徐美鑫 張瀾 相茂花

（日照市場監(jiān)管檢驗檢測中心 山東日照276800）

1 前言

實驗室引入標準方法前，應對其能否正確運用這些方法的能力進行驗證，并保存驗證記錄。驗證不僅需要識別相應的人員、設施、環(huán)境、設備等條件是否滿足要求，還應通過試驗證明該方法可以滿足標準的要求。因此，實驗室在將方法引入檢測之前，應從“人”“機”“料”“法”“環(huán)”等方面驗證其是否有能力按照標準方法開展檢測活動。例如，人員是否經(jīng)過有效培訓并具備相關知識和能力；儀器設備是否滿足標準要求，并處于檢定或校準的有效期內；標準物質和關鍵試劑是否符合標準要求；設施和環(huán)境條件是否滿足標準要求；檢驗原始記錄是否規(guī)范、適用等，且應當附有證明記錄。在滿足上述條件之后，還應通過試驗證明結果的準確性和可靠性。

因此，一份合格的方法驗證報告不僅是實驗室具備開展檢測資質能力的證明，同時也能夠證明檢測結果的可靠性和準確性。本文按照RB/T《基因擴增檢測方法確認與驗證指南》要求，以雞源性成分為例研究了GB/T 38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》方法驗證的具體執(zhí)行方式及各參數(shù)的評價方法，有助于實驗室技術人員更好地理解方法驗證，并給予基因擴增檢測領域的方法驗證工作的一些參考。

2 材料

2.1 試驗樣品

現(xiàn)殺整雞、雞胸肉、雞腿、鹵雞爪、烤翅中、炸雞叉骨、鹵雞肝、雞肉火腿腸、陽光玉米腸、加鈣火腿腸、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、玉米、大豆、花生均為超市購買。

2.2 主要試劑

動物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒（DP323-02）（天根生化）。

雞種特異性基因測定試劑盒（熒光PCR法）（上海之江）。

2.3 主要儀器

高速冷凍離心機（賽默飛Micro17R）；超微量紫外分光光度計（mettler UV5Nano）；熒光定量PCR儀（lightCycler 96）；微量移液器：10μL、100μL、1 000 μL（eppendorf）。

3 方法

3.1 方法驗證參數(shù)

按照RB/T 032-2020《基因擴增檢測方法確認與驗證指南》要求，并參考RB/T 004-2019《轉基因檢測方法驗證指南》[2]，以雞源性成分為例研究GB 38164-2019《常見畜禽動物源性成分》方法驗證，驗證了該方法的DNA提取效果評價、重復性、檢出限和基質效應。

3.2 DNA提取質量

使用DNA提取試劑盒對現(xiàn)殺整雞進行DNA提取，PCR體系配制及反應參數(shù)按照雞種特異性基因測定試劑盒進行操作。

以雞的DNA提取物為起始工作液，并將此工作液進行4倍系列稀釋（1∶4、1∶16、1∶64、1∶256），獲得4份稀釋液。將這5份DNA樣品溶液進行擴增分析，每個濃度做2個PCR平行試驗，以稀釋因子的對數(shù)值為橫坐標（即-lg1/4、-lg1/16、-lg 1/64、-lg1/256），對應的平均Ct值為縱坐標，得出斜率、線性相關系數(shù)、ΔCt值（起始工作液測量Ct值與通過標準曲線外推法獲得的定量循環(huán)數(shù)的差值）。

3.3 重復性

對于基因擴增反應來說，方法的重復性的評估采用同一實驗室檢測相同樣品，獲得相同結果的比率表征。在同一實驗室由同一操作者，檢測條件和日常檢測一致，對同一樣品（現(xiàn)殺整雞）進行DNA提取，平行提取2次；以雞的DNA提取物為起始工作液進行系列稀釋至10%、1%、0.5%、0.2%、0.1%（含有接近檢出限水平），將每個稀釋液進行4個平行PCR擴增；重復試驗1次，每個稀釋液得到16個獨立測量的結果。

3.4 檢出限

使用終點稀釋法，對雞的DNA提取物進行系列稀釋至10%、1%、0.5%、0.2%、0.1%，進行PCR擴增，5%以上樣品檢測不到目標物的稀釋濃度就是該方法的檢出限。

3.5 基質效應

對于定性方法，采用了未加工過、初加工的和深加工過的雞制品等10份作為陽性樣本，用其他禽類、畜類和植物類等10份為陰性樣本，進行PCR擴增。

4 結果與分析

4.1 DNA提取效果評價

抑制PCR反應的物質可以通過與DNA模板反應、干擾DNA聚合酶活性或降低聚合酶輔助因子（Mg2+）的效率而影響目標DNA擴增的效率。DNA提取步驟可以在很大程度上消除或降低PCR抑制物的量，因此DNA提取效果可以用檢測DNA提取物中抑制劑的方式進行評價。

RB/T 032-2020《基因擴增檢測方法確認與驗證指南》要求，以稀釋因子的對數(shù)值為橫坐標（即-lg1/4、-lg1/16、-lg1/64、-lg1/256），對應的平均Ct值為縱坐標，繪制的標準曲線斜率在-3.6到-3.1之間，線性相關系數(shù)大于0.98；工作液推導Ct值與測量Ct之差ΔCt值小于0.5；即說明DNA提取物中無抑制劑影響。

如圖1和表1所示，曲線斜率為-3.3461，相關系數(shù)R2為0.99，工作液推導Ct值與測量Ct之差ΔCt為0.11小于0.5，滿足RB/T 032-2020的要求[1]。證明天根生化的動物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒提取的產(chǎn)物不含抑制劑，提取效果合格，可以用于PCR擴增反應。

表1 DNA提取物中抑制劑檢測

圖1 4個系列稀釋的標準曲線

4.2 重復性

重復性是指實驗室內精密度，即同一實驗室在相同條件下獲得一系列結果的一致性程度。采用相對重復性標準偏差（RSDr）來衡量精密度工具，當RSD≤25%時證明重復性較好。

如表2所示，含量為0.1%和0.01%雞種DNA樣品未能全部測出Ct值，其余4個濃度均能測出，且相對重復性標準偏差RSDr值分別為1.35%、1.32%、1.63%、1.58%，均＜25%，證明其重復性較好。

表2 重復性試驗結果

4.3 檢出限

通過量化樣品中核酸的最小檢測量來評估檢出限，如通過已知濃度的被分析物標準品進行有限稀釋獲得。當缺乏已知濃度的標準品時，可使用終點稀釋法，對目標分析物進行系列稀釋，直到該稀釋度中5%以上樣品檢測不到目標物，此時的稀釋濃度就是方法檢出限。

不同含量的雞種DNA樣品16個檢測結果見表2。結果顯示：含量為0.01%的樣品絕大多數(shù)未檢出且擴增曲線不明顯；含量為0.1%的雞種DNA樣品有1個未檢出目的基因，占整個樣品的6.25%；故0.1%為該方法的檢出限，滿足GB/T 38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》中雞源性成分的檢出限1%的要求。

4.4 基質效應

對于定性方法，采用了未加工過的現(xiàn)殺整雞、雞胸肉、雞腿；初加工的鹵雞爪、烤翅中、炸雞叉骨、鹵雞肝；深加工過的雞肉火腿腸、陽光玉米腸和加鈣火腿腸等10份作為陽性樣本，用近緣的禽類鴨肉、鵝肉、鴿子肉；畜類豬肉、牛肉、羊肉、馬肉；植物類玉米、大豆、花生等10份為陰性樣本，進行PCR擴增。

結果見圖2，雞肉及其制品的陽性樣本均有明顯的擴增曲線，而其他陰性樣本則無擴增曲線，與預期相符。使用上海之江的雞種特異性基因測定試劑盒具有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應，可以忽略基質效應對未知樣品檢測結果的影響。

圖2 20種樣本的實時熒光PCR擴增圖譜

5 結論

本文通過實例闡述了GB/T 38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》的方法驗證。驗證結果表明：DNA提取效果良好，不存在抑制劑；該方法重復性較好；基質效應無影響；檢出限為0.1%，均滿足GB/T 38164-2019的要求。證明實驗室可以按照GB/T 38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》開展動物源性成分檢測[3]，同時本文也為相關檢測機構進行方法驗證提供了參考。