陳國(guó)梁，郭愛(ài)民，張少華，梁盼紅，李艷萍，王立群，劉婷麗，白 雪，駱學(xué)農(nóng)

絳蟲(chóng)是一類(lèi)具有復(fù)雜生活史的寄生蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)(絳蟲(chóng)蚴)不僅嚴(yán)重危害豬、牛、羊等動(dòng)物的健康，造成養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，而且很多都是人獸共患寄生蟲(chóng)病，對(duì)人類(lèi)健康也構(gòu)成潛在威脅。豬囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)的中絳期幼蟲(chóng)-囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生于人和豬引起的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病呈全球性分布，主要流行于亞、非、拉等一些國(guó)家和地區(qū)，其中以中非、南非、中南美等地區(qū)最為嚴(yán)重[1-2]。全球每年約有5 000萬(wàn)人感染豬帶絳蟲(chóng)或豬囊尾蚴，約有5萬(wàn)人死于腦囊尾蚴(囊蟲(chóng))病[3]。豬帶絳蟲(chóng)病和囊蟲(chóng)病互為因果，形成人-豬相互傳播，惡性循環(huán)，已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然可以通過(guò)改善公共衛(wèi)生、加強(qiáng)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理、嚴(yán)格肉品檢疫來(lái)控制該病的發(fā)生，但無(wú)論是人的豬帶絳蟲(chóng)病還是豬和人的囊尾蚴病，都沒(méi)有特異、敏感的血清學(xué)診斷方法，其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是病原學(xué)檢查。因此，剖檢仍然是目前豬肉檢疫中豬囊尾蚴病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)、亞洲帶絳蟲(chóng)(Taeniaasiatica)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)和泡狀帶絳蟲(chóng)(Taeniahydatigena)的幼蟲(chóng)(絳蟲(chóng)蚴)常寄生于豬的肌肉或肝臟等內(nèi)臟器官。豬囊尾蚴(C.cellulosae)主要寄生于豬的肌肉、肝臟和大腦[4]，而亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴除可寄生于肌肉外，與細(xì)粒棘球蚴和細(xì)頸囊尾蚴一樣，主要寄生于豬的肝臟等內(nèi)臟器官。由于囊尾蚴和棘球蚴均為包囊性結(jié)構(gòu)，在包囊很小時(shí)，很難通過(guò)肉眼進(jìn)行區(qū)分，尤其是豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴和細(xì)頸囊尾蚴都具有1個(gè)頭節(jié)，頭節(jié)上有頂突和小鉤，常規(guī)的頭節(jié)壓片鏡檢也難于準(zhǔn)確鑒定[5]。因此，基于DNA片段的分子診斷是目前豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蚴鑒別診斷必不可少的技術(shù)手段[6-8]。

多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)是一種可在同一體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段的PCR方法，可直接通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳條帶大小或PCR產(chǎn)物的序列分析對(duì)不同蟲(chóng)種進(jìn)行鑒別[9]。本試驗(yàn)擬建立一種可以同時(shí)鑒別豬囊尾蚴等4種豬絳蟲(chóng)蚴的mPCR檢測(cè)方法，對(duì)豬囊尾蚴病的流行病學(xué)調(diào)查、追蹤溯源及保障食品安全和人類(lèi)健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蟲(chóng)體 豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴均由蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室人工感染豬后剖檢收集或臨床收集保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒均購(gòu)自Axygen公司，pMDTM19-T vector Cloning Kit購(gòu)自TaKaRa公司，2×Taq Master Mix和Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Vazyme公司。主要儀器有超速離心機(jī)(Thermo)、PCR儀(Bio-Rad)、電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052型)等。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 從-80 ℃冰箱分別取出4種絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)(亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴和豬囊尾蚴)，室溫解凍后用去離子水洗干凈，分別置于研缽中，加入液氮快速研磨至粉狀；以未感染囊尾蚴的豬肝臟作為陰性對(duì)照，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取每種蟲(chóng)體和肝臟的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 從GenBank中下載4種絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因組序列，并用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)分析。參考Jeon等[10-11]的文章，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因?yàn)閙PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因，用Oligo軟件分析比較，篩選出最優(yōu)的4種絳蟲(chóng)特異性上游引物和1條通用下游引物序列(圖1)。引物由西安擎科生物公司合成(表1)，使用前分別稀釋至10 pmol/μL。

圖1 4種絳蟲(chóng)蚴線(xiàn)粒體部分序列比對(duì)及特異性引物結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Sequence alignment and specific primer binding sites for the partial mitochondrial genome sequence of four tapeworm metacestodes

表1 PCR引物設(shè)計(jì)Tab.1 Design of PCR primers

1.2.3 4種豬絳蟲(chóng)蚴PCR方法的建立 取亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴、豬囊尾蚴和豬肝臟的基因組DNA模板各0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL，混合均勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，評(píng)價(jià)4種絳蟲(chóng)蚴引物的特異性。

1.2.4 4種絳蟲(chóng)蚴mPCR方法的建立 分別以0.5 μL亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴、豬囊尾蚴及豬肝臟的基因組DNA為模板，4種絳蟲(chóng)蚴特異性引物(TaF、EgF、ThF和TsF)的等量混合物(2 μL)為上游引物，通用引物(TR，2 μL)為下游引物，加入2×Taq Master Mix 12.5 μL，并加ddH2O至25 μL。與1.2.3相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)引物混合后各個(gè)片段擴(kuò)增的特異性。

1.2.5 mPCR方法的特異性 采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，分別取亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴、豬囊尾蚴各2種、3種和4種DNA等量混合，分別以混合DNA為模板，用混合引物進(jìn)行mPCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)不同DNA混合物對(duì)PCR產(chǎn)物特異性的影響。同時(shí)，用豬肝臟DNA和混合引物進(jìn)行的mPCR作為陰性對(duì)照。

1.2.6 臨床樣品的鑒別 取實(shí)驗(yàn)室保存的臨床收集或人工感染的12份來(lái)自豬的絳蟲(chóng)蚴樣品，分別提取基因組DNA，用mPCR對(duì)12份樣品進(jìn)行鑒別。

1.2.7 mPCR擴(kuò)增序列的驗(yàn)證 取4種絳蟲(chóng)蚴PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(710 bp、619 bp、542 bp和478 bp)，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用膠回收試劑盒純化的PCR產(chǎn)物分別與pMDTM19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Fast-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素(終濃度為100 μg/mL)、X-gal(終濃度為4 mg/mL)和IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)的LB平板上37 ℃培養(yǎng)14～16 h，挑白色單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定后送西安擎科生物公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 PCR引物的確定 4種絳蟲(chóng)特異性上游引物(TaF、EgF、ThF和TsF)分別與下游通用引物(TR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小分別為710 bp(亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴)、619 bp(細(xì)粒棘球蚴)、542 bp(細(xì)頸囊尾蚴)和478 bp(豬囊尾蚴)，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶(如圖2)，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的上游引物(EgF、TaF、ThF和TsF)是種特異性的，可對(duì)目標(biāo)蟲(chóng)體的DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增。其PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

M為DNA Marker DL1000；1為亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴；2為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)；3為細(xì)頸囊尾蚴；4為豬囊尾蚴；5為陰性對(duì)照?qǐng)D2 4種絳蟲(chóng)蚴的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of four metacestodes

2.2 mPCR方法的建立 4種絳蟲(chóng)蚴特異性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)結(jié)合下游引物(TR)，也分別擴(kuò)增出了預(yù)期大小的片段(710 bp、619 bp、542 bp、478 bp)，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶(如圖3)，說(shuō)明4組引物混合后，彼此間不存在相互影響，在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出各自對(duì)應(yīng)的目的片段。

M為DNA Marker DL1000；1為亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴；2為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)；3為細(xì)頸囊尾蚴；4為豬囊尾蚴；5為陰性對(duì)照?qǐng)D3 4種絳蟲(chóng)蚴的mPCR擴(kuò)增Fig.3 Multiplex PCR amplification of four metacestodes

2.3 mPCR特異性分析 將4種絳蟲(chóng)蚴基因組DNA每2種、3種和4種混合后作為模板，用4種特異性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)結(jié)合下游通用引物(TR)可分別擴(kuò)增出4種絳蟲(chóng)特異性片段(圖4)，說(shuō)明4種絳蟲(chóng)種特異性引物的特異性不受其他種DNA的干擾。

2.4 臨床樣品檢測(cè) 用已建立的mPCR方法，對(duì)12份臨床疑似絳蟲(chóng)蚴樣品進(jìn)行了鑒定。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖4)，待鑒定的12份樣品中分別擴(kuò)增出478 bp(豬囊尾蚴)片段1份、710 bp(亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴)片段3份、542 bp(細(xì)頸囊尾蚴)片段3份、619 bp(細(xì)粒棘球蚴)片段5份，而陰性對(duì)照樣品沒(méi)有擴(kuò)出任何條帶，說(shuō)明12份樣品中有1份豬囊尾蚴、3份亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、3份細(xì)頸囊尾蚴和5份細(xì)粒棘球蚴，而且mPCR結(jié)果與各個(gè)絳蟲(chóng)蚴的特異性引物所做的PCR結(jié)果相一致。表明所建立的mPCR方法可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小對(duì)豬的4種絳蟲(chóng)蚴進(jìn)行鑒定。

M為DNA Marker DL1000；1為4種絳蟲(chóng)蚴DNA混合樣品的陽(yáng)性對(duì)照；2為陰性對(duì)照；3,5,13為亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴；4,7,8,10,12為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)；9,11,14為細(xì)頸囊尾蚴；6為豬囊尾蚴圖4 12份絳蟲(chóng)蚴DNA樣品的mPCR鑒定Fig.4 Multiplex PCR identification of 12 metacestode DNA samples

2.5 PCR擴(kuò)增片段測(cè)序分析 PCR產(chǎn)物測(cè)序表明，亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴、豬囊尾蚴的擴(kuò)增片段大小分別為710、619、542 和478 bp，其序列與NCBI同源序列的一致性達(dá)99%以上，說(shuō)明PCR擴(kuò)增的各個(gè)絳蟲(chóng)蚴的片段即為設(shè)計(jì)的目的DNA片段。

3 討 論

李彥采用mPCR技術(shù)擴(kuò)增了人源3種絳蟲(chóng)HDP2基因序列，豬帶絳蟲(chóng)、亞洲帶絳蟲(chóng)分別擴(kuò)增出約150 bp和599 bp的條帶，而牛帶絳蟲(chóng)則擴(kuò)增出 150 bp 和 599 bp 的2條帶，從而根據(jù)PCR條帶的大小和帶數(shù)建立了區(qū)分人源3種絳蟲(chóng)的mPCR方法[12]。Jeon等[10]采用mPCR技術(shù)擴(kuò)增3種人源絳蟲(chóng)的tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因，擴(kuò)增豬帶絳蟲(chóng)(T.solium)、牛帶絳蟲(chóng)(T.saginata)和亞洲帶絳蟲(chóng)(T.asiatica)的基因分別產(chǎn)生478 bp、628 bp和710 bp的單一條帶；應(yīng)用該方法檢測(cè)糞便中的蟲(chóng)卵，檢測(cè)限為10 枚蟲(chóng)卵/1克糞便。以上2種方法已被應(yīng)用于3種人源絳蟲(chóng)的鑒別診斷。

González[13]應(yīng)用基于HDP2 基因片段的mPCR和rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和ITS2)的PCR-RFLP方法，可成功區(qū)分牛帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、豬囊尾蚴、細(xì)頸囊尾蚴和細(xì)粒棘球蚴。本研究中建立的4種豬源囊尾蚴mPCR方法較González的方法簡(jiǎn)單、省時(shí)、高效。筆者用DNAMAN對(duì)來(lái)自豬的4種絳蟲(chóng)蚴：豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴和細(xì)頸囊尾蚴的線(xiàn)粒體基因組進(jìn)行了比對(duì)分析，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)了4條種特異性上游引物和1條通用下游引物。其中，針對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、豬囊尾蚴的特異性引物較Jeon等設(shè)計(jì)的引物分別少3個(gè)堿基和1個(gè)堿基。因?yàn)镺ligo分析顯示，Jeon等設(shè)計(jì)的引物與細(xì)粒棘球蚴和細(xì)頸囊尾蚴有較高的錯(cuò)配率，從而導(dǎo)致PCR反應(yīng)的特異性較差。

本研究設(shè)計(jì)引物的靶基因與Jeon等[10]的完全相同，并且引物部分結(jié)合位點(diǎn)也相同，但特異性大大提高。如果用該引物進(jìn)行亞洲帶絳蟲(chóng)和豬帶絳蟲(chóng)鑒別診斷，推測(cè)其敏感性接近甚至超過(guò)Jeon等所建方法的檢測(cè)限(10枚蟲(chóng)卵/1g糞便)。但由于并未采集到絳蟲(chóng)患者的新鮮糞便，未進(jìn)行糞便中的蟲(chóng)卵檢測(cè)試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)，所以本研究中mPCR的敏感性不確定。我們認(rèn)為，該方法能夠有效的區(qū)分豬囊尾蚴、亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴、細(xì)粒棘球蚴和細(xì)頸囊尾蚴，在臨床豬囊尾蚴病檢驗(yàn)中具有重要意義，尤其在豬肝臟寄生絳蟲(chóng)蚴時(shí)，一定要將與豬囊尾蚴大小相近的亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴和細(xì)頸囊尾蚴的進(jìn)行鑒別診斷。因?yàn)槿唛g只是大小不同，一旦大小相近即使頭節(jié)壓片顯微鏡檢查也很難準(zhǔn)確鑒定。

當(dāng)然，本研究所建立的mPCR方法，只能用于豬剖檢后囊尾蚴病的輔助診斷。如果用PCR方法能檢測(cè)豬血清樣品中囊尾蚴的循環(huán)DNA，進(jìn)行豬囊尾蚴病的生前分子診斷，那這種mPCR方法將具有更大的實(shí)用性和現(xiàn)實(shí)意義。因?yàn)槟壳柏i囊尾蚴病的生前診斷主要依賴(lài)于血清抗體或抗原檢測(cè)，這些血清學(xué)檢測(cè)方法(如ELISA)往往在不同絳蟲(chóng)蚴間，甚至不同蠕蟲(chóng)間存在交叉反應(yīng)。而分子診斷即使靶基因有幾個(gè)堿基的差異，也可以通過(guò)檢測(cè)血清中的DNA進(jìn)行寄生蟲(chóng)的種間鑒別。越來(lái)越多學(xué)者開(kāi)始探索建立從血清中檢測(cè)絳蟲(chóng)DNA來(lái)檢測(cè)絳蟲(chóng)蚴感染的方法。Ramahefarisoa等比較了用ELISA檢測(cè)抗體和針對(duì)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶基因(COI)的血清PCR方法，認(rèn)為PCR檢測(cè)的特異性高，建議將其用于豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴病確診[14]。但Galán-Puchades等通過(guò)NCBI/BLAST和ClustalW進(jìn)行的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同帶絳蟲(chóng)種線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶基因的同源性高，認(rèn)為Ramahefarisoa等人獲得的結(jié)果可能只能證明帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)(蚴)的存在[15]。如果將我們建立的mPCR方法用于血清DNA的檢測(cè)，理論上可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬囊尾蚴病的生前鑒別診斷。目前，我們正在進(jìn)行豬囊尾蚴病血清中DNA的mPCR的檢測(cè)工作。

利益沖突：無(wú)