孫初陽，崔 磊，潘家興，王如敏，馬 焱，李丹丹

流感病毒是流行性感冒的病原體，主要以呼吸道為侵入門戶，發(fā)病率高、人群普遍易感,可在短時(shí)間內(nèi)引起人群大規(guī)模流行，是常見的急性呼吸道傳染病。流感病毒屬于正黏病毒科，流感病毒屬，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)4型[1]。甲型流感病毒易變異，人群對(duì)新的亞型普遍缺乏免疫力，易引起世界范圍的傳播和大流行，導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)，被WHO實(shí)行全球范圍監(jiān)測[2]。

A(H1N1)pdm09最早被稱為豬源H1N1流感病毒(Swine Origin Influenza A(H1N1)Virus, SOIV)。2009年在美國和墨西哥引起暴發(fā)，并引起全球性流感大流行疫情[3]，隨后A(H1N1)pdm09亞型季節(jié)性流感流行株，繼續(xù)在人群中流行。海南省2009年6月報(bào)告首例A(N1N1)pdm09亞型流感病毒輸入性確診病例，并于9月初首次報(bào)告省內(nèi)本地確診病例[4]，至今A(N1N1)pdm09亞型流感病毒在海南省已有10年流行史，很少見其遺傳變異和演化相關(guān)方面研究的報(bào)道。為進(jìn)一步了解海南省A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的遺傳變異情況和生物學(xué)特點(diǎn)，本文選取14株2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒進(jìn)行HA和NA基因序列分析，為闡明病原體的分子變異、流行變遷和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒來源 14株A(HIN1)pdm09亞型流感病毒來自2019-2020年海南省流感參比中心和4家流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。哨點(diǎn)醫(yī)院將采集的標(biāo)本送至對(duì)應(yīng)的流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，核酸檢測陽性的標(biāo)本，接種MDCK細(xì)胞和(或)9～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)血凝(HA)和血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)鑒定。跟據(jù)《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南(2017年版)》中規(guī)定流感監(jiān)測年度，本實(shí)驗(yàn)流感監(jiān)測年度時(shí)間為2019年4月1日至2020年3月29日。

1.2 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的序列測定和分析 血凝滴度≥8的病毒培養(yǎng)物委托上海伯杰生物科技有限公司進(jìn)行基因序列測定。MEGA 10.1.8軟件對(duì)測定序列與參考株進(jìn)行比對(duì)，采用鄰位歸并法(Neighbour-joining)分別構(gòu)建HA和NA基因進(jìn)化樹。從全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(GISAID)數(shù)據(jù)庫下載已公布的國內(nèi)其他省市代表株、北半球疫苗株和國際代表株為參考毒株，DNASTAR7.0.1軟件中MegAlign用于序列核苷酸和氨基酸同源性分析。

1.3 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的抗原性分析

抗原性分析使用標(biāo)準(zhǔn)參考抗原和標(biāo)準(zhǔn)參考抗血清由中國疾病預(yù)防控制中心提供，標(biāo)準(zhǔn)參考抗血清經(jīng)RDE(日本生研)處理，人“O”型血制備紅細(xì)胞懸液,抗原性分析中紅細(xì)胞凝集(HA)和紅細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)參考抗血清處理過程詳見《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南(2017年版)》。

1.4 試劑 病毒RNA提取試劑盒購于QIAGEN公司，RNA提取過程參照RNeasy Mini Kit試劑盒說明書。Real-time RT-PCR檢測試劑盒購于上海之江生物科技有限公司，反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和結(jié)果判定參見說明書。SPF雞胚購于濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒監(jiān)測情況 2019年4月至2020年3月海南省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室分離不同型別流感病毒共489株，A(H1N1)pdm09亞型、H3N2亞型、B型Victoria分別為24、145、320株。海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒與H3N2、B型Victoria亞型流感病毒共同流行，其中H3N2亞型和B型Victoria為優(yōu)勢毒株，A(H1N1)pdm09亞型流感病毒在人群中散發(fā)流行。

2.2 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因同源性分析 14株A(H1N1)pdm09亞型分離株與WHO推薦的北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)、A/Michigan/45/2015 (2017-2019)、A/California/07/2009(2010-2016)進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析顯示(表1)，海南省流感病毒分離株之間 HA 基因核苷酸同源性范圍是98.1%～100%，氨基酸同源性范圍是97.7%～100%。與疫苗株A/California/07/2009 HA基因核苷酸同源性范圍是95.9%～96.8%；氨基酸同源性范圍是95.1%～96.5%。與疫苗株A/Michigan/45/2015 HA基因的核苷酸同源性范圍是97.5%～98.6%；氨基酸同源性范圍是97.5%～98.8%。與疫苗株A/Brisbane/02/2018 HA基因核苷酸和氨基酸同源性范圍分別為98.5%～99.1%和97.7%～99.1%。

表1 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分析Tab.1 Analysis of HA gene nucleotide and amino acid homology of A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

2.3 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因特性分析 本年度按時(shí)間和地區(qū)分布選取14株A(H1N1)pdm09亞型流感病毒進(jìn)行HA基因序列測定并構(gòu)建核苷酸進(jìn)化樹(圖1)。HA基因進(jìn)化樹顯示，海南分離株與WHO推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)及國內(nèi)其他省市代表株在同一分支上，依據(jù)WHO命名方式[5-6]屬于6B.1分支。進(jìn)化樹上海南分離株與2019年國內(nèi)代表株進(jìn)化關(guān)系最近，在同一簇上，2016-2017年國內(nèi)參考株雖然與海南分離株在同一分支上，但單獨(dú)成簇。疫苗株A/California/07/2009(2010-2016)和國外參考毒株與海南分離株分屬不同分支進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。與疫苗株A/California/07/2009，A/Michigan/45/2015和A/Brisbane/02/2018相比，14株海南分離株氨基酸在S162N、K163Q、S164T有共同的變異位點(diǎn)，與疫苗株A/Brisbane/02/2018一致，S162N位點(diǎn)的變異增加了一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)[5]。另外有6株分離株189位氨基酸發(fā)生Q189E突變，1株N156K氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異(表2)。

表2 A(H1N1)pdm09亞型流感病毒血凝素基因(HA)抗原決定簇位點(diǎn)變異Tab.2 Antigenic determinant site variation of hemagglutinin in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

注：E.雞胚株；●海南省分離株；■疫苗株圖1 2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree for HA gene in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus from Hainan Province during 2019—2020

2.4 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒NA基因序列分析和進(jìn)化分析 海南分離株構(gòu)建NA基因核苷酸進(jìn)化樹與HA基因核苷酸進(jìn)化樹基本一致，分離株NA基因與疫苗株A/Brisbane/02/2018在相同分支6B.1上。流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感性的改變一般是由NA基因中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變引起[7]。與疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，本次研究中所有A(H1N1)pdm09亞型流感病毒中與神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥相關(guān)的9個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)E119、Q136、Y155、I223、S247、H275、R293、N295、Q313均未發(fā)生變異。

2.5 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒抗原性分析 根據(jù)HI效價(jià)8倍(含8倍)差異判斷[8]，14株海南分離株中，13株為A/Brisbane/02/2018類似株，1株為A/Brisbane/02/2018低反應(yīng)株。

3 討 論

海南省2009年9月初首次報(bào)告省內(nèi)A(H1N1)pdm09亞型流感病毒確診病例以來，A(H1N1)pdm09亞型流感病毒10年間呈持續(xù)散發(fā)流行態(tài)勢，已經(jīng)成為季節(jié)性流感主要亞型之一，為防止其再次引發(fā)疫情、危害人類健康和造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)A(H1N1)pdm09亞型流感病毒監(jiān)測工作。

甲型A(H1N1)pdm09亞型是新的重組型流感病毒，由于新亞型流感病毒表面抗原HA及NA易發(fā)生變異，可使病毒跨越宿主屏障，2009年引起本世紀(jì)首次流感大流行[9]。A(H1N1)pdm09亞型流感病毒基因組包含人、豬和禽流感病毒基因片段,表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸(NA)基因分別來源于古典豬支系及歐亞豬系[10-11]，HA基因可凝集多種動(dòng)物紅細(xì)胞，與細(xì)胞表面病毒特異性受體結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體等特性[12]。流感病毒有無感染性與HA前體(HA0)水解成HA1和HA2 2條多肽有關(guān),不同亞型流感病毒HA裂解位點(diǎn)的氨基酸數(shù)量不同，例如人H1亞型病毒只有1個(gè)精氨酸殘疾(R)裂解位點(diǎn)。本次研究的A(H1N1)pdm09亞型分離株裂解位點(diǎn)中氨基酸序列均呈現(xiàn)為 V321PSI324QSR↓GLFGA，即 HA 裂解位點(diǎn)中只含單個(gè)堿性氨基酸 R，附近未見多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸，屬于低致病性流感病毒特征[13]。

HA基因具有高度變異性[14]，抗原位點(diǎn)氨基酸的變異與流感病毒的抗原性密切相關(guān)。A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA1有 4 個(gè)抗原決定簇，即 Ca、 Cb、 Sa 和 Sb，其中Ca又分為Ca1和Ca2，共 32個(gè)抗原位點(diǎn)[15-16]。海南分離株共同的氨基酸變異位點(diǎn)NQT162-164位于抗原決定簇Sa上，變異位點(diǎn)E189位于Sb抗原決定簇，抗原性分析結(jié)果比對(duì)中這13株分離株是疫苗株(A/Brisbane/02/2018)的類似株，抗原性無明顯差異，NQT162-164和E189氨基酸位點(diǎn)變異均未影響其抗原性；Sb抗原決定簇上K156位點(diǎn)變異的分離株為低反應(yīng)株，推測K156位點(diǎn)的變異使A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的抗原性差異顯著。一般HA1蛋白分子2～3個(gè)抗原決定簇上發(fā)生4個(gè)以上氨基酸位點(diǎn)替換具有流行病學(xué)意義[2，17]，海南分離株中7株發(fā)生2個(gè)抗原決定簇(Sa和Sb)4個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，發(fā)生抗原漂移的分離株占50%，其余分離株未發(fā)生HA蛋白抗原漂移。根據(jù)流行株HA基因抗原位點(diǎn)變異情況，WHO推薦2019-2020年北半球流感疫苗組份時(shí)，將6B.1分支疫苗株A/Michigan/45/2015(2017-2019)更新成同一分支的A/Brisbane/02/2018，疫苗株匹配性高有更利于A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的防控。

海南分離株HA蛋白在第10、11、23、87、276、287、481、540位保持較穩(wěn)定的糖基化位點(diǎn)，僅在S162N位點(diǎn)增加了一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，一般認(rèn)為糖基化位點(diǎn)的改變或數(shù)目的增減會(huì)影響病毒的抗原性或?qū)Σ《镜姆€(wěn)定性、傳染性和致病性產(chǎn)生一定的影響。流感病毒主要通過抗原位點(diǎn)上氨基酸變異和HA糖基化的方式逃避宿主中和抗體的免疫壓力，使疫苗不能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)，從而造成疫苗免疫失敗[18]。

NA糖蛋白由RNA節(jié)段6編碼，其主要功能是清除唾液酸，破壞宿主細(xì)胞上HA受體，有利于病毒的釋放。NA酶活性中心序列高度保守，目前NA抑制劑研究主要是針對(duì)NA酶活性中心和周圍輔助的氨基酸位點(diǎn)[19]。NA氨基酸位點(diǎn)中275和195位點(diǎn)的變異將導(dǎo)致A(H1N1)pdm09亞型流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑磷酸奧司他韋敏感性降低[20-21]。2019-2020年海南分離株NA基因無氨基酸位點(diǎn)突變，對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感，磷酸奧司他韋敏對(duì)A(H1N1)pdm09亞型流感病毒仍是有效治療藥物。

海南分離株之間氨基酸和核苷酸序列高度同源，說明本地分離株之間變異小親緣關(guān)系近。在HA基因和NA基因進(jìn)化分析中，國內(nèi)參考株在HA基因和NA基因進(jìn)化樹中基本按年份進(jìn)化分布，沒有呈現(xiàn)明顯的地理分布,說明海南分離株與國內(nèi)代表株年份差異大于地域差異。

綜上所述，2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒與WHO推薦的疫苗株同源性高，流感疫苗和磷酸奧司他韋敏能夠?qū)Ｄ鲜(H1N1)pdm09亞型流感病毒起到有效的預(yù)防和治療作用，但仍需加強(qiáng)A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的監(jiān)測，及時(shí)掌握分子流行病學(xué)資料，為A(H1N1)pdm09亞型流感病毒防控提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無