繆伏榮,陳鑫珠,李忠榮,劉 景
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013)
【研究意義】茶渣是茶飲料、速溶茶和茶單寧產(chǎn)業(yè)等加工茶葉后產(chǎn)生的殘?jiān)?,?jù)統(tǒng)計(jì),僅茶飲料和速溶茶公司每年產(chǎn)生的茶渣就達(dá)16萬t[1]。研究表明,干基的茶渣粗蛋白質(zhì)含量為17%~25%,是一種良好的蛋白質(zhì)飼料資源[2-4]。日本的佐野滿昭[5]在飼料中添加3%的茶渣喂養(yǎng)肉雞,可提高雞肉的嫩度和脂溶性抗氧化物(VE、VC)含量,降低雞肉脂質(zhì)過氧化物含量。徐瑞等[6]研究表明,在日糧中添加2%的茶葉渣能提高育肥豬的生長性能,改善豬肉的色澤和保水性能。吳慧敏[7]研究發(fā)現(xiàn)在蛋雞的日糧中添加1%~2%的茶渣不僅顯著增加產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重觀察蛋雞的生產(chǎn)性能,還能顯著提高血清中的GSH-Px,T-SOD,IgA,IgM含量,同時(shí)顯著的降低血清中的膽固醇含量。馬幫軍[8]研究表明,豬日糧中添加茶粉1%~3%會(huì)降低豬的平均日增重,但顯著降低豬背膘厚度,減少脂肪在豬胴體中的沉積。潘發(fā)明[9]等則認(rèn)為飼糧中添加茶渣比例過高,會(huì)影響適口性,降低綿羊采食量。主要原因是茶渣粗纖維含量高,畜禽纖維素酶活力低,不利于消化吸收;另一原因,剛出產(chǎn)的茶渣水分達(dá)到80%不易儲(chǔ)藏和運(yùn)輸,因此僅有小部分的茶渣作為飼料源利用,絕大部分茶渣被丟棄或掩埋;這不僅造成資源浪費(fèi),而且造成生態(tài)環(huán)境污染[10-11]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了更好利用茶渣資源,劉姝等[12]利用木霉等組合微生物發(fā)酵茶渣,在30 ℃下發(fā)酵4~8 d后發(fā)現(xiàn),飼料中粗蛋白測定含量>25%,比對(duì)照提高了20%,其營養(yǎng)價(jià)值達(dá)到了仔豬配合飼料中粗蛋白的含量。胡桂萍等[13]以提取茶多酚后的茶渣為發(fā)酵原料,利用乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉菌進(jìn)行常溫(25~35 ℃)的厭氧固態(tài)發(fā)酵5~7 d,測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)29.49%。倪星虹[14]以混合菌種經(jīng)溫度28 ℃發(fā)酵7 d后,測定發(fā)現(xiàn)茶渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量提高了60.78%。朱飛等[1]利用黑曲霉在添加5%玉米粉的茶渣中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,經(jīng)自然pH、37 ℃、8 d條件下發(fā)酵后,茶渣的營養(yǎng)價(jià)值顯著提高。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)是2005年由Ruiz-Garcia等[15]新命名的一種生防菌,是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種[16-19]。國內(nèi)外已有學(xué)者研究表明Bacillus veiezensis能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物,包括纖維素酶、蛋白酶以及多種抗菌的活性物質(zhì),是用來增加作物產(chǎn)量、維護(hù)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的首選生物藥劑[20-26]。貝萊斯芽孢桿也作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌[27]。 Liu X Y等[28]對(duì)從海洋微生物中篩選到菌株Bacillus velezensis H3的發(fā)酵培養(yǎng)基和拮抗物質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該菌株的活性物質(zhì)是一種替代性的表面活性素,有較高的研究價(jià)值?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】茶渣經(jīng)發(fā)酵后雖然能在一定程度上提高茶渣的營養(yǎng)價(jià)值,但發(fā)酵溫度均不超過37 ℃,發(fā)酵效率低,時(shí)間長,易被雜菌污染。因此有必要篩選能適合高效分解茶渣的高溫菌株。但鮮見貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)在降解工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從堆積廢棄茶渣中分離獲得既耐高溫又能產(chǎn)生高酶活的貝萊斯芽孢桿菌Fb,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定,同時(shí)研究其最適的生長條件,分解茶渣的效果,為后續(xù)的茶渣開發(fā)研究奠定理論的基礎(chǔ)。
LB培養(yǎng)液(L):酵母粉10 g,蛋白胨10 g,牛肉浸膏5 g,NaCl 10 g,pH 5.5~6.0。
純化固體培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)液中時(shí)加入20 g瓊脂粉。
分離固體培養(yǎng)基:取新鮮茶渣50 g加蒸餾水500 ml蒸煮30 min,過濾后的茶渣液定容到200 ml,加入4 g瓊脂粉。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基:同LB培養(yǎng)液。
茶渣:采集于某地的茶飲料車間。將發(fā)酵前后的茶渣烘干,粉碎并過0.25 mm孔徑篩,用四分法取樣100 g。
主要儀器:LRH-250A生化培養(yǎng)箱,CRY-200恒溫?fù)u床,Multiskan MK3酶標(biāo)儀,F(xiàn)OSS全自動(dòng)凱氏定氮儀Kjeltec8400,F(xiàn)OSS2010纖維測定儀,menbarPureA300全自動(dòng)氨基酸分析儀。
試劑:酵母粉、蛋白胨、NaCl等均為AR級(jí)、茚三酮染色劑、緩沖液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋液均為 德國menbarPure公司。
1.2.1 菌株的培養(yǎng)與分離 從某地多年堆積的茶渣處取樣品10 g,加入盛有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中,在42 ℃、120 r·min-1條件下富集培養(yǎng)24 h,取2 mL培養(yǎng)物接種到新鮮的LB培養(yǎng)液,以相同的條件重復(fù)培養(yǎng)3次。富集培養(yǎng)物在分離固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),42 ℃培養(yǎng)24 h。挑取生長明顯的菌落進(jìn)行復(fù)篩。將初篩菌落在純化固體培養(yǎng)基上劃線分離3次,以獲得純培養(yǎng)物,并依據(jù)菌種在分離固體培養(yǎng)基的生長情況,挑取有不同形態(tài)特征的單菌落,于42 ℃ LB培養(yǎng)基上分別擴(kuò)繁后加20%甘油混勻 ,于-80 ℃條件下保存。
本研究對(duì)2016年1月1日—2017年12月31日于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腔鏡科使用超細(xì)鼻胃鏡的患者進(jìn)行回顧性分析,共計(jì)160例,年齡36~91歲,男性136例,女性24例,平均年齡分別為61.54±10.34歲和61.38±10.00歲,包含門診與住院患者,患者均一般狀態(tài)尚可,在清醒狀態(tài)下完成內(nèi)鏡下診療,無術(shù)后并發(fā)癥。病變狹窄類型主要為消化道癌癥、術(shù)后吻合口良性與復(fù)發(fā)性狹窄、外壓性狹窄及不明原因性狹窄等,所有患者均因標(biāo)準(zhǔn)胃腸鏡無法通過狹窄處而使用超細(xì)鼻胃鏡。電子內(nèi)鏡均為奧林巴斯生產(chǎn),標(biāo)準(zhǔn)胃鏡的外徑≤9.8 mm,標(biāo)準(zhǔn)腸鏡的外徑≤12.9 mm,而鼻胃鏡的外徑≤5.8 mm(表1)。
1.2.2 菌株產(chǎn)酶能力測定 將菌株活化24 h后挑取1環(huán)至液體發(fā)酵培養(yǎng)液中,42 ℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h后,測定發(fā)酵液的蛋白酶、纖維素酶的活力。采用蒽酮比色法測定纖維素酶(CL)催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量[29]。每mL樣本每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位(U)。酸性蛋白酶(ACP)、中性蛋白酶(NP)和堿性蛋白酶(AKP)的測定按照GB/T 23527—2 009和相關(guān)文獻(xiàn)[30-31]執(zhí)行。
1.2.3 菌落與菌體形態(tài)特征觀察 菌株平板劃線42 ℃分別培養(yǎng)16 h和25 h,在自然光下觀察菌落形態(tài) ;革蘭氏染色后,觀察菌株形態(tài)[32-33]。
1.2.4 菌株生理生化特性 試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[34-35]進(jìn)行。
1.2.5 分子鑒定 菌株的分子鑒定用16S rDNA和gyrB基因進(jìn)行[36]。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對(duì)所測的16S rDNA和gyrA序列進(jìn)行同源性分析,確定親緣關(guān)系,使用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining[37-38]構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算。
1.2.6 菌株生長特性 測量菌株的生長曲線,判斷最適生長溫度[39];對(duì)其生長條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)如表1方案,分析不同因素對(duì)菌株生長的影響,其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基相同,間隔2 h取樣用酶標(biāo)儀在波長630 nm測吸光度。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。
表1 菌株生長條件單因素試驗(yàn)Table 1 Single factor test on growth conditions of bacteria
1.2.7 茶渣降解分析 用回接方法,驗(yàn)證菌株對(duì)茶渣降解效果:對(duì)照組不添加菌劑;發(fā)酵組用LB菌株培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)制成種子,將培養(yǎng)好的種子接入新鮮茶渣中,攪拌均勻使其菌濃度約為1×106CFU·g-1;對(duì)照組和發(fā)酵組各裝入9個(gè)1 L的三角瓶,每瓶裝量200 mg。兩組同時(shí)放入42~45 ℃下的培養(yǎng)箱中;每天搖動(dòng)三角瓶5 s,發(fā)酵7 d結(jié)束測定茶渣營養(yǎng)成分的變化。
常規(guī)成分測定[40]:粗蛋白、粗纖維和粗灰分分別按GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007規(guī)定的方法執(zhí)行。纖維的成分測定[40]:中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)測定根據(jù)GB/T 20806—2006和GB/T 20805—2006方法。氨基酸測定[41]:按GB/T 18246—2000方法,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀 (menbarPureA300)進(jìn)行測定。
1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析,F(xiàn)檢驗(yàn)分析;采用氨基酸分析儀自帶軟件處理數(shù) 據(jù)。
對(duì)5株菌的發(fā)酵液進(jìn)行分析,產(chǎn)纖維素酶(CL)活力由高到低分別是DJ、8106、Fb、8116、HLH;酸性蛋白酶(ACP)活力由高到低分別是8106、8116、DJ、HLH、Fb;中性蛋白酶(NP)活力由高到低分別是8106、HLH、8116、DJ、Fb;堿性蛋白酶(AKP)活力由高到低分別是Fb、8116、8106、DJ、HLH(表2)??梢奆b菌產(chǎn)四種酶的活力均較強(qiáng)。
表2 菌株酶活力比較Table 2 Enzyme activities of selected strains
Fb菌在自然光下,LB培養(yǎng)基,42 ℃培養(yǎng)16 h,其菌落淺黃色,圓形,表面干燥,不透明,邊緣不整齊,如圖1。菌體呈桿狀,(0.4~0.6) μm×(0.9~4.0) μm,單個(gè)或成對(duì)排列,菌體形態(tài)如圖2;芽胞近圓形,近中部生見圖3圓圈標(biāo)記。
圖1 FB菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology (FB)
圖2 菌體形態(tài)Fig. 2 Thallus morphology
圖3 芽孢形態(tài)Fig. 3 Strain morphology
由表3可知,F(xiàn)b菌株能水解七葉苷;吲哚試驗(yàn)陽性;可在β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶等酶中生長;能利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-核糖等多種糖作為碳源生長;但不能利用肌醇、L-鼠李糖、菊粉、環(huán)糊精、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-塔格糖、糖原、麥芽三糖、D-松三糖等。Fb菌株能在低劑量的抗生素中生長,不能在高劑量的卡那霉素耐藥(0.2 g·L-1)、竹桃霉素耐藥(0.1 g·L-1)、多粘菌素B耐藥 (0.031 g·L-1)等培養(yǎng)基生長。
表3 Fb菌株生理生化特性Table 3 Characteristics of Fb
利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast程序分析結(jié)果表明,F(xiàn)b菌株與Bacillus siamensisKCTC 13613T(AJVF 01000043)和Bacillus amyloliquefaciensDSM 7T(FN 597644)菌株的同源性最高,相似性達(dá)到99.93%。采用MEGA 5.0軟件,鄰位鏈接法顯示Fb菌株與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。菌株gyrB測序分析表明,序列長1 176 bp。MEGA 5.0軟件分析結(jié)果表明,其與Bacillus velezensisBCRC 17467T(DQ903176)的同源性較高,相似性達(dá)到100%。同理將該菌株與其他種屬明確的10株菌的gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。
圖4 基于16S rDNA的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strains based on 16S-rDNA differentiation
圖5 基于gyrB的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strains based on gyrB homologies
結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB的序列比較分析,將Fb菌株鑒定為貝萊斯芽孢 桿菌(Bacillus velezensis)。
2.5.1 Fb菌的生長曲線 從圖6可以看出,隨著培養(yǎng)溫度的提高,菌株的細(xì)胞分裂加快,吸光值增加;Fb菌可在30~60 ℃下生長,其最適的生長溫度 為39~54 ℃。
圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長的影響Fig. 6 Effect of temperature on Fb growth in culture
2.5.2 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Fb菌生長的影響 搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1時(shí),隨著裝液量的增加,菌液的吸光值升高,至裝液量30 mL時(shí),F(xiàn)b菌的吸光值達(dá)最高:0.97;再提高裝液量,吸光值逐漸降低(圖7)。從圖8可知,裝液量30 mL時(shí),隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,吸光值升高,搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時(shí),F(xiàn)b菌的吸光值達(dá)最高:0.98;再提高搖床轉(zhuǎn)速,吸光值逐漸降低。表明Fb菌液體培養(yǎng)最佳裝液量和搖床轉(zhuǎn)速分 別為30 mL和120 r·min-1。
圖7 裝液量對(duì)菌株生長的影響Fig. 7 Effect of liquid volume on Fb growth in culture
圖8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長的影響Fig. 8 Effect of flask shaking speed on Fb growth in culture
2.5.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Fb菌生長的影響 圖9為Fb菌在培養(yǎng)溫度42 ℃下的生長曲線。0~6 h是菌體適應(yīng)新環(huán)境的遲緩期,細(xì)胞分裂增殖緩慢;6~16 h為生長繁殖迅速的對(duì)數(shù)生長期;16 h的菌體吸光值最高0.974;16~18 h為穩(wěn)定生長期;18 h后由于自溶酶作用或有毒代謝產(chǎn)物積累,細(xì)胞進(jìn)入衰亡期裂解菌體吸 光值隨之下降。表明Fb菌的最適培養(yǎng)時(shí)間為16 h。
圖9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Fb菌生長的影響Fig. 9 Growth curve of cultured Fb
2.5.4 初始pH對(duì)Fb菌生長的影響 從圖10可以看出,培養(yǎng)基初始pH 4.0~5.0時(shí),菌體吸光值隨pH的提高而提高;培養(yǎng)基初始pH 5.0~7.0范圍內(nèi),F(xiàn)b菌生物量較高且各組間差異不顯著,均高0.93;再逐漸提高培養(yǎng)基的初始pH培養(yǎng)時(shí),菌體吸光值隨之下降;表明Fb菌的培養(yǎng)基最適初始pH為5.0~7.0。
圖10 初始pH對(duì)Fb菌生長的影響Fig. 10 of initial pH on enzyme production of Fb
2.5.5 鹽度對(duì)Fb菌生長的影響 從圖11可以看出,培養(yǎng)液的鹽度從0.0增加到1.0%,菌株的吸光值也從0.46增加到0.92;培養(yǎng)液的鹽度為1.0%~6.0%,菌株的吸光值均大于0.92,無顯著差異;6.0%~7.0%菌 株的吸光值下降至0.81。
圖11 鹽度對(duì)菌株生長的影響Fig. 11 Effect of salinity on Fb growth in culture
從茶渣常規(guī)營養(yǎng)成分分析看出(表4),發(fā)酵組比對(duì)照組粗蛋白提高14.88%,水分和粗纖維分別下降42.06%和9.69%,均存在顯著差異。
表4 茶渣常規(guī)營養(yǎng)成分的變化(n=9)Table 4 Changes in nutritional composition of tea dregs with Fb inoculation (dry base, n=9) (單位:%)
從茶渣纖維成分分析發(fā)現(xiàn)(表5),發(fā)酵組比對(duì)照組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素分別下降10.72%、4.47%和11.37%,均存在顯著差異。
表5 茶渣纖維成分的比較(干基, n=9)Table 5 Change on fiber composition of tea dregs by treatment (dry base, n=9) (單位:%)
從茶渣氨基酸的組分和含量可以看出(表6),除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵前后無差異外,兩組均為谷氨酸含量最高,其次天冬氨酸;除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵外,其他14種氨基酸含量均顯著提高(P<0.05);氨基酸總量的變化與粗蛋白的變化一致,發(fā)酵后其含量提高5.98%,差異顯著。
表6 茶渣處理前后氨基酸含量的比較(干基, n=9)Table 6 Change on amino acid composition of tea dregs by treatment (單位:%)
以上結(jié)果表明Fb菌能高效分解茶渣,顯著提高茶渣的營養(yǎng)價(jià)值,更好實(shí)現(xiàn)茶渣飼料資源化利用。
研究表明,在固態(tài)發(fā)酵中,適宜的水分和原料粒度能夠保證發(fā)酵基質(zhì)深層微生物對(duì)氧氣的需求,疏松多孔的基質(zhì)能促進(jìn)微生物的代謝廢物及時(shí)排出,基質(zhì)內(nèi)部的養(yǎng)分也可隨著自由水通過原料間隙擴(kuò)散到基質(zhì)表面,滿足基質(zhì)表面微生物對(duì)營養(yǎng)的需求,有利于微生物正常繁殖并保持高產(chǎn)酶活性狀態(tài)[1,42]。對(duì)于含水率高的物料,一般選擇吸水性強(qiáng)的鋪料如麥麩等來降低物料的含水率;或選擇中高溫菌發(fā)酵利于物料中水分蒸發(fā)。劉姝等[12]、胡桂萍等[13]、倪星虹[14]和朱飛等[1]均在茶渣中添加不同種類和比例的鋪料進(jìn)行發(fā)酵。本研究獲得貝萊斯芽孢桿菌Fb屬高溫菌,在不添加任何鋪料條件下,新鮮茶渣茶渣經(jīng)其7 d發(fā)酵后水分下降了42.06%(P<0.05),可有效解決水分過高的問題。這種利用高溫菌發(fā)酵分解高水分茶渣的方法不僅能降低生產(chǎn)成本,而且能發(fā)酵產(chǎn)生的生物熱加大物料水分蒸發(fā)鮮見報(bào)道。
本研究中,利用高溫特殊生境分離方法,從廢棄茶渣中分離到有分解茶渣作用的高溫菌5株,其中Fb菌能產(chǎn)生具有較強(qiáng)酶活力的纖維素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶;與胡寶東等[43]從醬香型大曲中分離獲得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(即貝萊斯芽孢桿菌)FBKL1.0190相似。Fb菌經(jīng)菌落形態(tài)、菌株形態(tài)、生理生化特性的研究及分子鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis);可耐受55 ℃的高溫,最適生長條件為:42~45 ℃、pH 5.0~7.0、16 h、鹽度1.0%~6.0%、裝液量0.12 mL·min-1、搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1。茶渣經(jīng)Fb菌株發(fā)酵后,與對(duì)照組比,粗蛋白提高14.88%(P<0.05);除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵外,其他14種氨基酸含量均顯著提高(P<0.05),且氨基酸總量提高5.98%(P<0.05);這與朱飛等[1]的結(jié)果一致,與李芳蓉[44]和張沛[45]的結(jié)果相近。另,本研究中茶渣經(jīng)Fb菌株發(fā)酵后與對(duì)照組相比粗纖維及其中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素分別下降9.69%、10.72%、4.47%和11.37%(P<0.05),這與張楠[46]和陳奕業(yè)[47]研究的結(jié)果相似。此外,本研究分離的Fb菌株的生長溫度均高于他們的發(fā)酵菌株,這不僅可減少其他雜菌生長,而且可提高發(fā)酵效率。由此可見,F(xiàn)b菌能有效分解茶渣,提高茶渣的營養(yǎng)價(jià)值。但該菌株在發(fā)酵分解茶渣的過程中能否產(chǎn)生一些抗菌的活性物質(zhì)或表面活性素還有待后續(xù)的研究。