸（23號(hào)峰）。24個(gè)共有峰中，其中6號(hào)峰歸屬于萊菔，其余23個(gè)峰歸屬于青果飲片，占青果飲片總峰面積83.69%，占凍干粉總峰面積73.07%。結(jié)果表明，QBD凍干粉的主要物質(zhì)群均可清晰地追溯到飲片，歸屬明確。

2.4 QBD凍干粉制備過(guò)程中有效成分的含量及出膏率的測(cè)定

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件。

2.4.2 方法學(xué)考察[12]

（1）專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取以上制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液II、凍干粉供試品溶液（S1）、萊菔單煎樣品溶液、青果單煎樣品溶液（S1）、甲醇空白溶劑各10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果供試品色譜中，在與沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、東莨菪內(nèi)酯、鞣花酸混合對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，甲醇空白樣品色譜上沒有相應(yīng)峰，結(jié)果表明樣品溶液中各成分分離度（＞1.5）和理論板數(shù)（＞5000）均較好，且陰性無(wú)干擾，見圖2。

（2）線性關(guān)系考察：取以上原兒茶酸、綠原酸儲(chǔ)備液I各0.2 mL，表兒茶素儲(chǔ)備液I 2 mL，鞣花酸儲(chǔ)備液I 1 mL定容到5 mL，四者配成混合對(duì)照品溶液III進(jìn)行線性考察；取以上沒食子酸儲(chǔ)備液I 3 mL定容到5 mL配成沒食子酸對(duì)照品溶液IV進(jìn)行線性考察?；旌蠈?duì)照品溶液III和沒食子酸對(duì)照品溶液IV分別稀釋0、2、4、8、16、32、64倍后，注入液相色譜儀，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各成分對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：沒食子酸＝0.162 2＋1.667 1，2＝0.999 1，線性范圍8.841～565.8 μg/mL；原兒茶酸＝0.237 8＋0.029 2，2＝1.000 0，線性范圍 0.473 1～30.28 μg/mL；綠原酸＝0.298 6＋ 0.001 8，2＝1.000 0，線性范圍0.640 6～41.00 μg/mL；表兒茶素＝0.291 7＋0.989 1，2＝ 0.999 9，線性范圍7.250～464.0 μg/mL；鞣花酸＝0.978 4－2.100 3，2＝0.999 4，線性范圍3.225～206.4 μg/mL；結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 15批(S1～S15)青果飲片 (A)、QBD煎煮液 (B)、QBD濃縮液 (C) 和QBD凍干粉 (D) 的HPLC指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜(AR、BR、CR、DR)

表2 15批青果飲片、QBD煎煮液、QBD濃縮液和QBD凍干粉與各自對(duì)照指紋圖譜的相似度

表3 QBD各單味藥、煎煮液、濃縮液和凍干粉特征峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積

1-沒食子酸 4-原兒茶酸 8-綠原酸 14-表兒茶素 19-東莨菪內(nèi)酯 23-鞣花酸

（3）精密度試驗(yàn)：取同一QBD凍干粉供試品溶液（S1），按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各成分色譜峰面積的RSD。計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.1%、1.37%、0.98%、0.31%、0.38%，表明儀器精密度良好。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)：按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份QBD凍干粉供試品溶液（S1），按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，依次進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.78%、0.89%、1.32%、0.74%、1.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一QBD凍干粉供試品溶液（S1），分別于制備后0、2、4、8、12、24、48 h按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各成分色譜峰面積的RSD。沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.73%、0.85%、1.02%、1.12%、0.40%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的QBD凍干粉0.2 g，平行6份，每份都分別加入對(duì)照品沒食子酸2.828 mg、原兒茶酸0.046 mg、綠原酸0.017 3 mg、表兒茶素1.080 mg、鞣花酸0.801 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備各供試品溶液（S1），進(jìn)樣量10 μL注入液相色譜儀，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算各指標(biāo)成分的實(shí)際測(cè)得量和回收率，再計(jì)算各指標(biāo)成分的平均加樣回收率。結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸峰面積的平均加樣回收率分別為99.5%、96.1%、97.0%、97.7%、99.4%，RSD分別為0.25%、0.49%、0.62%、0.62%、0.71%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.3 含量測(cè)定[16-18]取15批QBD樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行指標(biāo)成分含量測(cè)定。以QBD凍干粉制備過(guò)程穩(wěn)定性成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸的得率及轉(zhuǎn)移率，得率＝總體樣品（指煎煮液、濃縮液和凍干粉）中指標(biāo)成分質(zhì)量/飲片投料量，轉(zhuǎn)移率＝總體樣品（指煎煮液、濃縮液和凍干粉）中指標(biāo)成分質(zhì)量/總體飲片中指標(biāo)成分質(zhì)量，結(jié)果見表4～6。結(jié)果顯示，15批青果飲片沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.78、0.033、0.039 1、1.23、0.949 mg/g，RSD分別為18.18%、21.71%、14.81%、12.11%、25.83%。15批凍干粉中沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.184%～2.84%、0.017%～0.079%、0.061%～0.141%、0.724%～1.301%、0.607%～0.760%，以沒食子酸、表兒茶素、鞣花酸等成分含量較高。

表4 15批青果飲片、QBD煎煮液、QBD濃縮液和QBD凍干粉中有效成分含量

煎煮液、濃縮液和凍干粉中，沒食子酸平均得率分別為0.327%、0.322%、0.320%；原兒茶酸平均得率分別為0.002 93%、0.002 86%、0.002 84%，綠原酸平均得率分別為0.003 38%、0.003 35%、0.003 31%，表兒茶素平均得率分別為0.107%、0.105%、0.104%，鞣花酸平均得率分別為0.081 6%、0.076 2%、0.079 9%。沒食子酸平均轉(zhuǎn)移率分別為86.35%、85.15%、84.60%，RSD分別為4.94%、5.14%、4.95%；原兒茶酸平均轉(zhuǎn)移率分別為87.81%、86.24%、85.63%，RSD分別為3.09%、3.97%、3.87%；綠原酸平均轉(zhuǎn)移率分別為86.45%、85.52%、84.47%，RSD分別為4.64%、4.45%、4.19%；表兒茶素平均轉(zhuǎn)移率分別為86.55%、85.63%、84.10%，RSD分別為3.99%、3.69%、4.54%；鞣花酸平均轉(zhuǎn)移率分別為85.89%、85.10%、84.10%，RSD分別為4.80%、4.51%、4.54%。

表5 15批QBD煎煮液、濃縮液和凍干粉中有效成分得率

表6 QBD凍干粉制備過(guò)程中有效成分轉(zhuǎn)移率及出膏率

2.4.4 出膏率的測(cè)定[10]測(cè)定15批凍干粉的出膏率（出膏率＝凍干粉干膏質(zhì)量/飲片投料量），結(jié)果見表6。15批凍干粉平均出膏率為13.77%，RSD為4.64%，未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)，說(shuō)明該制備工藝較合理，未造成明顯的批間差異。

2.5 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的QBD質(zhì)量分析

2.5.1 主成分分析（principal component analysis，PCA）[19-22]將15批樣品峰面積信息經(jīng)Z-Score標(biāo)準(zhǔn)化后獲得的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，進(jìn)行PCA。15個(gè)樣品的二維PCA得分圖見圖3，從PCA得分圖可以清楚地看出，15批樣品被分成了3類，S1～S8屬于四川產(chǎn)地，S9～S12屬于福建產(chǎn)地，S13～S15屬于廣東產(chǎn)地。PCA結(jié)果駁斥了指紋圖譜的高相似性，縱然指紋圖譜顯示15批次樣品的相似度很高，但是它們?nèi)耘f被分成了3類。此外，分成的3類正好和樣品的產(chǎn)地有著密不可分的關(guān)系，而同一產(chǎn)地幾個(gè)批次的樣品都很好的聚集在一起，說(shuō)明產(chǎn)地影響著這些樣品的質(zhì)量。

2.5.2 聚類分析[19,23-24]從PCA評(píng)分圖來(lái)看，不同產(chǎn)地樣品是有差異的。聚類分析被用來(lái)再次驗(yàn)證這一結(jié)果，因?yàn)榫垲惙治鎏峁┝瞬煌a(chǎn)地樣品之間的相似性和變化的明確度量，顯示了復(fù)雜的數(shù)據(jù)相互關(guān)系。將不同產(chǎn)地的15批凍干粉指紋圖譜數(shù)據(jù)中的24個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果見圖4，以縱軸為參考依據(jù)，左邊3批樣品在數(shù)值小于1的時(shí)候已經(jīng)聚攏，中間幾批樣品在數(shù)值約等于1的時(shí)候聚攏，右邊幾批樣品在數(shù)值明顯大于1的時(shí)候才聚攏，表明不同產(chǎn)地樣品屬不同類別，飲片的產(chǎn)地歸屬和內(nèi)在質(zhì)量差異有待進(jìn)一步考察分析。

圖3 15批QBD凍干粉PCA評(píng)分圖

圖4 15批QBD凍干粉聚類分析

2.5.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）[25-27]采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進(jìn)行建模分析，篩選出對(duì)上述樣本分類貢獻(xiàn)較大的成分，為了確定每個(gè)變量對(duì)于辨別和獲得化學(xué)標(biāo)記的重要性，以變量重要性投影值（variable importance in project，VIP，即該變量對(duì)整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平）為有意義變量進(jìn)行搜尋。VIP＞1.0通常被用作衡量某個(gè)成分對(duì)差異的貢獻(xiàn)的共同閾值[28]。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)VIP＞1的有9個(gè)峰，按照VIP值大小依次為峰14（表兒茶素）、1（沒食子酸）、23（鞣花酸）、9、16、24、22、8（綠原酸）、21，見圖5。同時(shí)峰4（原兒茶酸）的VIP值接近1（VIP＝0.887），說(shuō)明表兒茶素、沒食子酸、鞣花酸、綠原酸和原兒茶酸是影響樣品的主要成分，將這5種成分作為指導(dǎo)QBD湯劑凍干粉的定量質(zhì)控指標(biāo)。

圖5 24個(gè)共有峰的VIP值

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)綜合考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-水4種流動(dòng)相、波長(zhǎng)（214、237、254、273、280、306 nm）、柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.8、1.0 mL/min）以及色譜柱（Thermo Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等因素，結(jié)果表明在流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、波長(zhǎng)237 nm、柱溫30 ℃、體積流量為1.0 mL/min、色譜柱為AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等條件下色譜峰峰形、分離度及出峰數(shù)量等較優(yōu)，同時(shí)色譜圖基線更平穩(wěn)，各峰之間的比例比較協(xié)調(diào)，直觀效果較好。在綜合考察峰形、基線等多項(xiàng)干擾因素下，確定此色譜條件進(jìn)行指紋圖譜及含測(cè)相關(guān)研究。

3.2 指標(biāo)成分的確定

QBD組方精簡(jiǎn)，方中以青果中的酚類成分含量最高，為其主要藥效成分，天然硫苷是萊菔中的主要特征性化學(xué)成分[29]。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)查閱[30-33]，參照《中國(guó)藥典》2020年版[1]中對(duì)青果飲片明確規(guī)定的沒食子酸指標(biāo)成分，并采用化學(xué)指紋圖譜與多成分含量測(cè)定相結(jié)合進(jìn)一步確定該方與藥效相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵成分。因方中青果為歷版藥典收載中藥，萊菔為人們經(jīng)常食用的蔬菜，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)全方的質(zhì)量控制研究側(cè)重在青果。青果中的多酚類成分如沒食子酸、綠原酸、原兒茶酸、表兒茶素和鞣花酸是發(fā)揮清熱解毒、利咽、抗氧化的主要成分[34-36]，沒食子酸還為主要抗菌活性成分[34]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立HPLC指紋圖譜，從定性和定量2個(gè)層面對(duì)QBD進(jìn)行質(zhì)量控制，在定量指標(biāo)成分選擇方面，由于后期發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯峰型不太好且在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中含量極微不好進(jìn)行定量研究。綜合分析，選擇含量相對(duì)較高的主要藥效成分沒食子酸、綠原酸、原兒茶酸、表兒茶素和鞣花酸作為QBD凍干粉的含測(cè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)凍干粉批次間的一致性，有利于控制其質(zhì)量穩(wěn)定性。

此外，研究發(fā)現(xiàn)即使經(jīng)過(guò)初步篩選并優(yōu)化QBD梯度洗脫條件，色譜圖中也只顯示出萊菔中的唯一特征峰。課題組接下來(lái)將通過(guò)解吸電噴霧電離-離子化質(zhì)譜成像技術(shù)（desorption electrospray ionization- mass spectrometry imaging，DESI-MSI）[37]、紫外-可見分光光度法等對(duì)HPLC未能檢測(cè)的未知成分如青果萊菔合煎后產(chǎn)生的新物質(zhì)及萊菔中的天然硫苷類成分等進(jìn)行分析鑒定，以更全面控制QBD凍干粉的質(zhì)量。

3.3 檢測(cè)結(jié)果分析

指紋圖譜結(jié)果表明，飲片、煎煮液、濃縮液和凍干粉的相似度均大于0.9，一致性良好。QBD凍干粉指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為沒食子酸0.239%～0.435%、原兒茶酸0.002 31%～0.004 35%、綠原酸0.002 57%～0.004 43%、表兒茶素0.090 0%～0.128%、鞣花酸0.049 6%～0.112%。含量測(cè)定結(jié)果表明，15批QBD凍干粉樣品含量較高的3種成分中，沒食子酸含量的平均值為S5～S8＞S9～S12＞S1～S4＞S13～S15，表兒茶素含量的平均值為S9～S12＞S13～S15＞S5～S8＞S1～S4，鞣花酸含量的平均值為S5～S8＞S13～S15＞S1～S4＞S9～S12。分析造成此含量差異的原因可能是產(chǎn)地不同所導(dǎo)致，化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果驗(yàn)證了分析的合理性。PCA及HCA結(jié)果都表明了產(chǎn)地的不同導(dǎo)致15批樣品聚集成不同類別，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展選擇青果產(chǎn)地來(lái)源明確了方向。

此外，通過(guò)OPLS-DA找到的VIP值大于1的已知成分表兒茶素、沒食子酸、鞣花酸和綠原酸是對(duì)區(qū)分不同批次樣品質(zhì)量具有較大貢獻(xiàn)的幾個(gè)主要成分，此外其他VIP值大于1的未知成分將會(huì)是課題組接下來(lái)需要重點(diǎn)關(guān)注的部分。通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)發(fā)現(xiàn)萊菔的特征峰（峰6）的VIP值遠(yuǎn)小于1，認(rèn)定此峰可能不是影響QBD質(zhì)量的主要成分，因此可將其作為定量因素進(jìn)行研究。QBD凍干粉指標(biāo)成分的含量范圍與轉(zhuǎn)移率范圍的結(jié)果表明指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移穩(wěn)定可控。

因提取溶媒為水，5種指標(biāo)成分極性較強(qiáng)且轉(zhuǎn)移率較高，說(shuō)明煎煮、濃縮和凍干工藝較穩(wěn)定，未造成有效成分的明顯損失[38]。在量質(zhì)傳遞過(guò)程中，凍干粉具備穩(wěn)定、均一的優(yōu)勢(shì)，能很好地表達(dá)原方信息，而且便于儲(chǔ)存，可為QBD凍干粉后續(xù)作為物質(zhì)基準(zhǔn)的深入研究提供依據(jù)。

本研究所建立的QBD的HPLC特征圖譜、有效成分的含量測(cè)定和量質(zhì)傳遞方法等質(zhì)控手段，共同作為QBD的質(zhì)量控制方法。在藥食同源名方的研發(fā)中，控制原藥材質(zhì)量的均一性尤為重要，為進(jìn)一步縮小指標(biāo)成分含量的范圍，除了對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行分析外，還應(yīng)展開對(duì)采收季節(jié)和采收年份等外界因素的分析研究。此外，若藥材因產(chǎn)地或批次不同而質(zhì)量差異較大時(shí)，可固定產(chǎn)地或控制藥材的含量限度范圍，并且在生產(chǎn)加工中可采取飲片均一化投料的方法，可有效實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，有利于確切反映QBD的質(zhì)量變化屬性，從而確保其功效的穩(wěn)健發(fā)揮，為QBD復(fù)方制劑及大健康產(chǎn)品的開發(fā)研究提供可靠的質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on quality control of famous prescription with medicine and food homology of Qinglong Baihu Decoction based on quantity-quality-correlation and chemometrics

CHEN Jiao1, WANG Ji-sen2, DENG Jing-jing1, ZHU Zong-ping1, LIAO Wan1, CHEN Yi1, YANG Qing-song1, WANG Lin1, FU Chao-mei1, ZHU Ya-ning1, 3

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Chengdu Institute of Food and Drug Inspection, Chengdu 610045, China 3. Ya’an Sanjiu Pharmaceutical Co., Ltd., Ya’an 625000, China

To explore the preparation process of lyophilized powder of Qinglong Baihu Decoction (青龍白虎湯, QBD) and the law of quantity-quality-correlation by establishing an HPLC fingerprint detection method, and build its quality control system combined with chemometrics.Fifteen batches of QBD lyophilized powder were prepared, the fingerprints were established by HPLC method, then imported the chromatographic results into(2012) and calculated the similarity of each part. The content of gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid, epicatechin, and ellagic acid were detected during the quantity-quality-correlation of 15 batches of samples, and the transfer rate and extractum rate were calculated. Combined with the chemometrics methods, the main components of samples from different producing areas which had significant contribution to the quality control were analyzed.The similarity of the fingerprints of 15 batches of samples was > 0.9, which met the specified requirements, and the 24 common peaks of the fingerprints of the lyophilized powder were calibrated, and six of them were identified, they were gallic acid (peak 1), protocatechuic acid (peak 4), chlorogenic acid (peak 8), epicatechin (peak 14), scopoletin (peak 19), and ellagic acid (peak 23). The content range of these components in 15 batches of lyophilized powder were 0.724%—1.301% epicatechin, 2.184%—2.840% gallic acid, 0.607%—0.760% ellagic acid, 0.061%—0.141% chlorogenic acid, 0.017%—0.079% protocatechuic acid, the transfer rates of epicatechin, gallic acid, ellagic acid, chlorogenic acid and protocatechuic acid were 78.60%—89.38%, 76.98%—89.88%, 76.00%—89.78%, 76.90%—90.49%, 80.02%—90.25% respectively, the extractum rate was 12.87%—15.11%, and without discrete data. It showed that during the process of decoction, concentration and lyophilized powder, the transfer rates of effective components were stable. Through chemometrics analysis, it was found that 10 component scontributed significantly to the model, including the designated peak 14 (VIP = 2.812), peak 1 (VIP = 2.804), peak 23 (VIP = 2.715), peak 8 (VIP = 1.053) and peak 4 (VIP = 0.887), which can further deepen the quality control research of QBD.The quality control method of the famous prescription with medicine and food homology of QBD was established for the first time through the HPLC fingerprint combined with the content determination of multiple index components. This method is rapid, simple, feasible, reproducible, stable and it can be applied to the correlation investigation of the quantity-quality-correlation law of decoction pieces, decoction, concentrate and lyophilized powder at the same time; Further through the chemometrics, which provided an important reference for the quality control research of QBD.

Qinglong Baihu Decoction; quantity-quality-correlation; fingerprint; chemometrics; gallic acid; protocatechuic acid; chlorogenic acid; epicatechin; ellagic acid; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3872 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.011

2021-02-25

四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥開發(fā)專項(xiàng)（2018KF001）；四川省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目（2018HH0122）；成都市科技局國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2017-GH02-00054-HZ）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（CGPY1605）

陳 姣，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┖托聞┬脱芯?。Tel: 18428303508 E-mail: 1922702305@qq.com

廖 婉，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事新制劑、新劑型及中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: liaowan2011@126.com

朱雅寧，高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幚碚摗⒅扑幖夹g(shù)與應(yīng)用研究。E-mail: 676640058@qq.com

#共同第一作者：王繼森，男，主管藥師，碩士，從事藥品檢驗(yàn)研究工作。E-mail: 93230623@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]