萬瓊蓮 王連春 王 泉 許杏萍 蘇 帆 趙 靜 蔡 紅

(1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 玉溪 653100； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650201)

羽脈山黃麻(Tremalevigata)屬榆科(Ulmaceae)山黃麻屬植物，是裸巖山地綠化的先鋒樹種(鄭昌隆， 2002； 楊超本， 2013)。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，我國(guó)山黃麻屬植物有6種1變種，云南有5種，其中羽脈山黃麻可生長(zhǎng)在向陽(yáng)山坡雜木林或灌叢中，也可生長(zhǎng)于干熱河谷疏林中，海拔在150～2 800 m(陳煥鏡等， 1998)。山黃麻速生，適應(yīng)能力強(qiáng)，有造林、植被恢復(fù)、藥用等多種用途，具有較高生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義(劉剛等， 2006； 劉永剛等， 2014； 李媛等， 2003)。近幾年發(fā)現(xiàn)云南省玉溪市新平縣出現(xiàn)了羽脈山黃麻叢枝病，枝葉呈“鳥窩狀”，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，甚至引起樹木死亡。

植原體(Phytoplasma)屬于原核生物界(Prokaryotae)柔膜菌綱(Mollicutes)植原體屬(CandidatusPhytoplasma)(劉仲健等， 1999)，寄生于植物韌皮部，感病植株最典型癥狀是叢枝、花變?nèi)~、花變綠，此外是節(jié)間縮短、小葉、黃化、枯枝(梢)、使植株長(zhǎng)勢(shì)衰退和死亡(于少帥等， 2016)，主要通過韌皮部取食的葉蟬、飛虱、木虱等昆蟲傳播，尤其是葉蟬和蠟蟬類(盧恒宇等， 2016),對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，至少影響1 000種植物，其中我國(guó)報(bào)道了100多種(McCoyetal.， 1989)。目前植原體的分類主要依據(jù)16S rRNA基因(Leeetal.， 1998)進(jìn)行，根據(jù)模擬RFLP圖譜的比較和相似系數(shù)的計(jì)算，目前將植原體分為33個(gè)16Sr組和超過100個(gè)亞組(Weietal.， 2007； Bertaccinietal.， 2014)。

本研究調(diào)查該叢枝病病害發(fā)生情況及危害程度；采用分子生物學(xué)方法對(duì)云南省玉溪市新平縣采集到的具有典型叢枝癥狀的羽脈山黃麻感病植株進(jìn)行植原體檢測(cè)鑒定，以明確其病原及相關(guān)株系的分類地位，同時(shí)為植原體的深入研究以及本地區(qū)林業(yè)病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及發(fā)病區(qū)域數(shù)據(jù)采集 根據(jù)發(fā)病區(qū)域確定調(diào)查地點(diǎn)為云南省玉溪市新平縣哀牢山自然保護(hù)區(qū)東側(cè)至新平彝族傣族自治縣干熱河谷地區(qū)省道S306沿線，45 km 地帶，海拔在1 500～400 m之間。該地地勢(shì)復(fù)雜，屬山坡地帶，因此在該區(qū)域內(nèi)沿主干道進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查時(shí)間選在山黃麻植原體病害盛發(fā)期7—8月，采用隨機(jī)調(diào)查的方法選取9個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查10株樹，共90株樹，統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率，根據(jù)病害危害程度不同分為輕度(+)、 中度(++)和重度危害(+++)。

1.2 羽脈山黃麻植原體感病植株總DNA的提取 采自云南省玉溪市新平縣海拔1 200 m表現(xiàn)典型叢枝小葉癥狀的羽脈山黃麻感病植株。參照“百泰克”新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào)為DP3112)的方法提取植株總DNA，提取樣品于-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序 針對(duì)植原體16 S rRNA基因采用植原體通用引物P1/P7 (P1∶5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′;P7∶5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)及R16F2n/R16R2[(R16F2n:5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′; R16R2∶5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′](Schneideretal.， 1995； Leeetal.， 1993)進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增。將提取的總DNA稀釋25倍后擴(kuò)增，直接PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)： 94 ℃預(yù)處理5 min； 94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。巢式PCR以直接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的25倍稀釋產(chǎn)物為模板： 95 ℃預(yù)處理5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。用OMEGA的Cycle Pure Kit(D6492)試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物純化加A(TaKaRa TaqTM,R001A)，與pMD19-T (TAKARA) 載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α (全式金，CD201-01)中，菌落PCR反應(yīng)篩選陽(yáng)性克隆后由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 序列在線分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測(cè)序所得DNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定是否為植原體。再通過植原體在線分類鑒定工具iPhyClassifier(https:∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)針對(duì)植原體16S rDNA F2nR2擴(kuò)增片段進(jìn)行相關(guān)候選種(‘CandidatusPhytoplasma’species)的確定及基于17種限制性內(nèi)切酶的虛擬RFLP圖譜及相似系數(shù)(similarity coefficient，F(xiàn))的16Sr組/亞組的確定，iPhyClassifier將序列相似性<97.5%以及RFLP模型相似系數(shù)F≤0.85的序列劃分為不同的組，0.85

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株的癥狀 感病植株和健康植株明顯不同，表現(xiàn)為植原體病害典型的叢枝和小葉癥狀，叢枝狀枝條大量密集叢生，遠(yuǎn)看呈“鳥窩狀”，且節(jié)間縮短，葉片卷曲畸形、變小和黃化(圖1)。

2.2 羽脈山黃麻叢枝病病害調(diào)查 羽脈山黃麻在云南玉溪各縣廣泛存在，據(jù)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)云南玉溪新平縣和峨山縣都有羽脈山黃麻叢枝病的發(fā)生。新平縣發(fā)生區(qū)域主要位于哀牢山自然風(fēng)景保護(hù)區(qū)東側(cè)至新平彝族傣族自治縣干熱河谷地帶，沿省道S306大約45 km 范圍內(nèi)，從表1可以看出具體地理坐標(biāo)在101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之間，海拔從1 426～488 m，但發(fā)病區(qū)域主要集中在低海拔600～400 m之間，發(fā)病區(qū)域植被較為茂盛。該處山黃麻近3年都發(fā)現(xiàn)有叢枝病發(fā)生， 2018年7月調(diào)查此叢枝病平均發(fā)病率為38.9%，危害程度以中度(++)為主，發(fā)病樹枝癥狀明顯，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)。該區(qū)域接近新平縣最低海拔，屬于河谷高溫區(qū)，由此可知，高溫地區(qū)可能有利于植原體病害的發(fā)生。

表1 羽脈山黃麻叢枝病調(diào)查區(qū)域地理位置及其發(fā)病率①Tab.1 Geographical location of survey area and incidence of Trema levigata witches’-broom disease

2.3 16S rDNA 片段 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 分別以山黃麻健康和感病植株提取的總 DNA 為模板，經(jīng)巢式 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果感病植株獲得約1 200 kb 的16S rDNA 片段，健康植株未擴(kuò)出特異性條帶(圖2)，說明感病植株中含有植原體，將該株系命名為云南玉溪羽脈山黃麻叢枝植原體(Tremalevigatawitches’-broom phytoplasma，TLWBYN01)。

圖2 山黃麻叢枝植原體16S rDNA 巢式PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)Fig. 2 PCR products of 16S rDNA amplified from Trema levigata witches’-broom disease plantsM： 2 000 bp maker； 1-3： 感病植株； 4： 健康植株。Lane 1-3: Diseased plants; Lane 4: Healthy plant.

2.4 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將擴(kuò)增到的約1 200 bp大小的16S rDNA特異片段克隆測(cè)序，結(jié)果表明： 該16S rDNA基因擴(kuò)增片段含有1 246個(gè)核苷酸，G + C 的含量為47.11%，TLWBYN01在GenBank中登錄號(hào)為： MN513329。利用GenBank 中的BLAST程序?qū)λ?6S rDNA序列進(jìn)行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與植原體16S rDNA序列相似度最高。通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier得出TLWBYN01與翠菊黃化植原體(CandidatusPhytoplasma asteris，M30790)序列相似性達(dá)99.8%，因此該植原體為‘CandidatusPhytoplasma asteris’相關(guān)菌株，屬于16Sr I組成員。通過MegaX軟件構(gòu)建TLWBYN01的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，從進(jìn)化樹可看出TLWBYN01與16S rI組明顯聚為一個(gè)分枝，屬16S rI組成員。通過iPhyClassifier虛擬RFLP分析及相似系數(shù)(similarity coefficient，F(xiàn))計(jì)算可知TLWBYN01與16S rI-X亞組的參考株系番木瓜束頂植原體(JF781308)最為相似，相似系數(shù)F為0.98。由圖4可知，TLWBYN01與16S rI-X(JF781308)的17種限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜除了MseI以外其余相同。因此TLWBYN01屬于16S rI-X亞組的一個(gè)變種16S rI-X**。此外，通過在線分析軟件MUSCLE比較得出TLWBYN01與16S rI-X亞組成員番木瓜束頂植原體(JF781308)和印度葫蘆植原體(LT594117、LT594118)同源性分別為99.2%和99.6%。

圖3 利用鄰接法構(gòu)建的基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbour-joining method based on 16S rRNA gene sequences草莓果變綠Strawberry phylloid fruit;三葉草變?nèi)~Clover phyllody;翠菊黃化叢枝AY Witche’s broom;杜鵑花小葉Azalea little leaf; 月見草綠化Oenothera virescence; 墨西哥馬鈴薯紫頂Mexican potato purple top; 葫蘆黃化小葉Lagenaria siceraria yellow little leaf; 番木瓜束頂Papaya bunchy top; 植原體候選種Ca.phytoplasma.

圖4 虛擬16S rDNA-RFLP酶切圖譜Fig. 4 Virtual RFLP analyses of TLWBYN01 phytoplasmas 16S rDNA F2nR2 fragmentA、B: TLWBYN01和JF781308的17種限制性內(nèi)切酶虛擬RFLP分析；C：16S rI亞組MseI虛擬RFLP分析。A,B:Virtual RFLP analysis of TLWBYN01 and JF781308 with 17 restriction enzymes. C: Virtual RFLP analysis of 16S rI subgroups with restriction enzymes MseI.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)的植原體病害寄主為榆科山黃麻屬植物羽脈山黃麻，榆科榆屬植物已有植原體病害相關(guān)報(bào)道(朱天生等， 2008)，但榆科山黃麻屬植物還未見有關(guān)植原體病害的報(bào)道，因此羽脈山黃麻為植原體的又一新寄主。羽脈山黃麻叢枝病發(fā)生于云南新平縣境內(nèi)哀牢山自然風(fēng)景保護(hù)區(qū)東側(cè)的干熱河谷地帶，海拔1 500 m以下，發(fā)病主要集中在400～600 m的低海拔高溫地區(qū)，且連續(xù)3年都觀察到該病的發(fā)生，癥狀較為明顯，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，有的甚至整株枯死， 2018年7月調(diào)查得知其平均發(fā)病率為38.9%，危害程度中度。說明此植原體病害在該區(qū)域可能是一種常發(fā)病害，加之此處山黃麻分布較為廣泛，在條件適宜的情況下，該病害可能會(huì)擴(kuò)散，山黃麻屬于綠化先鋒物種，應(yīng)給予一定保護(hù)，使其避免受病害危害。前期有研究表明植原體病害的發(fā)病與溫度相關(guān)，溫度高容易引發(fā)植原體病害，且在溫度較高的7、8月份是病害高發(fā)期(范國(guó)權(quán)等， 2015)，本次調(diào)查與前期研究相符。此外先前在云南元謀發(fā)現(xiàn)的多種植原體病害(萬瓊蓮， 2017)，也位于南亞熱帶干熱季風(fēng)氣候地區(qū)，年平均氣溫相對(duì)較高，說明高溫有利于植原體病害的發(fā)生。

本研究基于16S rRNA基因明確了羽脈山黃麻叢枝植原體(TLWBYN01)的分類地位，該植原體與CandidatusPhytoplasma asteris相關(guān)，屬16S rI-X亞組的變種，與已報(bào)道的榆科榆屬相關(guān)植原體(16S rV-A)不同(Leeetal., 2004； 朱天生等， 2008)。已知全世界范圍內(nèi)分布最為廣泛的是翠菊黃化組(16S rI組)植原體，16S rI組也是我國(guó)最主要的植原體之一，組內(nèi)多樣性也最為豐富(Leeetal.， 2004； 賴帆等， 2008)，但有關(guān)16S rI-X亞組的序列報(bào)道還相對(duì)較少，因此本研究可為本亞組及16S rI組的研究奠定基礎(chǔ)。植原體不同于其他可培養(yǎng)細(xì)菌，它還需要大量數(shù)據(jù)來進(jìn)行進(jìn)一步的分析和完善，這對(duì)于植原體的研究具有重要意義。除了分析羽脈山黃麻植原體16S rRNA 基因序列，還可以進(jìn)一步分析它的其他保守基因，因?yàn)橄噍^16S rRNA 基因，其他基因有更大的變異性，有利于植原體的系統(tǒng)分析和鑒定。最早是針對(duì)rp、tuf和secY基因?qū)Ω鹘M植原體進(jìn)行更細(xì)致地劃分(朱天生等， 2007)，而后還加入了secA、ipt、dnaK、fusA、gyrB、pyrG和rpoB等基因，得到多個(gè)基因序列后，采用多位點(diǎn)序列分析法對(duì)組內(nèi)的植原體進(jìn)行更為全面的遺傳變異規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)育的研究，這在16S rI組內(nèi)已得到應(yīng)用(Yuetal.， 2017)。這是首次在羽脈山黃麻上發(fā)現(xiàn)植原體，且該叢枝病發(fā)生穩(wěn)定，有一定的發(fā)病群體，值得進(jìn)一步研究，后續(xù)可通過多位點(diǎn)序列分析法對(duì)其進(jìn)行完善。在調(diào)查過程中也有發(fā)現(xiàn)疑似媒介昆蟲葉蟬，因此可以進(jìn)一步調(diào)查其媒介昆蟲。對(duì)該病害的研究，可幫助我們了解植原體以及它與寄主之間的相互關(guān)系。

4 結(jié)論

云南玉溪新平縣發(fā)現(xiàn)的羽脈山黃麻叢枝病對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，經(jīng)調(diào)查表明該病害位于大約101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之間，集中在低海拔400～600 m的溫度相對(duì)較高的干熱河谷地區(qū)，常年危害， 2018年7月調(diào)查得知平均發(fā)病率為38.9%，危害程度中等，但因該區(qū)域植被茂盛，山黃麻分布廣泛又是先鋒物種，因此要注意進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)該病害的防控，以免擴(kuò)散傳播。羽脈山黃麻叢枝病經(jīng)分子鑒定屬于植原體病害，該植原體與CandidatusPhytoplasma asteris相關(guān)，屬16S rI-X亞組的變種。山黃麻為植原體新寄主。