彭成彬，王澤榕，阮俊峰,3，魏日鳳，薛 嵐，陳美霞,3 ，劉 偉,3

（1. 寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；3. 福建省產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100；4. 寧德師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建 寧德 352100）

0 引言

【研究意義】柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifoliusS. Y. Hu）是我國特有的樹種，屬于樟目蠟梅科蠟梅屬的木蘭類植物，多年生半常綠灌木，在森林群落生態(tài)系統(tǒng)中屬于優(yōu)勢(shì)灌木樹種[1]。柳葉蠟梅生長(zhǎng)于福建省壽寧縣、安徽省黃山市、江西省修水縣、浙江省麗水市等地的山區(qū)[2]。柳葉蠟梅花期較長(zhǎng)，在南方地區(qū)常作為庭院綠化和園林觀賞植物。柳葉蠟梅葉片作為畬族民間常用的藥材之一，揉碎即芳香，含有多種生物活性成分（揮發(fā)油類、倍半萜類、黃酮類、香豆素、蒽醌與生物堿類等），具有抗氧化、消炎、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1,3]。人們對(duì)柳葉蠟梅的需求量不斷增加，造成對(duì)野生資源的無節(jié)制采摘，現(xiàn)有的野生資源已近枯竭。近年來，人工引種栽培種植數(shù)量提升，但是田間種植管理不到位，關(guān)于柳葉臘梅病害報(bào)道甚少，尚缺乏對(duì)柳葉臘梅病害的深入系統(tǒng)研究。柳葉臘梅真菌病害多發(fā)生在葉片上，產(chǎn)生病斑葉片，不能作為加工原料使用，造成產(chǎn)量減少和經(jīng)濟(jì)損失，該病害的發(fā)生發(fā)展沒有引起足夠的重視，對(duì)于綠色防控柳葉臘梅報(bào)道甚少，針對(duì)引起柳葉臘梅葉部病害的病原菌尚未見報(bào)道，生產(chǎn)上迫切需要明確引起其致病的病原菌株才能采取有效針對(duì)性措施去防控病害?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由真菌引起的植物葉斑病的病原菌種類繁多，如煙草莖點(diǎn)霉葉斑病[4]、龍牙百合葉尖干枯病[5]、非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病[6]、苜蓿匍柄霉葉斑病[7]等，明確病原菌種類顯得尤為重要，但種與亞種之間的差異越來越小，僅靠形態(tài)學(xué)鑒定菌株是不準(zhǔn)確的，同時(shí)分析菌株基因型和表現(xiàn)型，鑒定快速、結(jié)果準(zhǔn)確。已有研究者利用核糖體DNA非轉(zhuǎn)錄區(qū)（18sRNA、28sRNA、5.8sRNA）的基因序列開發(fā)ITS（Internal Transcribed Spacer）標(biāo)記和β-微管蛋白由β-tubulin基因所編碼基因序列開發(fā)成β-tubulin標(biāo)記，二者的序列相識(shí)度較高且生物進(jìn)化具有高度保守基因片段，這二種標(biāo)記已被諸多研究者用于菌類鑒定[8－10]?！狙芯康那腥朦c(diǎn)】對(duì)于侵染柳葉臘梅的病原菌種類尚待進(jìn)一步研究?！緮M解決問題】本研究結(jié)合傳統(tǒng)的鑒定方法和分子方法ITS序列、β-tub序列對(duì)柳葉臘梅的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，以明確其病原菌種類，探究其生物學(xué)特性，以期為柳葉臘梅葉斑病的綜合防治、抗性種質(zhì)資源篩選 和抗病品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試致病菌分離自柳葉蠟梅葉部病斑，采集自寧德壽寧縣福瑞泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司的種植基地 。經(jīng)室內(nèi)無菌條件下分離純化得到供試菌株1013-1。

1.2 供試試劑

供試3種培養(yǎng)基，包括PDA瓊脂培養(yǎng)基，PD液體培養(yǎng)基，OA培養(yǎng)基和查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek Agar）。上述培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]配置，置于115 ℃高 壓滅菌20 min 后備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柳葉臘梅病斑致病菌分離純化 參照植病研究方法[11]，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行柳葉臘梅葉斑病病原菌的分離純化，分離純化5代后，即得到病原 菌菌株。

1.3.2 致病性鑒定 將分離自柳葉臘梅病原菌株分別接種至PDA 平板上，置于培養(yǎng) 5 d后，用無菌的5 mm 的打孔器分別打取菌餅和空白瓊脂平板分別接入進(jìn)行離體柳葉臘梅葉片回接侵染。26 ℃保濕培養(yǎng)，逐日觀察葉片的發(fā)病情況，若發(fā)病，則對(duì)柳葉臘梅葉片發(fā)病部位再重新組織分離，得到與原始接種菌株真菌形態(tài)一致的菌株，則可確定為該病的病原 菌。

1.3.3 致病菌形態(tài)學(xué)鑒定 接種純化的1013-1菌株至PDA 培養(yǎng)基和OA培養(yǎng)及中央，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀察記錄菌落培養(yǎng)特征，在培養(yǎng)5 d的菌落邊緣滴加適量1 mol·L－1的 NaOH溶液，在10 min和2 h后觀察并記錄培養(yǎng)基的顏色變化。通過顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)特征并拍照保存。根據(jù)菌落形態(tài)特 征和分生孢子特征確定病原菌種類。

1.3.4 分子鑒定 1013-1病原菌基因組DNA按照試劑盒提取的方法進(jìn)行（天根生化科技有限公司，北京），分別擴(kuò)增 rDNA-ITS 序列和微管蛋白延伸因子（β-Tub）片段。2對(duì)引物序列分別為ITS1（5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGC-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和β-Tubf（5′-GACCCTTGGC CCAGTTGTTTCCAG-3′）/β-Tubr（5′-CAGAAAGCA GCACCGTTTTTGGTT-3′），引物合成委托福州鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增程序見表1，分別取5 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，15 min），檢測(cè)ITS和β-Tub的PCR 產(chǎn)物片段大小，符合結(jié)果的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送到福州鉑尚生物技術(shù)有限公司委托進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列結(jié)果提交到NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，采用軟件 MEGA 5.0 的Neighbour-Joining法（簡(jiǎn)稱：N J）構(gòu)建ITS和Tub聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

表1 ITS和β-Tub PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序Table 1 Primer ITS and β-Tub PCR amplification procedures

1.3.5 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 用無菌的5 mm直徑打孔器打取培養(yǎng)5 d的1013-1菌落邊緣菌餅備用，分別將菌餅接種置于 PDA培養(yǎng)基中央（皿的直徑為9 cm，下同），分別置于5～40 ℃條件下（每5 ℃為一個(gè)梯度，共8個(gè)不同溫度條件）恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法分別測(cè)定1013-1病原菌的菌落直徑 。每處理重復(fù)3次。

1.3.6 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 用0.1 mol·L－1HCl和0.1 mol·L－1NaOH調(diào)配pH 3～12的PDA培養(yǎng)基。滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)定1013-1病原 菌的菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

1.3.7 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 用滅菌后PDA培養(yǎng)基，接入5 mm菌餅菌餅，獲取方法同1.3.5，分別置于連續(xù)光照、12 h光照12 h黑暗交替、完全黑暗3種光照條件下，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法 測(cè)定1013-1病原菌的菌落直徑，每處理3次重復(fù)。

1.3.8 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的蔗糖以葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、山梨醇、肌醇、木糖醇等量替換，即成含糖量相同而碳源不同的培養(yǎng)基，滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)定1013-1病原菌的菌落直徑，每處理3 次重復(fù)。

1.3.9 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的硝酸鈉以硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、尿素、氯化氨、甘氨酸和硫酸銨等量替換，即成含氮量相同而氮源不同的培養(yǎng)基，滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)定1013-1病原 菌的菌落直徑，每處理3次重復(fù)。

1.3.10 菌絲體的致死溫度測(cè)定 將5 mm菌餅置于5 mL無菌試管中，加入 2 mL 滅菌ddH2O。分別在40 、45 、50 、55 、60 ℃水浴鍋中處理10 min 后，將試管內(nèi)菌絲塊置于 PDA 培養(yǎng)基中央，置于28 ℃下 培養(yǎng)，5 d 后觀察其生長(zhǎng)情況。每處理重復(fù) 3次，1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用 SPSS 17.0軟件對(duì)菌落直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，并利用 Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉臘梅田間病斑和致病性測(cè)定

田間柳葉臘梅的葉片發(fā)病癥狀：表現(xiàn)為褐色病斑，略凹陷，葉正、背面均可受害。多呈圓形或不規(guī)則形，病斑部位有黑色顆粒，病健界限明顯呈現(xiàn)黑褐色，發(fā)病后期葉片脫落，田間采集病葉見圖1-a。采用常規(guī)組織法分離得到1株致病分離物，編號(hào)為1013-1，分別取5 mm純化后的菌餅和空白瓊脂塊，分別接種離體柳葉臘梅葉片，對(duì)照組不發(fā)病見圖1-b，4 d開始發(fā)病，形成褐化病健界限明顯，結(jié)果見圖1- c。重 新分離純化可得到相同的病原菌，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 形態(tài)特征觀察

1013-1分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)特征見圖1-d和圖1-e。正面菌落棕色相間，邊緣白，前期菌落中部凸起，后期菌落展開扁平，氣生菌絲發(fā)達(dá)，棉絮狀、絨毛狀，非常致密，邊緣整齊，前期白色，后期出現(xiàn)不同層次的棕色環(huán)帶。背面和棕色且深淺顏色交替，呈現(xiàn)同心輪紋狀。孢子見圖1-f，形體呈現(xiàn)多數(shù)為梨形和橢圓形，單孢，或者多具 2個(gè)油球，1.8～5.4（4.1）×1.5～2.2（2）μm，其分生孢子器見圖1-i，不規(guī)則形，末端于菌絲相連。1013-1接種于OA培養(yǎng)基5 d后的菌落，使用1 mol·L－1的 NaOH溶液處理，10 min后見圖1-g，菌落邊緣呈現(xiàn)墨綠色，2 h后見圖1-h，菌落邊緣呈現(xiàn)棕色，綜合 上述結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)資料初步判斷為高粱附球菌[12]。

圖1 菌落形態(tài)和致病性鑒定Fig. 1 Colony morphology and pathogenic assay

2.3 PCR克隆及測(cè)序分析序列分析

分別提取病原菌株的基因組DNA進(jìn)行特異性引物ITS和β-tub擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（120 V電壓下15～20 min），結(jié)果（圖2）可知擴(kuò)增的ITS和β-tub條帶單一、清晰明亮、分子量分別在500～750 bp和250～500 bp，與預(yù)期大小一致。測(cè)序分析結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，下載同種屬序列[13]，序列同源性分析和進(jìn)化樹結(jié)果見圖3，1013-1菌株的ITS序列與登錄號(hào)MN493119為Epicoccum sorghinum相似度達(dá)100%，β-tub序列與登錄號(hào)MN512426為Epicoccum sorghinum相似度達(dá)100%，綜合形態(tài)學(xué)結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，得 出該病原菌為高粱附球菌E. sorghinum。

圖2 PCR結(jié)果Fig. 2 Result of PCR

圖3 基于ITS+TUB序列聯(lián)合分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹Fig. 3 NJ-system tree derived from ITS and β-Tub sequence analysis

2.4 不同條件下菌絲生長(zhǎng)影響

2.4.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，由表2可知，1013-1病原菌在pH 3～11下均可生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)范圍是 pH 值為5～9時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較好，菌絲直徑達(dá)到最大值8 cm。病原菌在弱酸到中性到弱堿環(huán)境下有利菌絲生長(zhǎng)，酸性或堿性過強(qiáng) 都會(huì)抑制病菌的生長(zhǎng)。

表2 不同溫度和pH處理病原菌的菌落直徑Table 2 Diameters of pathogen colonies at different temperatures and pHs

2.4.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，由表3可知，病原菌在連續(xù)光照、12 h光照12 h黑暗交替、完全黑暗，這3種光照條件下均可生長(zhǎng)，三者菌絲直徑差別不顯著。光照處理對(duì)菌絲生 長(zhǎng)影響不大。

表3 光照對(duì)生長(zhǎng)影響Table 3 Effect of light on mycelial growth

2.4.4 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在碳源測(cè)定中，培養(yǎng)7 d的結(jié)果從表4可知，病原菌在不同碳源上均能生長(zhǎng)，在供試的11種碳源中，該菌在以蔗糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，其菌落直徑最大，為 8 cm，極顯著高于其余碳源，其次為葡萄糖，病原菌以蔗糖和麥芽糖為最佳碳源。在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基，其菌落直徑最小，為6.02 cm，菌 絲生長(zhǎng)較慢。

2.4.5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在氮源測(cè)定中，培養(yǎng)7 d的結(jié)果從表4可知，氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)（菌落直徑）的影響不顯著，在供試的8種氮源中，其中，硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉和甘氨酸的菌落直徑均為8 cm，以氯化氨為氮源的培養(yǎng)基其菌絲生長(zhǎng)慢，菌落直徑為4.25 cm，對(duì)氯化氨利用 率低，尿素作為氮源不適合1013-1病原菌生長(zhǎng)。

表4 病原菌在不同碳源和氮源處理下的菌落直徑Table 4 Diameters of pathogen colonies on media of different carbon and nitrogen sources

2.4.6 菌絲體的致死溫度測(cè)定 5 mm菌塊在40～50 ℃的水浴溫度處理后，病原菌1013-1仍然能在 PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，55～60 ℃，病原菌1013-1在PDA培養(yǎng)基上不再生長(zhǎng)，菌餅在51 ℃的水浴溫度處理后能在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)，而菌餅在52～54 ℃的水浴溫度處理后，病原菌1013-1不再生長(zhǎng)，表明病原菌1013-1致 死溫度為52 ℃。

3 討論

近年來，由于柳葉臘梅的葉片價(jià)值最高，諸多研究多集中于葉片成分藥用價(jià)值開發(fā)上，國內(nèi)外對(duì)其病害防控研究報(bào)道甚少。柳葉臘梅病害發(fā)生，形成病斑占據(jù)葉片面積，引起植物防御反應(yīng)，葉片自身程序性凋謝脫落，影響樹勢(shì)生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量減少，帶來經(jīng)濟(jì)效益損失。本研究分離柳葉臘梅葉斑病所得的病原菌株為高粱附球菌（E. sorghinum），研究表明，E. sorghinum最早是在高粱葉片上分離得到[14]，后面陸續(xù)在玉米[15]、百合[5]、燕麥[16]被發(fā)現(xiàn)。該病原菌是一個(gè)較有爭(zhēng)議的病原菌，既能作為致病菌侵染植物，同時(shí)又能作為內(nèi)生菌存在，分泌的代謝產(chǎn)物之一細(xì)交鏈孢菌酮酸是一種天然毒素，被列為食品安全檢測(cè)作為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象[17]，分泌的另一種代謝產(chǎn)物是新型蒽醌衍生物，具有殺菌、除草及抗腫瘤的作用[13,15,18]。E. sorghinum很有應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，已有報(bào)道以內(nèi)生菌用于抑菌實(shí)驗(yàn)[19]。而本研究對(duì)E. sorghinum的理化性質(zhì)和分泌代謝物方面的研究少，我們?cè)诤罄m(xù)將嘗試引入多種植物病原真菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，嘗試開發(fā)E. sorghinum相關(guān)代謝物質(zhì)作為抑菌劑的應(yīng)用。在對(duì)E. sorghinum的生物學(xué)特性進(jìn)行探究的過程中我們發(fā)現(xiàn)，受玻璃培養(yǎng)皿的大小限制影響，在氮源上硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉和甘氨酸的菌落直徑均為8 cm，但是發(fā)現(xiàn)第3～5 d菌落培養(yǎng)情況和菌落直徑記錄發(fā)現(xiàn)蛋白胨的菌落直徑均優(yōu)于其他氮源，研究結(jié)果綜合考慮蛋白胨是該菌的最適氮源，本研究的生物學(xué)特性結(jié)果與LIU研究的E. nigrum的溫度和氮源結(jié)果一致，但是在pH和碳源都存在略微的差異，LIU等[20]研究表明最適碳源是麥芽糖和葡萄糖，pH適宜范圍在6 ～9，而本研究最適碳源是麥芽糖和蔗糖，pH適宜的范圍在5～9，推測(cè)可能是由于不同種之間會(huì)存在差異所致，還有待深入研究。柳葉臘梅其活性成分在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過程形成的，這些物質(zhì)對(duì)人類有益，對(duì)于天敵而言卻是致命，而E. sorghinum在長(zhǎng)期侵染柳葉臘梅葉片中是否也發(fā)生協(xié)同進(jìn)化如細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞液泡濃度增高等還有待后續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

柳葉蠟病害防治研究方面相對(duì)空缺，本研究首次報(bào)道了壽寧縣柳葉臘梅的一種新病害，葉斑病病原菌經(jīng)形態(tài)特征觀測(cè)和rDNA-ITS和TUB序列在NCBI數(shù)據(jù)庫的分析比對(duì)，鑒定為子囊菌門，格孢腔目，附球真菌屬，高粱附球菌E. sorghinum。該病原菌的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適pH值范圍為5～9，最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨（綜合第5 d的培養(yǎng)菌落直徑），光照對(duì)該菌株的生長(zhǎng)沒有影響，菌絲體致死溫度為 52 ℃。本研究為柳葉臘梅葉斑病的綜合防治、抗性種質(zhì)資源篩選和抗病品種選育提供理論參考。