鄧思波，黃敏慧，張迎春，李彩多，吳建偉，陳崢宏，王 濤

白念珠菌(Candidaalbicans)是常見的條件致病性真菌，當(dāng)機(jī)體菌群失調(diào)、免疫功能降低或機(jī)體處于應(yīng)激、嚴(yán)重感染時(shí)，可導(dǎo)致皮膚黏膜感染或侵襲性真菌感染的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，C.albicans所致的侵襲性感染的死亡率高達(dá)60%[1-2]?？拐婢幬锏氖褂脤φ婢腥拘约膊〉目刂破鸬搅酥匾饔?，但隨著耐藥菌株的不斷增加，耐藥性已成為臨床抗真菌感染治療失敗的重要原因。C.albicans在生長繁殖的過程中，不但能以浮游狀態(tài)存在，還可以形成生物膜(biofilm)[3-4]，而生物膜的形成是導(dǎo)致C.albicans產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一。文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，生物膜狀態(tài)C.albicans對臨床常用抗菌藥物的耐受性較浮游菌顯著增強(qiáng)。因此，尋找新型藥物抑制或破壞生物膜已成為臨床抗真菌治療的必然要求。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是機(jī)體抵抗細(xì)菌、真菌、病毒等多種病原體感染的小分子先天免疫功能多肽。由于AMPs抗病原微生物范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性、低毒等特性，具備新型抗菌藥物開發(fā)的潛力[7-8]。家蠅抗真菌肽-1A (Musca domestica antifungal peptide-1A，MAF-1A) 是來源于家蠅幼蟲的小分子陽離子活性多肽，課題組以MAF-1A的氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用氨基酸分子突變法設(shè)計(jì)獲得了一個(gè)MAF-1A衍生物。前期研究表明[9]，MAF-1A衍生物是一種穩(wěn)定性高、抗菌活性強(qiáng)的人工合成AMPs，其不僅對C.albicans浮游菌的抑殺效果優(yōu)于其模板肽MAF-1A，且對C.albicans生物膜也具有明顯抑制作用，但該衍生物對C.albicans生物膜抑制活性及作用機(jī)制尚不清楚。本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討MAF-1A衍生物的抗C.albicans生物膜活性和作用機(jī)制，為抗生物膜藥物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 MAF-1A衍生物的化學(xué)合成 MAF-1A衍生物的氨基酸序列為 KKFLKTAKLLIKSALLLLKSLALKMK，委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用FMOC固相合成法合成，高效液相色譜(HPLC)純化、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)驗(yàn)證，多肽合成純度≥98%。

1.1.2 菌株 白念珠菌(Candidaalbicans，ATCC10231)由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司; RNAiso Plus試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)均購自TaKaRa(大連)有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar, SDA)、酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Peptone Dextrose, YPD)液體培養(yǎng)基、氟康唑(FLC)、兩性霉素B(AMB)、活性氧(ROS)檢測試劑盒、FITC-Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自Solarbio(北京)有限公司；JC-1線粒體膜電位測定試劑盒購自MCE(上海)有限公司。

1.1.4 引物合成 使用SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物序列，并在NCBI上進(jìn)行引物序列比對，選擇特異性引物序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成生物膜形成相關(guān)基因(ALS3、HWP1、SUN41、UME6)和內(nèi)參基因(ACT1)引物，相關(guān)引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for Quantitative Real-time PCR

1.2 方法

1.2.1 菌株活化及菌懸液制備 無菌操作下取C.albicans凍存物劃線接種于SDA 平板，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后，挑取菌株單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min震搖培養(yǎng)16 h；離心收集菌體，用無菌PBS洗滌2次，以RPMI 1640培養(yǎng)基制成2×106CFU/mL菌懸液備用。

1.2.2 MAF-1A衍生物抗C.albicans活性檢測 參考CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)M27-A3方法[10]，采用微量稀釋法檢測MAF-1A衍生物的抗C.albicans最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)以及最小殺菌濃度(minimum fungal concentration，MFC)；參考文獻(xiàn)[11]，用XTT法檢測MAF-1A衍生物對C.albicans生物膜80%的抑制濃度(SMIC80)，同時(shí)以FLC(4 μg/mL)為藥物對照。

1.2.3 MAF-1A衍生物對生物膜形成的影響

1.2.3.1 衍生物對C.albicans黏附的影響 將衍生物與菌液(2×106CFU/mL)各100 μL混合于96孔板中，使MAF-1A衍生物終濃度分別為0、62.5、125、250、500和1 000 μg/mL；混合液37 ℃孵育2 h后，于倒置顯微鏡下觀察白念珠菌黏附情況；參考文獻(xiàn)[12]，采用XTT法檢測其生物活性。同樣方法作FLC(4 μg/mL)為藥物對照。

1.2.3.2 MAF-1A衍生物對C.albicans菌絲形成的影響 將100 μL菌液(2×106CFU/mL)置于96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h后，用無菌PBS洗去浮游菌；加入終濃度分別為0、62.5、125、250和500 μg/mL的MAF-1A衍生物100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，棄上清液，無菌PBS洗滌2次，倒置顯微鏡下觀察菌絲形成情況。同樣方法以FLC(4 μg/mL)為藥物對照。

1.2.4 MAF-1A衍生物對生物膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 將1 mL MAF-1A衍生物與等體積菌懸液(2×106CFU/mL)混勻，使MAF-1A衍生物的終濃度分別為0、62.5、125和250 μg/mL，將混合液于37 ℃培養(yǎng)24 h后，5 000 r/min離心5 min收集菌體；參照RNAiso Plus和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書, 提取菌細(xì)胞 Total RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；參考文獻(xiàn)[13]，使用 qRT-PCR 反應(yīng)試劑盒以管家基因ACT1為內(nèi)參, 采用2-ΔΔCt法對C.albicans生物膜形成相關(guān)基因 mRNA 水平進(jìn)行相對定量。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 MAF-1A衍生物抗成熟生物膜活性 將200 μL菌液(2×106CFU/mL)置于96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h后，無菌PBS洗去浮游菌，加入RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄上清液，無菌PBS洗滌3次，獲得C.albicans成熟生物膜；向成熟生物膜加入終濃度分別為0、62.5、125、250、500和1 000 μg/mL的MAF-1A衍生物200 μL，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，無菌PBS洗滌2次，參考文獻(xiàn)[12]，以XTT法檢測生物膜活性；采用掃描電鏡觀察衍生物對成熟生物膜結(jié)構(gòu)的影響。同樣方法以FLC(4 μg/mL)為藥物對照。

1.2.6 生物膜細(xì)胞凋亡檢測 將MAF-1A衍生物(終濃度分別為0、62.5、125和250 μg/mL)處理24 h后的C.albicans成熟生物膜細(xì)胞重懸于400 μL Annexin V結(jié)合液，加入Annexin V-FITC染液5 μL，混勻后于37 ℃避光孵育15 min，再加入PI染液10 μL繼續(xù)孵育5 min；采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察生物膜細(xì)胞凋亡。同樣方法以AMB(2 μg/mL)為藥物對照。

1.2.7 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平檢測 以終濃度為0、62.5、125、250和500 μg/mL的MAF-1A衍生物分別處理C.albicans成熟生物膜24 h后，按試劑盒說明加入DCFH-DA熒光試劑，于37 ℃避光孵育20 min后，無菌PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.8 線粒體膜電位檢測 以終濃度為0、62.5、125、250和500 μg/mL的MAF-1A衍生物分別處理C.albicans成熟生物膜24 h后，按試劑盒說明加入JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育15 min，無菌PBS洗滌2次，多功能酶標(biāo)儀檢測JC-1的熒光轉(zhuǎn)變，通過計(jì)算FL2/FL1比值得出線粒體膜電位的變化。

2 結(jié) 果

2.1 MAF-1A衍生物抗C.albicansATCC10231活性 檢測結(jié)果顯示，MAF-1A衍生物對C.albicans浮游菌的MIC為62.5 μg/mL，MFC為125 μg/mL；對C.albicans生物膜的SMIC80為62.5～125 μg/mL。而其模板肽對C.albicans的MIC、MFC和SMIC80值均高于MAF-1A衍生物，分別為600 μg/mL、800 μg/mL以及 1 000 μg/mL。

2.2 MAF-1A衍生物減少C.albicansATCC-10231的黏附 鏡下可見，當(dāng)濃度達(dá)250 μg/mL時(shí)，MAF-1A衍生物可明顯降低C.albicans的黏附(圖1)及其生物活性(t=3.680，P<0.05)，并且這一作用隨MAF-1A衍生物濃度增加而更加明顯(圖2)。

MAF-1A衍生物濃度為A: 0 μg/mL; B: 62.5 μg/mL; C: 125 μg/mL; D: 250 μg/mL; E: 500 μg/mL; F: 為FLC對照4 μg/mL圖1 MAF-1A衍生物對白念珠菌黏附的影響(×200)Fig.1 Effects of MAF-1A derivatives on the adhesion of C. albicans (×200)

2.3 MAF-1A衍生物對C.albicansATCC10231菌絲形成的影響 鏡下可見，陰性對照組的C.albicans可以正常形成菌絲，其菌絲較多，菌絲細(xì)長、縱橫交錯(cuò)；但62.5μg/mL的MAF-1A衍生物即可明顯抑制C.albicans菌絲的形成，且隨著濃度的增加，C.albicans菌絲明顯變短、稀疏，甚至不能形成菌絲(圖3)。

2.4 MAF-1A衍生物下調(diào)白念珠菌生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示(圖4)，與未經(jīng)處理的對照組相比，62.5 μg/mL 的MAF-1A衍生物即可使生物膜形成相關(guān)基因UME6、ALS3、SUN41、HWP1的mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(tUME6=12.42，P<0.001；tALS3=12.20，P<0.001；tSUN41=7.206，P<0.001；tHWP1=22.52，P<0.001)。

2.5 MAF-1A衍生物抗C.albicansATCC10231成熟生物膜活性 通過掃描電鏡觀察可見，未經(jīng)MAF-1A衍生物處理的成熟生物膜結(jié)構(gòu)完整，生物膜細(xì)胞未出現(xiàn)破損現(xiàn)象，細(xì)胞外基質(zhì)豐富；但濃度為62.5 μg/mL的MAF-1A衍生物作用后，即可導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，生物膜細(xì)胞皺縮溶解，菌絲斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)減少(圖5)。成熟生物膜活性檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MAF-1A衍生物濃度為500 μg/mL時(shí)，與未經(jīng)處理組相比，成熟生物膜的生物活性明顯降低(t=1.19,P<0.05)(圖6)。

注：①代表與陰性對照相比P<0.05，②代表與陰性對照相比P<0.01圖2 MAF-1A衍生物對白念珠菌黏附期生物活性的影響Fig.2 Effect of MAF-1A derivatives on the biological activity of C. albicans in the adhesion stage

MAF-1A衍生物濃度為A: 0 μg/mL; B: 62.5 μg/mL; C: 125 μg/mL; D: 250 μg/mL; E: 500 μg/mL; F: 為FLC對照4 μg/mL圖3 MAF-1A衍生物對白念珠菌菌絲形成的影響 (×200)Fig.3 Effect of MAF-1A derivatives on the formation of C. albicans hypha (×200)

注：①與陰性對照相比P<0.001圖4 MAF-1A衍生物對白念珠菌生物膜形成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of MAF-1A derivatives on mRNA expression of genes related to biofilm formation in C. albicans

2.6 MAF-1A衍生物誘導(dǎo)C.albicansATCC10231成熟生物膜細(xì)胞凋亡 激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示：與陰性對照相比，經(jīng)不同濃度的MAF-1A衍生物處理之后，生物膜細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻，生物膜細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，細(xì)胞膜的完整性被破壞，成熟生物膜中凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多(圖7)。

2.7 MAF-1A衍生物對C.albicansATCC10231生物膜細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 經(jīng)不同濃度的MAF-1A衍生物處理后，生物膜細(xì)胞內(nèi)ROS的含量較陰性對照均明顯增加，且隨著MAF-1A衍生物濃度的增加，生物膜細(xì)胞內(nèi)的ROS含量不斷增加(圖8)。

2.8 對C.albicansATCC10231生物膜細(xì)胞線粒體膜電位的影響 經(jīng)不同濃度的MAF-1A衍生物處理之后，線粒體膜電位較陰性對照組明顯降低(t62.5=17.59、t125=33.26、t250=35.48、t500=41.27, 均P<0.000 1)(圖9)，且隨著MAF-1A衍生物濃度的增加，線粒體膜電位也隨之降低，呈濃度依賴性。

MAF-1A衍生物濃度為A: 0 μg/mL; B: 62.5 μg/mL; C: 125μg/mL; D: 250 μg/mL; E: 500 μg/mL; F: 為FLC對照 4 μg/mL；1表示: ×500；2表示: ×5 000圖5 MAF-1A衍生物對白念珠菌成熟生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of MAF-1A derivatives on the morphological structure of mature biofilm of C. albicans

注：①與陰性對照相比P<0.05；②與陰性對照相比P<0.01圖6 MAF-1A衍生物對白念珠菌成熟生物膜活性的影響Fig.6 Effect of MAF-1A derivatives on the mature biofilm activity of C. albicans

MAF-1A衍生物濃度為A: 0 μg/mL; B: 62.5 μg/mL; C: 125 μg/mL; D: 250 μg/mL; E: 為 AMB對照 2 μg/mL圖7 CLSM檢測白念珠菌成熟生物膜細(xì)胞凋亡Fig.7 Detection of cell apoptosis in mature biofilms of C. albicans by CLSM

MAF-1A衍生物濃度為A: 0 μg/mL; B: 62.5 μg/mL; C: 125 μg/mL; D: 250 μg/mL; E: 500 μg/mL; F: 為AMB對照 2 μg/mL圖8 白念珠菌成熟生物膜細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測Fig.8 Detection of ROS in mature biofilm cells of C. albicans

注：cccp為氧化磷酸化解偶聯(lián)劑(陽性對照)，分子式為C9H5ClN4，④與陰性對照相比P<0.000 1圖9 MAF-1A衍生物對成熟生物膜細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.9 Effect of MAF-1A derivatives on mitochondrial membrane potential of mature biofilm cells

3 討 論

C.albicans在機(jī)體內(nèi)及物體表面常以生物膜的形式存在，生物膜的形成可以提高C.albicans的環(huán)境適應(yīng)能力和耐藥性，導(dǎo)致C.albicans疾病治療的難度增加，目前臨床抗C.albicans治療失敗的一個(gè)重要原因是生物膜的形成[14]。因此，迫切需要能夠有效抑制生物膜的新型抗真菌藥物。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AMPs除具有廣譜高效的抗菌活性外，對多重耐藥微生物的生物膜也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑殺活性[15-17]，因此，AMPs作為新型抗生物膜制劑的研究已引起國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[16-18]。本研究結(jié)果顯示，MAF-1A衍生物對C.albicans的MIC、MFC及 SMIC80為62.5 μg/mL、125 μg/mL和62.5 μg/mL均小于模板肽，結(jié)果表明MAF-1A衍生物對C.albicans浮游菌和生物膜具有抑殺活性，且抑殺效果優(yōu)于模板肽，提示其具有抗生物膜藥物開發(fā)的研究價(jià)值。

C.albicans生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹菌體、假菌絲、菌絲形成的具有三維立體結(jié)構(gòu)的微生物群落，其形成大致分為黏附(1～2 h)、菌絲形成(2～18 h)、成熟(24～72 h)3個(gè)階段[19-20]。由此可見，C.albicans細(xì)胞對物體表面的粘附和菌絲的形成是生物膜形成的關(guān)鍵。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，MAF-1A衍生物可明顯減少C.albicans的黏附和菌絲的形成，且作用呈劑量依賴性，表明MAF-1A衍生物可以通過抑制菌體黏附和菌絲形成而阻止生物膜形成。文獻(xiàn)報(bào)道，ALS3、HWP1所編碼的蛋白與C.albicans細(xì)胞的黏附密切相關(guān)，而SUN41，UME6的編碼產(chǎn)物有促進(jìn)C.albicans菌絲形成的作用[21-24]。本實(shí)驗(yàn)用qRT-PCR 方法檢測了MAF-1A衍生物上述基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果表明，相較于陰性對照，MAF-1A衍生物可使上述基因的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.000 1)，從而影響相應(yīng)蛋白的表達(dá)，提示MAF-1A衍生物可能通過降低C.albicans細(xì)胞黏附及菌絲形成相關(guān)基因的表達(dá)來抑制生物膜的形成。

實(shí)驗(yàn)研究證明，AMPs不僅能通過抑制微生物細(xì)胞黏附等方式以干擾生物膜的早期形成，少數(shù)AMPs還能通過殺死生物膜細(xì)胞或使生物膜細(xì)胞脫落的方式來破壞成熟生物膜[25-26]。掃描電鏡結(jié)果顯示，MAF-1A衍生物作用后，生物膜細(xì)胞皺縮溶解，菌絲斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)稀少，當(dāng)MAF-1A衍生物的濃度為500 μg/mL時(shí)，C.albicans成熟生物膜的生物活性明顯降低(t=1.19,P<0.05)，表明MAF-1A衍生物可殺傷生物膜內(nèi)的C.albicans細(xì)胞，提示MAF-1A衍生物可以破壞成熟生物膜。

文獻(xiàn)報(bào)道，AMB等抗真菌化學(xué)藥物及AMPs均可誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞凋亡[27-29]。本研究在進(jìn)一步探討MAF-1A衍生物破壞成熟生物膜的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，MAF-1A衍生物作用后，C.albicans成熟生物膜細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻，生物膜細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，細(xì)胞膜的完整性被破壞，而在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志[30-31]，結(jié)果表明MAF-1A衍生物可以誘導(dǎo)成熟生物膜細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS失衡已被證明是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟之一，細(xì)胞內(nèi)ROS的積累在酵母細(xì)胞凋亡中起著重要作用[30,32]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MAF-1A衍生物作用后，成熟生物膜細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯增加，且呈劑量依賴性，表明MAF-1A衍生物能通過提高成熟生物膜細(xì)胞內(nèi)ROS含量，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體在C.albicans的正常代謝活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，由于細(xì)胞氧化應(yīng)激可引起線粒體膜去極化，導(dǎo)致線粒體功能障礙，功能受損的線粒體可以通過caspase等途徑引起細(xì)胞凋亡[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于陰性對照，MAF-1A衍生物可明顯降低線粒體膜電位(t62.5=17.59、t125=33.26、t250=35.48、t500=41.27,P<0.000 1)，使線粒體膜電位去極化，提示MAF-1A衍生物可能通過線粒體損傷機(jī)制引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，MAF-1A衍生物不僅可以通過抑制細(xì)胞黏附、菌絲形成來干擾C.albicans生物膜的早期形成，還能通過直接損傷及ROS累積、線粒體膜電位去極化所引發(fā)的細(xì)胞凋亡來破壞C.albicans成熟生物膜，提示 MAF-1A衍生物是通過多途徑發(fā)揮抗生物膜效應(yīng)，但其抗生物膜作用的關(guān)鍵機(jī)制及具體途徑尚需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)研究為該衍生肽的深入研究和開發(fā)、利用奠定了基礎(chǔ)，為抗生物膜藥物的研發(fā)提供參考。

利益沖突：無