任利利 陶 靜 武海衛(wèi) 宗世祥 王傳珍 華 德 石 娟 劉漪舟 駱有慶

(1.北京林業(yè)大學林木有害生物防治北京市重點實驗室 北京 100083； 2.山東省林業(yè)科學研究院 濟南 250014； 3.山東省煙臺市森林資源監(jiān)測保護服務中心 煙臺 264003； 4.山東省煙臺市牟平區(qū)自然資源局 煙臺 264100)

長林小蠹Hylurgusligniperda(Fabricius, 1787)，異名：BostrichusligniperdaFabricius, 1787；BostrichuselongatusHerbst, 1793;BostrichusflavipesPanzer, 1795;HylesinusflavipesPanzer, 1795;Hylesinusligniperda(Fabricius, 1792);Hylurguselongatus(Herbst, 1793);Hylurgusflavipes(Panzer, 1795);HylurguslongulusKolenati, 1846。屬鞘翅目(Coleoptera)象蟲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)切梢小蠹族(Tomicini)林小蠹屬(HylurgusLatreille)，英文名為 red-haired pine bark beetle。

林小蠹屬在世界范圍內(nèi)已知有3種(Alonso-Zarazagaetal.， 2017)，寄主樹種大多為松屬(Pinusspp.)植物。歐洲報道一種為米林小蠹HylurgusmicklitziWachtl, 1881，主要危害阿勒頗松(Pinushalepensis)、 海岸松(P.pinaster)、 意大利松(P.pinea)和P.nigrasubsp.pallasiana(Wood, 1992; Brightetal., 1997; Alonso-Zarazagaetal.， 2017)； 印度分布一種(Wood, 1985)，HylurgusindicusWood, 1985，作者描述的4只雌性標本采集于喜馬拉雅長葉松(Pinusroxburghii)(原文中Pinuslongifolia為其異名)木段，除此新種記錄外，該種無其他研究報道。我國無該屬昆蟲分布的報道。

長林小蠹原產(chǎn)歐洲南部及非洲北部的地中海沿岸。近90年來，已傳播至各大洲，包括歐洲全部，非洲北部及其南端，亞洲的日本、韓國、土耳其、斯里蘭卡，大洋洲的澳大利亞、新西蘭，南美洲的巴西、智利、烏拉圭以及北美洲的美國。據(jù)報道，傳入日本的時間推測早于1931年； 于 1942 年傳入澳大利亞， 1956 年傳入烏拉圭， 1973 年傳入南非， 1974年傳入新西蘭， 1987年傳入智利， 2000—2001年于紐約發(fā)現(xiàn)越冬種群并明確傳入美國， 2007 年在加州發(fā)現(xiàn)； 于2007 年傳入阿根廷， 2018年報道傳入韓國(Parketal.， 2017； Wood， 1992； Alonzo-Zarazagaetal., 2017； El-Khouryetal.， 2019； Swan， 1942； Schedletal., 1966； Schedl， 1982； Ciesla， 1988； Liuetal.， 2007)。我國沒有長林小蠹分布的報道，但已將其列為進境植物檢疫性有害生物，國際植物保護公約(IPPC)規(guī)定其為需要檢疫除害處理的種類(International Plant Protection Commission， 2005； 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局， 2017)。

該蟲在世界范圍的寄主樹種超過20種(Eglitis, 2001)，包括： 2針松的歐洲赤松(P.sylvestris)、意大利黑松(P.brutia)、阿勒頗松、土耳其松(P.halepensisvar.brutia)、歐洲黑松(P.nigra)、P.nigrasubsp.pallasiana、奧地利黑松 (P.nigravar.austriaca)、克里木松(P.nigravar.caramanica)、海岸松、日本黑松 (P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)， 2～3針松和3針松的濕地松(P.elliottii)、加那利松 (P.canariensis)、展葉松(P.patula)、輻射松(P.radiata)， 5針松的山松(P.montezumae)、意大利松、北美喬松(P.strobus)， 其他寄主還包括冷杉屬(Abiesspp.)、落葉松屬(Larixspp.)、云杉屬(Piceaspp.)和黃杉屬(Pseudotsugaspp.)的部分樹種。

據(jù)國外文獻報道，長林小蠹屬樹皮小蠹類，通常侵染新伐木、伐樁、衰弱木，健康樹也可受危害，是次期性害蟲中的先鋒種； 鉆蛀坑道于樹干基部、根頸和根部。受害樹木樹皮和根部外表可見長林小蠹的侵入孔或羽化孔，幼蟲在坑道內(nèi)取食時，樹皮表面有暗色蛀屑排出(Browne, 1968； Ciesla, 1988)。長林小蠹在法國一般1年2代，在智利1年3代，世代重疊使其在全年多數(shù)時間均能傳播與危害； 成蟲的活動受到溫度、濕度和光照的影響。羽化后出孔前的成蟲具有蔽光性； 出孔后揚飛期溫度高于20 ℃時具有正趨光性，侵入寄主或入土后恢復蔽光性； 濕度同時也會影響其趨光習性； 性成熟前有在新生松枝上鉆蛀補充營養(yǎng)的習性(Fabreetal., 1974； Ciesla， 1988； Eglitis, 2001)。長林小蠹雌蟲首先侵入根皮下，在根皮的形成層中筑造一個交配室并誘集雄蟲進入，雌蟲與雄蟲交配后(一夫一妻制)，雌蟲建造 1 個長而彎曲的母坑道，并在坑道兩端的刻痕中產(chǎn)卵，據(jù)報道每雌蟲最多產(chǎn)卵500粒(Fabreetal., 1974)。雌蟲可鉆蛀數(shù)條母坑道，單頭雌蟲蛀母坑道總長度可達3 m。幼蟲在根皮下取食韌皮部與邊材，子坑道不規(guī)則，不會形成特定的坑道結構； 幼蟲共4齡，老熟后化蛹，以幼蟲或成蟲越冬，春季羽化飛出后，時有群聚現(xiàn)象(Browne, 1968)。

另據(jù)報道，除了直接危害松樹外，長林小蠹可攜帶能侵染與危害寄主樹木的半帚霉屬(Leptographium)、蛇口殼屬(Ophiostoma)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、球殼孢屬(Sphaeropsis)等真菌(Davydenkoetal., 2014; Jankowiaketal., 2013; Kimetal., 2011; Rayetal.2006)，不僅易導致樹木的死亡，且嚴重影響成品木材的品質。在歐洲，其是傘滑韌屬(Bursaphelenchus)幾種線蟲，如Bursaphelenchushellenicu、B.sexdentati和B.tusciae等的傳播媒介(Ambrogionietal., 1998; Mejrietal., 2016; Carletti, 2008; Carlettietal., 2008; Penasetal., 2006; 2004; Torrinietal., 2020)。長林小蠹成蟲具有很強的自然傳播能力，可飛行達數(shù)千米； 在澳大利亞，該蟲 18個月內(nèi)傳播了 25 km(楊曉軍等， 2002)； 在智利，自 20世紀 80年代傳入該蟲后，到 1991年就已擴散至輻射松的所有分布區(qū)(Mauseletal., 2006)。

長林小蠹是我國口岸檢疫中截獲次數(shù)最多的林業(yè)害蟲之一，公開報道的海關截獲記錄顯示，多個省市口岸在來自智利、新西蘭、澳大利亞、巴西、烏拉圭等多國的原木、鋸材和集裝箱中，均截獲到了該蟲。最早于1986年4月14日，天津動植物檢疫所曾在進口的智利原木上截獲到該蟲(魏厚德等， 1991)。2019年4月19日，河北曹妃甸海關在進口的新西蘭輻射松原木中截獲此蟲。2005—2015年間，我國口岸共截獲長林小蠹4 049批次(梁振等， 2017年)，被認為是重要的“林木殺手”。

目前我國對長林小蠹生物學特性、適生性、防治技術等方面的研究少，認知度低，極大地增加了檢疫、監(jiān)測和防治的難度。本研究利用形態(tài)學、分子生物學和危害特征分析的方法對其進行了鑒定，首次發(fā)現(xiàn)并明確了該蟲在我國的入侵、定殖并嚴重危害，初步調(diào)查了其危害特性。

1 材料與方法

1.1 蟲源采集

樣品采集于山東省煙臺市牟平區(qū)沿海防護林帶(37.457 241°N，121.851 217°E)。2020年10月至11月，在日本黑松根皮下，采集到一種嚴重危害根部的小蠹，帶回北京林業(yè)大學森林保護學科檢疫實驗室。

1.2 形態(tài)特征觀察

使用蔡司AxioZoom V16體式顯微鏡對該小蠹的幼蟲、蛹及成蟲形態(tài)特征進行觀察、拍照。參考Balachowsky (1949)、Wood (1986)、袁克等(2007)、王仿等(2006)以及《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準〈長林小蠹檢疫鑒定方法〉》(中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局， 2006)對該蟲形態(tài)特征進行檢索與比對。

1.3 分子鑒定

隨機取不同寄主單株中的成蟲12頭和幼蟲5頭，分別提取單頭小蠹的基因組 DNA，用于分子鑒定。

DNA 提?。?使用微量 DNA 提取試劑盒 AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，(Axygen，美國)，按說明書步驟提取樣品 DNA； 使用超微量紫外線分光光度計 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.，美國)檢測樣品 DNA 濃度。

PCR 擴增： 本試驗以上述方法提取的 DNA 為模板，擴增核糖體28S和線粒體 COⅠ基因片段。引物序列見表1。PCR 擴增體系為： 2×Es Taq MasterMix(CWBIO，CW0690M)20 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，DNA 模板 2 μL 和超純水 16 μL 共 40 μL。PCR 反應程序為： 94 ℃預變性 3 min； 94 ℃變性 45 s，參照表1中溫度退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共進 行 40 次循環(huán)； 72 ℃延伸 10 min； 4 ℃保存。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

PCR 擴增產(chǎn)物測序： PCR 擴增完成的產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術有限公司進行雙向測序。

序列比對： 拼接后的樣本28S和COⅠ序列進行了Blast(NCBI)比對，使用Blastn、 Standard database、High similar sequences (mega blast 程序)。

面對激烈的市場競爭，HM國際貨代企業(yè)應當努力增強實力，提高市場話語權以及服務專業(yè)性，為客戶爭取更多的利益。

基于28S序列建樹： 參考黃蓬英等(2018)、 McKenna等 (2009)、Sequeira等 (2002)、Jordal等 (2011)、Susoy等(2014)、Pistone等 (2016) 以及Pistone等 (2018) 的研究，隨機選取3條試驗樣本序列(NCBI 登錄號MW725426、MW725427、MW725428)，下載 NCBI 數(shù)據(jù)庫中相關序列(表2)，使用Bothrosternusfoveatus作為外群。

表2 相關建樹序列信息Tab.2 Sequence information in tree construction

使用PhyloSuite (Zhangetal., 2020)及相關插件程序建樹，使用MAFFT (Katohetal., 2013)進行多重序列比對，使用ModelFinder (Kalyaanamoorthyetal.， 2017)選擇最適建樹模型，使用IQ-TREE (Nguyenetal., 2015)構建ML樹(Maximum likelihood)，參數(shù)如下： 5 000 ultrafast bootstraps, approximate Bayes 檢驗和 Shimodaira-Hasegawa-like approximate likelihood-ratio 檢驗(Hoangetal.， 2018)； 進化樹文件由iTOL(https:∥itol.embl.de)使用Root mid point 模式成圖。

基于COⅠ序列的單倍型分析： 下載 NCBI 數(shù)據(jù)庫中長林小蠹COⅠ序列JQ015131、JQ015128、JQ015130和JQ015129 (經(jīng)通訊聯(lián)系，明確為美國研究者上傳，樣本采集地不詳)， AY040292(新西蘭奧克蘭樣本)， HM002621(經(jīng)通訊聯(lián)系，明確為深圳口岸截獲來自新西蘭輻射松原木攜帶的樣本)。隨機選取樣品12條成蟲序列和5條幼蟲序列(NCBI 登錄號為MW726016、MW726017、MW726018、MW726019、MW726020、MW726021、MW726022、MW726023、MW726024、MW726025、MW726026、MW726027、MW726028、MW726029、MW726030、MW726031和MW726032)，多重序列比對方法同上，除去前后冗余堿基序列，所得長林小蠹COⅠ序列長度為676 bp。使用軟件DNAsp v6(Libradoetal., 2009)計算遺傳多樣性的參數(shù)，包括DNA序列變異位點數(shù)量、核苷酸多樣性、單倍型數(shù)量、單倍型多樣性以及各單倍型的種群組成。使用PopART(http:∥PopART.otago.ac.nz)構建單倍型網(wǎng)絡圖。

1.4 危害特征觀察

2020年11月，在山東省煙臺市牟平區(qū)沿海防護林帶的被害日本黑松林內(nèi)進行踏查和樹干、根解析。依據(jù)被害木樹冠顏色，選擇綠色樹冠5棵，黃綠色樹冠21棵，以及紅冠木5棵； 伐倒后將樣木根系用吊車從沙地中整體拔出，對該小蠹的危害特征進行觀察與統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒別

2.1.1 切梢小蠹族的主要形態(tài)鑒別特征 復眼完整，縱橢圓形； 前胸背板前半部無瘤齒； 鞘翅2基緣呈并列雙凸弧線(圖1)。

圖1 長林小蠹符合切梢小蠹族的關鍵形態(tài)特征Fig. 1 Hylurgus ligniperda conforms to the key morphological characteristics of the Tribe Tomicinia. 復眼橢圓形、完整(長林小蠹)Compound eye oval, complete (H. ligniperda); b. 前胸背板及鞘翅基緣(長林小蠹)Pronotum and elytra base (H. ligniperda).

2.1.2 長林小蠹與常見相似屬種類的區(qū)別 1)與切梢小蠹屬(Tomicus)的區(qū)別 林小蠹屬前足基節(jié)窩相連； 前胸背板較狹長，長為寬的1倍左右，前1/3輕微縊縮； 鞘翅溝間部毛多列。切梢小蠹屬前足基節(jié)窩微分離； 前胸背板較粗壯，長為寬的0.85倍，前1/3強烈縊縮； 鞘翅溝間部毛單列(圖2)。

圖2 長林小蠹與切梢小蠹屬形態(tài)特征的對比Fig. 2 Comparison of the morphological characteristics of Hylurgus ligniperda and the Genus Tomicusa. 前足基節(jié)窩相連(長林小蠹)Procoxae contiguous (H. ligniperda); b. 前足基節(jié)窩微分離(橫坑切梢小蠹)Procoxae moderately separated (Tomicus minor); c. 前胸背板較狹長(長林小蠹)Pronotum more slender (H. ligniperda); d. 前胸背板較粗壯(橫坑切梢小蠹)Pronotum stouter (T. minor); e. 鞘翅溝間部毛多列(長林小蠹)Erect interstrial setae abundant, confused (H. ligniperda); f. 鞘翅溝間部毛單列(橫坑切梢小蠹)Erect interstrial setae in uniseriate rows (T. minor).

圖3 長林小蠹與大小蠹屬形態(tài)特征的對比Fig. 3 Comparison of the morphological characteristics of Hylurgus ligniperda and the Genus Dendroctonusa. 觸角鞭節(jié)6節(jié)(長林小蠹)Antennal funicle 6 segmented (H. ligniperda);b. 觸角鞭節(jié)5節(jié)(紅脂大小蠹) Antennal funicle 5 segmented (Dendroctonus valens).

3)與根小蠹屬(Hylastes)的區(qū)別 林小蠹屬鞘翅基緣隆起； 觸角鞭節(jié)6節(jié)； 體表被長毛，無鱗片。根小蠹屬鞘翅基緣不隆起； 觸角鞭節(jié)7節(jié)； 體表被短剛毛或鱗片(圖4)。

圖4 長林小蠹與根小蠹屬形態(tài)特征的對比Fig. 4 Comparison of the morphological characteristics of Hylurgus ligniperda and the Genus Hylastesa. 鞘翅基緣隆起，體表被長毛(長林小蠹)Crenulations on elytral bases usually well developed, body surface setae usually hairlike (H. ligniperda); b. 鞘翅基緣不隆起，體表被短剛毛或鱗片(黑根小蠹)Crenulations on elytral bases usually poorly developed，body surface setae scalelike or bristle (Hylastes parallelus);c. 觸角鞭節(jié)6節(jié)(長林小蠹)Antennal funicle 6 segmented (H. ligniperda); d. 觸角鞭節(jié)7節(jié)(黑根小蠹)Antennal funicle 7 segmented (H. parallelus).

2.1.3 長林小蠹的形態(tài)特征 1)成蟲 如圖5所示，體長4～5.7 mm，體圓筒形，黃褐色至黑色。觸角鞭節(jié)6節(jié)，錘狀部4節(jié)，復眼長橢圓形； 額面正下方有一黑色瘤； 頭腹面前咽縫三角區(qū)下陷。鞘翅基緣具顏色較深的鋸齒狀邊緣； 鞘翅溝上毎刻點的中央各具一黃色短茸毛； 溝間粗糙，具橫皺褶，每溝間具有4～5排排列不甚規(guī)則且向后斜伸的茸毛，鞘翅兩側的茸毛比前胸背板兩側的要短，且鞘翅上的茸毛愈向翅末愈長，在斜面上，茸毛形成簇狀。

圖5 長林小蠹識別的關鍵形態(tài)特征Fig. 5 The key morphological characteristics of the identification of Hylurgus ligniperdaa. 成蟲背面觀Adult dorsal view; b. 額面正下方有一黑色瘤Frons with a median tubercle; c. 頭腹面前咽縫三角區(qū)下陷Gular triangle with depression.

2)其他蟲態(tài)形態(tài)特征 老熟幼蟲體長約4.1 ～ 5.9 mm； 體圓柱形，粗壯，弓曲，黃白色。頭部黃褐色，胸節(jié)和腹節(jié)均無足(圖6)。

圖6 長林小蠹幼蟲和蛹的形態(tài)Fig. 6 The morphological characteristics of the larvae and pupae of Hylurgus ligniperda a. 蛹Pupae; b. 老熟幼蟲The last larval instar.

2.2 分子鑒定

采集于煙臺日本黑松根部的12頭成蟲小蠹樣本及5頭幼蟲樣本，屬同一單倍型。通過Blast比對，在28S 基因部分序列(647 bp)與已報道的長林小蠹序列JX263769(新西蘭奧克蘭樣本)，MH005064(廈門口岸截獲來自于澳大利亞進口輻射松原木攜帶樣本)，KJ531125(德國樣本)相似性分別為： 100%，99.85%和99.69%。在COⅠ 基因部分序列(676 bp)與已報道的長林小蠹序列HM002621(深圳口岸截獲來自于新西蘭輻射松樣本)相似性達100%。

基于28S基因序列的最大似然樹結果顯示(圖7)，采集于山東煙臺的樣本序列(SDYT H1—3)，與口岸截獲來自于澳大利亞進口輻射松原木攜帶的樣本序列、德國樣本序列、新西蘭奧克蘭樣本序列以100%的置信系數(shù)聚為一支。長林小蠹一支以99%的置信系數(shù)與同屬種類米林小蠹聚為一支。

圖7 基于28S 基因序列的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹 (圓圈代表ultrafast bootstrap置信系數(shù))Fig. 7 ML phylogenetic tree based on 28S gene sequence (circle represents ultrafast bootstrap support)

參與單倍型數(shù)據(jù)分析的3個來源的長林小蠹樣本共計23個，其中山東煙臺17個樣本。線粒體COⅠ基因序列長度為 676 bp，總體的核苷酸多樣性(Pi)為0.008 95，共含有變異位點17個； 共有6個單倍型； 所有樣本總體單倍型多樣性為0.395 3。山東煙臺樣本均屬于同一單倍型，與深圳口岸截獲來自于新西蘭輻射松的長林小蠹樣本屬于同一單倍型(圖8)。

圖8 基于676 bp COⅠ片段的23個長林小蠹樣本單倍型網(wǎng)絡Fig. 8 Haplotype network of 23 global Hylurgus ligniperda samples based on 676 bp COⅠ sequences Hap_1-6: 6個單倍型Six haplotypes.

經(jīng)過基于COⅠ和 28S 基因序列的DNA條碼分析，采集于山東煙臺的小蠹樣本為長林小蠹，系首次發(fā)現(xiàn)該蟲在中國定殖。

2.3 危害特征

據(jù)初步調(diào)查，該蟲在牟平區(qū)的寄主樹種為我國引進的外來樹種日本黑松。危害嚴重，在挖出的枯死松樹根系中，侵害株率達100%。長林小蠹危害部位可從樹干下部至根系，單坑道長達1.4 m； 距離干基1.8 m的主干上也可受害。成蟲也可直接穿越土壤侵害根系和羽化出孔，從土壤入侵根部時，可向干基部或根端部的方向挖掘坑道； 在側根上可侵害遠離根際7.4 m處的根，可危害細至0.5 cm的根； 根系中危害深達土壤內(nèi)1.5 m(圖9a、b)。嚴重受害的樹木根系中，半米段根(根徑12 cm左右)的蟲口數(shù)可達62頭。被侵害的根皮表面可見侵入孔、羽化孔和通氣孔； 被侵害的根皮下充滿棕色細粉狀蟲糞； 母坑道長，數(shù)量較多時交錯在一起； 無明顯的子坑道； 蛹室明顯，分布于母坑道兩側?？梢姵上x或幼蟲在坑道內(nèi)排隊或聚集鉆蛀； 也可見成蟲在坑道內(nèi)交配(圖9c—g)。該蟲可獨立危害樹冠呈黃綠色、流脂豐富的黑松根部，初步判斷其侵入順序早于與其混合危害的其他多種鉆蛀性害蟲，如褐梗天牛(Arthopalisrusticus)、梢小蠹(Cryphalussp.)、角脛象(Shirahoshizosp.)等； 發(fā)現(xiàn)受該蟲侵染的樹木中，藍變菌侵染嚴重。寄主新鮮的傷口對成蟲的誘集能力強， 2020年11月初仍有成蟲在林間活動，已發(fā)現(xiàn)的越冬蟲態(tài)有老熟幼蟲、蛹和成蟲， 2021年3月初始見成蟲在林間活動。

圖9 長林小蠹危害特征初步觀察Fig. 9 Preliminary observation results of the damaging characteristics of Hylurgus ligniperdaa. 長林小蠹危害特點示意Schematic diagram of the damaging characteristics of H. ligniperda; b. 長林小蠹危害根部特點示意Schematic diagram of the damaging characteristics of H. ligniperda to roots; c. 危害后根皮下的蟲糞The beetle frass under the root bark; d. 成蟲聚集鉆蛀坑道Adults gathering and boring the tunnel; e. 坑道內(nèi)蛹室Pupal chambers in the tunnel； f. 聚集危害的幼蟲Larvae gathering and damaging; g. 坑道內(nèi)成蟲交配Mating of adults in the tunnel.

3 結論

經(jīng)過資料查證、近緣種形態(tài)鑒別、基因條碼比對、危害特征分析，以及原產(chǎn)地與入侵發(fā)現(xiàn)地自然生態(tài)地理和寄主樹種的一致性等一系列的核實比較與綜合判斷，可明確長林小蠹這種外來有害物種已入侵我國，在我國山東煙臺定殖，并嚴重危害日本黑松。長林小蠹危害性強，成蟲可直接進入土壤侵入樹木根部，甚至可危害遠離根基約7 m以上0.5 cm的細根，可先期侵害亞健康樹木并致死。該蟲隱蔽性危害，地上無明顯蟲糞等特殊易辨的危害特征，監(jiān)測、防控難度極大。長林小蠹在世界各大洲之間的入侵歷史具有國際重大入侵生物的基本特點，即傳播擴散時間長、入侵地分布廣，且寄主樹種多、環(huán)境適應性強。本文為深入研究長林小蠹的特征和快速鑒定方法奠定了基礎，便于提高鑒定、檢驗檢疫的針對性和有效性； 初步調(diào)查了該蟲的危害特征，可為有效防控技術的研發(fā)提供路徑。同時，該蟲在膠東半島與松材線蟲混合發(fā)生的關系等也亟待研究。