李珊珊，毛勝潔，劉琛，徐后娟，張麗

（山東農業(yè)大學植物保護學院，山東 泰安 271018）

鏈格孢菌（Alternaria alternata）屬鏈格孢屬，為一種重要的致病真菌，其侵染煙草導致的赤星病是一種發(fā)生在煙葉成熟后期的真菌性病害，發(fā)病快、易于流行，給煙葉生產帶來巨大的經濟損失［1］。鏈格孢菌還可侵染多種作物如梨、棗、柑橘、番茄等［2］。MADS box蛋白是高度保守的結合型轉錄因子家族，在真核生物中廣泛存在并參與多種生物學過程［3－5］。在動物和真菌中存在兩種類型的MADS box基因，分別為SRF－like（類型Ⅰ）和MEF2－like（類型Ⅱ）［6］。Smp1和Rlm1屬于MEF2型，Arg80和Mcm1屬于SRF型［7，8］。Mcm1基因目前已在多種真菌中得到研究。在釀酒酵母中，Mcm1在細胞周期轉錄、微小染色體的維持、一般代謝等方面發(fā)揮重要作用［9－11］；在白色念珠菌（Candida albicans）中，CaMcm1對菌落的形態(tài)建成起著重要作用［12］；在稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）中，MoMcm1參與雄性不育、小分生孢子的產生及致病等過程［13］；在核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）中，SsMcm1被證明能夠調控菌絲生長和毒力［14］；在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中，F(xiàn)gMcm1基因調控細胞確認、有性和無性生殖、次級代謝和致病力等［15］。本課題組前期將鏈格孢中的AaMcm1基因進行敲除并得到了突變體△AaMcm1，突變體生長速度嚴重變緩，與野生菌相比7天的生長降低率達到74.54%，分生孢子產量減少，黑色素和幾丁質含量降低，致病力減弱（未發(fā)表），構建回補體發(fā)現(xiàn)回補體性狀基本恢復至野生菌水平。本研究對突變體△AaMcm1及其野生菌進行轉錄組測序研究，分析差異表達基因和信號通路，以期從轉錄組層面分析突變體生長變化的原因。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

鏈格孢野生型菌株YS－16（Alternaria alternata YS－16）和突變體△AaMcm1（AaMcm1基因敲除）為課題組前期獲得。

1.2 總RNA的提取和轉錄組測序

分別取等量生長7天的野生菌YS－16和突變體△AaMcm1的菌絲在PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）中28℃搖菌培養(yǎng)5天，培養(yǎng)完成后進行過濾，取一定量的菌體液氮冷凍后提取RNA?？俁NA的提取及cDNA文庫的構建均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，每個處理設置3個生物學重復。

1.3 差異表達基因的篩選和功能富集分析

采用DESeq2軟件進行差異表達基因的篩選。分別使用topGO及clusterProfiler進行GO富集分析及KEGG通路分析［16］。差異基因的注釋通過參考基因組Alternaria alternata strain SRC1lrK2f（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／LXPP00000000.1）進行。

1.4 AaMcm1基因結合位點分析

通過JASPAR網站預測AaMcm1基因的結合位點［17］。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因的篩選

將野生菌與突變體的基因表達量進行比較，根據(jù)以下標準篩選差異表達基因：①2個樣本至少有一個MeanTPM值大于等于5；②差異倍數(shù)log2（Fold Change）的絕對值大于1；③p－value或q－value＜0.05。篩選到3 239個差異表達基因，其中上調表達基因有1 917個，下調表達基因有1 322個（圖1）。

圖1 差異表達基因火山圖

2.2 GO富集分析

分別對上調差異表達基因和下調差異表達基因進行了GO富集分析，結果表明，在上調差異表達基因中，參與生物學過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組分（cellular component）的基因分別有4 057、1 260個和783個（圖2）。生物學過程中差異表達基因數(shù)目最多的前5個途徑分別為細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、生物調節(jié)（biological regulation）、生物過程調節(jié)（regulation of biological process）和應激反應（response to stimulus）；分子功能中差異表達基因主要參與催化活性（catalytic activity）和結合（binding）；細胞組分中差異表達基因主要參與細胞（cell）和細胞部分（cell part）。

圖2 上調差異表達基因GO富集分析

在下調差異表達基因中，參與生物學過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組分（cellular component）的基因分別有2 825、1 069個和378個（圖3）。生物學過程中差異表達基因數(shù)目最多的前8條途徑分別為細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、生物調節(jié)（biological regulation）、定位（localization）、定位的建立（establishment of localization）、生物過程調節(jié)（regulation of biological process）、細胞組分組織或合成（cellular component organization or biogenesis）和應激反應（response to stimulus）；分子功能中差異表達基因主要參與催化活性（catalytic activity）和結合（binding）；細胞組分中差異表達基因主要參與細胞（cell）和細胞部分（cell part）。

圖3 下調差異表達基因GO富集分析

2.3 KEGG通路分析

分別對上調差異表達基因和下調差異表達基因進行KEGG通路分析，結果表明，共有429個上調差異表達基因參與了191條信號通路，參與最多的信號通路包括真核生物核糖體合成（ribosome biogenesis in eukaryotes）、嘌呤代謝（purine metabolism）、細胞周期－酵母（cell cycle-yeast）、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair）、DNA復制（DNA replication）等（圖4），說明上調差異表達基因主要參與了遺傳信息處理過程。207個下調差異表達基因富集到170條信號通路中，其中碳代謝（carbon metabolism），淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（glycine，serine and threoninemetabolism），酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）等通路涉及到的差異基因數(shù)量較多（圖5），表明下調差異表達基因主要參與了真菌的代謝過程，對真菌的生長代謝方面產生重要影響。

圖4 上調差異表達基因KEGG通路分析

圖5 下調差異表達基因KEGG通路分析

2.4 差異基因功能分析

按照差異倍數(shù)從大到小排序，篩選出上調及下調倍數(shù)最大的前30個差異基因進行功能注釋（表1）。上調基因主要參與了氨基酸代謝（amino acid metabolism）、DNA復制（DNA replication）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrosemetabolism）、蛋白質降解（protein degradation）等過程，下調基因主要參與了脂肪酸的合成和代謝（fatty acid synthesis and metabolism）、氨基酸的降解（amino acid degradation）、碳代謝（carbon metabolism）、嘌呤代謝（purinemetabolism）等生物學過程。

表1 前30個上調及下調差異表達基因功能注釋

表1（續(xù)）

2.5 AaMcm1基因影響鏈格孢菌的碳水化合物代謝

KEGG信號通路富集結果顯示，參與碳水化合物代謝途徑的下調差異表達基因較多，在250個差異表達基因中上調基因有73個，而下調基因有177個，占70.8%。碳水化合物代謝作為真菌的重要供能方式，在菌絲生長代謝過程中發(fā)揮著巨大作用。Mcm1基因的缺失導致糖酵解、三羧酸循環(huán)過程中基因下調表達明顯，從而導致真菌體內糖分不能正常代謝，有理由認為這是突變體生長速度嚴重下降的重要影響因素。

三羧酸循環(huán)中，檸檬酸合成酶催化的反應是關鍵步驟，草酰乙酸的供應有利于循環(huán)順利進行［18］。分析結果顯示丙酮酸（pyruvate）生成草酰乙酸（oxaloacetate）的過程中基因CC77DRAFT_1020016表達量降低，導致草酰乙酸供應不足。三羧酸循環(huán)作為生物體將糖或其他物質氧化而獲得能量的最有效方式，其效率的下降導致了突變體獲得能量減少，影響了菌絲生長。葡糖酸－6－磷酸（gluconate-6P）轉變?yōu)?－磷酸核糖（rlbulose-5P，CC77DRAFT_1031635）和異檸檬酸（isocitrate）生 成 琥 珀 酸（succinate，CC77DRAFT_926519）這兩個放能反應中差異基因表達下調，導致生物體供能受限；而葡萄糖（glucose）生成葡萄糖－6－磷酸（glucose-6P，CC77DRAFT_648740）、葡糖酸－1，5－內酯（glucono-1，5-lactone）生成葡糖酸（gluconate，CC77DRAFT_948992和CC77DRAFT_1021942）、葡糖酸（gluconate）生成葡糖酸－6－磷酸（gluconate-6P，CC77DRAFT_594108）、琥珀酸（succinate）生成延胡索酸（fumarate，CC77DRAFT_979964）、草酰乙酸（oxaloacetate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，CC77DRAFT_1021809）等反應中差異基因表達也下調。以上結果有力說明突變體中有氧呼吸過程受到限制，產能減少。

2.6 AaMcm1基因影響鏈格孢菌的氮代謝

KEGG富集結果顯示，在所有的氮代謝過程中有158個差異表達基因上調，175個差異表達基因下調，97%的下調基因都富集在氨基酸的代謝過程中。表明敲除AaMcm1基因嚴重影響了鏈格孢的氨基酸代謝，進而影響了鏈格孢體內蛋白質的合成過程。蛋白質作為構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者，其合成過程發(fā)生任何變化，都會導致鏈格孢生長產生不同程度的變化。

2.7 AaMcm1基因結合位點分析

通過JASPAR網站，利用AaMcm1基因的氨基酸序列預測得到該基因的兩個結合位點（圖6）。

圖6 AaMcm1結合位點分析

3 討論與結論

應用RNA-seq技術可以研究特定生長狀態(tài)下不同真菌的基因表達情況，目前RNA-seq技術已被應用于Mcm1基因的功能研究。在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中，轉錄組測序分析表明對BbMcm1基因進行破壞會導致122個基因表達上調，118個基因表達下調，分別與致病性、細胞壁、細胞周期及DNA加工等過程相關［19］；在大麗輪枝菌中，差異表達分析表明，與野生型菌株相比，在VdMcm1敲除突變體中有351個基因上調，823個基因下調，GO和KEGG分析顯示823個下調的基因參與了各種細胞過程［20］。本課題組前期得到鏈格孢菌Mcm1基因敲除突變體，發(fā)現(xiàn)其生長速度嚴重降低，分生孢子產量減少，黑色素和幾丁質含量降低，致病力減弱，對其進行轉錄組測序研究后，發(fā)現(xiàn)1 917個基因表達上調，1 322個基因表達下調，GO分析表明下調基因參與了2 825個生物學過程，主要為細胞過程和代謝過程，KEGG通路分析結果顯示下調基因主要參與碳代謝、淀粉和蔗糖代謝等過程。由此推測AaMcm1基因通過調控不同代謝通路的基因表達控制菌絲的生長等功能［21］。

真菌菌絲的生長主要通過碳水化合物的供能來獲得營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，AaMcm1基因的敲除導致參與碳水化合物代謝過程中70.8%的基因表達下調，在三羧酸循環(huán)中基因下調明顯，參與有氧呼吸的基因如CC77DRAFT_1020016、CC77DRAFT_1031635、CC77DRAFT_926519、CC77DRAFT_648740、CC77DRAFT_948992、CC77DRAFT_1021942、CC77DRAFT_594108、CC77DRAFT_979964、CC77DRAFT_1021809等均下調表達。有氧呼吸作為生物體利用有機物、產生ATP的方式，產生的多種中間產物也可以作為其他反應化合物所需的原料［22］。有氧呼吸被抑制，導致生物體內產能減少，各種有機物合成受到抑制，進而影響生物體的各種代謝過程，使其生長變慢，生命活動降低。

AaMcm1基因的敲除導致全基因組中部分基因表達上調或者下調，其原因可能是某些基因是該基因直接作用的靶基因或者是靶基因表達異常間接導致的基因表達差異［23］。本研究對該基因的結合位點進行了分析，推測在鏈格孢中該基因有兩個結合位點，后續(xù)將對這兩個結合位點進行進一步的試驗驗證，找到可以與其結合的下游靶標基因，進行基因敲除驗證。

AaMcm1基因在MAPK級聯(lián)信號通路中的HOG及FUS3途徑中發(fā)揮功能，HOG途徑主要與細胞壁的合成和細胞滲透壓有關，F(xiàn)US3則與菌絲生長、孢子的產生及致病性相關［24，25］。轉錄組測序結果顯示，參與幾丁質和黑色素合成、細胞壁降解酶合成、分生孢子產生、致病力的部分基因均有表達下調現(xiàn)象，表明AaMcm1基因的敲除影響了鏈格孢體內MAPK信號通路功能的行使。后續(xù)將會對這些方面的差異基因進行深入分析，以期更全面地了解鏈格孢AaMcm1基因的調控網絡。