黃 晗，唐源英，陳祉瀟，李偉英,2，周 為,2,*

(1.同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2.長江水環(huán)境教育部重點實驗室<同濟大學(xué)>，上海 200092)

飲用水的安全對人體的健康十分重要，不安全的飲用水可能會導(dǎo)致嚴重的急性或慢性的水傳播疾病[1]，對人類健康構(gòu)成威脅。研究表明，飲用水中存在的微生(如病原微生物)可能會導(dǎo)致介水疾病的傳播[1-4]。因此，飲用水水質(zhì)微生物安全的研究具有重要意義。

傳統(tǒng)的細菌分類標準基于細菌的形態(tài)和生理特性，在進行鑒定時需對細菌純培養(yǎng)后再從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和生理生化特性等方面進行分類，但該方法的細菌培養(yǎng)時間較長、靈敏度較低以及鑒定的特異性不足，且無法檢測水中活的但不可培養(yǎng)的細菌(viable but non-culturable bacteria, VBNC)[5-7]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以16S rRNA為代表的基因測序技術(shù)逐漸被應(yīng)用于飲用水微生物多樣性的研究。本文將基于16S rRNA基因的特點、分析技術(shù)及其基本原理的發(fā)展進程，從水源水質(zhì)、水處理工藝以及供水管網(wǎng)特性等方面探討其對末梢水中微生物多樣性的影響，總結(jié)了飲用水全流程對末梢水微生物多樣性影響的特點，為建立水質(zhì)與微生物多樣性的關(guān)系提供參考依據(jù)，為其在飲用水中微生物檢測的廣泛應(yīng)用提供支撐，最后對該技術(shù)在飲用水微生物多樣性研究的應(yīng)用進行了展望。

1 16S rRNA基因測序技術(shù)的發(fā)展歷程

基因測序技術(shù)的發(fā)展進程集中于近50年(圖1)。基于由Sanger和Coulson開創(chuàng)的鏈終止法以及1976年—1977年Maxam和Gibert提出的DNA測序的化學(xué)降解法，Sanger于1977年完成了噬菌體ΦⅩ174全基因組測序，發(fā)明了雙脫氧鏈終止法，即第一代測序(first-generation sequencing)方法。第一代測序的主要特點是測序讀長可達1 000 bp，準確性高達99.999%，然而，其存在測序成本高、通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用[8-10]。2005年，經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進，產(chǎn)生了以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標志的第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)。與第一代Sanger測序相比，第二代具有通量高[11]、測序快等優(yōu)勢，大幅降低了測序成本，擴大了基因組學(xué)研究的規(guī)模[12]。然而，第二代測序技術(shù)仍然存在讀長較短、價格昂貴的缺點。2008年之后，PacBio公司的單分子實時(single molecule real time, SMRT)測序技術(shù)和Helicos Biosciences公司的Heliscope遺傳分析系統(tǒng)即第三代測序技術(shù)被相繼發(fā)明。與前兩代相比，其最大的特點就是讀長較長、成本較低、速度快、無需進行PCR擴增，但仍然存在準確性不高的缺點，目前未能在飲用水配水流程的微生物多樣性研究中較為廣泛地應(yīng)用。第四代測序技術(shù)以O(shè)xford Nanopore Technologies公司的納米孔測序技術(shù)為代表。四代測序技術(shù)的優(yōu)缺點及部分平臺如表1與表2所示。

表1 16S rRNA測序技術(shù)

圖1 測序技術(shù)的發(fā)展進程

表2中的測序平臺和測序儀器均來自國外的生物公司，目前，在我國的飲用水微生物多樣性分析領(lǐng)域，依然主要使用這些設(shè)備和相應(yīng)的技術(shù)。在基因測序設(shè)備幾乎被國外壟斷的局面下，我國也在通過自主研發(fā)、聯(lián)合研發(fā)以及收購國外公司的方式發(fā)展本國的基因測序設(shè)備[27]，如華因康開發(fā)的基因測序儀HYK-PSTAR-IIA、中科紫鑫的測序儀BIGIS-4等。在基因測序設(shè)備研發(fā)上我國已取得一些成效，部分儀器在一些測序結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性上可以與國外儀器相當[28]。但是目前基于國內(nèi)設(shè)備和技術(shù)的研究較少，其在飲用水微生物中的應(yīng)用也較少，暫時無法進行更全面的分析。

表2 16S rRNA部分測序平臺

2 16S rRNA基因測序在飲用水中的應(yīng)用

2.1 16S rRNA在水源微生物多樣性的研究應(yīng)用

地表淡水(如湖泊、河流等)中的飲用水水源隨著人口增加和城市化進程的建設(shè)，受污水、有毒化學(xué)物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)以及由此產(chǎn)生的有害水華的影響，水源水質(zhì)污染加劇，增加了飲用水處理工藝的難度與成本。水源水質(zhì)的優(yōu)劣對后續(xù)處理后水中微生物的存在水平及其多樣性影響較大。

葛英亮等[29]使用Illumina MiSeq對水源水水樣中病毒基因組進行測序，與數(shù)據(jù)庫進行比對獲得基因數(shù)據(jù)，分析了飲用水源水中病毒的多樣性，可為水體中病毒的檢測提供理論上的參考依據(jù)。張明露等[30]采用基于16S rRNA的焦磷酸測序技術(shù)，對丹江口水庫水和北京地區(qū)4個水源水總微生物進行了分析，結(jié)果顯示丹江口水庫水和北京地區(qū)水源水細菌群落的差異大，且pH、氨氮等對水樣中細菌群落影響較大。Gomez-Alvarez等[31]研究了地下水與地表水對供水管網(wǎng)中微生物多樣性的影響，多變量分析表明兩區(qū)域之間存在顯著差異，多樣性指數(shù)研究表明地表水源供水管網(wǎng)中的微生物群落多樣性比地下水源的高，且包含更多的與當?shù)匚⑸锶汗泊娴倪h緣物種，源水水質(zhì)參數(shù)可能是群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

Mukherjee等[32]使用基于16S rRNA基因的焦磷酸測序方法，對西半球中部高原農(nóng)村地區(qū)水源和末梢水進行了研究，結(jié)果顯示水源水與末端水中的細菌群落顯著不同，且水源中致病菌可能會影響龍頭水水質(zhì)，而龍頭水與水源細菌群落的差異性也說明凈水工藝和供水管網(wǎng)對用水水質(zhì)的影響。

不同水源水中的微生物的優(yōu)勢菌群存在差異。張明露等[30]對丹江口水庫和北京地區(qū)兩個水源水的測序結(jié)果表明，3類樣本的優(yōu)勢菌群不同，北京地區(qū)兩水源水樣為α變形菌綱、β變形菌綱和藍藻綱，而丹江口水庫水樣中優(yōu)勢菌群為硝化螺旋菌綱等。Mukherjee等[32]的水樣組成顯示，硬壁菌門較豐富，其次是變形桿菌和擬桿菌。水源類型和不同水源水的混合比例也會影響某些類群的豐度和比例[33-34]。此外，水源水中有機物對飲用水全流程系統(tǒng)乃至龍頭水中微生物多樣性也存在較大影響，如青霉素-G[35]、丙吡胺[36]、抗生素[37]等有機物的存在會抑制水中細菌群落的活動，導(dǎo)致水樣中細菌總數(shù)與豐度下降。

2.2 16S rRNA在水處理工藝中微生物多樣性的研究應(yīng)用

飲用水微生物的有效凈化是預(yù)防介水傳染病及其傳播的重要環(huán)節(jié)。細菌群落組成與條件致病菌的出現(xiàn)存在潛在聯(lián)系[38]。飲用水處理廠或配水過程中遇到的問題可能會導(dǎo)致條件性致病菌(如分支桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌等)的擴散[39-40]。飲用水微生物的有效滅活是預(yù)防介水傳染病及其傳播的重要環(huán)節(jié)。

Hou等[41]為了了解飲用水處理系統(tǒng)中的細菌群落變化，采用Illumina Hiseq測序分析，在不同季節(jié)對華南某飲用水處理廠處理流程中的微生物群落進行了研究。結(jié)果表明，處理過程中放線菌、變形桿菌和硬壁菌的比例發(fā)生了較大的變化，放線菌的比例急劇下降，而處理水中的變形桿菌和硬壁菌的比例增加并占主導(dǎo)地位。氯化后細菌群落發(fā)生了顯著變化，而出廠水中細菌群落的豐度相對穩(wěn)定，不隨季節(jié)變化。在包括出廠水在內(nèi)的各個工藝流程的水中檢測到一些條件致病菌，包括假單胞菌、不動桿菌、檸檬酸桿菌、分枝桿菌等，這表明飲用水的安全可能受到威脅，該結(jié)果為飲用水處理流程中微生物時空變化提供了材料。Wu等[35]采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測飲用水中青霉素-G的含量，并采用聚合酶鏈反應(yīng)和高通量測序技術(shù)(檢測細菌16S rRNA V3和V4區(qū)基因)，用Illumina HiSeq2000檢測樣品中細菌的多樣性，并計算了各樣品的多樣性指數(shù)。結(jié)果表明，不同濃度的青霉素-G對飲用水細菌群落的結(jié)構(gòu)影響較大，添加青霉素-G后，飲用水樣品中細菌群落物種總數(shù)和豐度明顯下降，但群落結(jié)構(gòu)的數(shù)量和豐度并未隨濃度的變化而變化。青霉素-G能抑制飲用水中細菌群落的活動，降低飲用水中細菌的多樣性。Potgieter等[42]使用3種連續(xù)的消毒策略(氯化、氯胺化和次氯酸化作用)，在飲用水處理廠和分配系統(tǒng)中采集大量水樣，通過Illumina MiSeq對16S rRNA基因的V4可變區(qū)進行測序來表征細菌的群落組成，結(jié)果顯示，α-和β-變形桿菌在飲用水細菌群落中占主導(dǎo)地位，在氯胺化后β-變形桿菌數(shù)量增加。除消毒過程對微生物多樣性影響之外，軟化[43]、臭氧生物活性炭[44]、混凝[45]、過濾[46]等均會對水中微生物多樣性產(chǎn)生影響。

這些研究表明，飲用水處理廠的處理工藝(物理、化學(xué)、生物工藝)均會對水中的細菌群落產(chǎn)生一定影響。

2.3 16S rRNA技術(shù)在管網(wǎng)系統(tǒng)微生物多樣性變化的研究應(yīng)用

經(jīng)過處理廠凈水系統(tǒng)后的出廠水，通過供水管網(wǎng)(drinking water distribution system, DWDS)運輸?shù)礁饔盟c。DWDS的微生物生態(tài)受多種因素影響，包括環(huán)境和工程因素以及影響生物膜、水環(huán)境和沉積物中細菌群落組成和結(jié)構(gòu)的操作條件等[47]。除了水中微生物的影響，出廠水也可能會受到配水系統(tǒng)本身的影響，比如管道材料[48-49]、管道腐蝕[51]和松散沉積物的再懸浮[47-51]等。

Huang等[52]使用了Illumina高通量測序和454焦磷酸測序兩種方法對飲用水全流程的細菌毒性和毒性因子進行了分析，結(jié)果顯示，經(jīng)過氯氣消毒后，細菌多樣性下降，但經(jīng)過管道分配運輸后多樣性上升，且飲用水中依然存在部分致病菌。研究認為，聯(lián)合使用Illumina和454焦磷酸測序能夠更全面地表征飲用水系統(tǒng)中的細菌毒性和毒性因子。

供水管網(wǎng)材質(zhì)是影響末梢水微生物多樣性的一個重要因素。Liu等[53]采用的焦磷酸測序方法，以Roche 454 GS FLX 測序平臺，分析了聚氯乙烯(PVC)和鑄鐵管道中的水以及生物膜中的微生物群落組成。結(jié)果顯示，菌絲體和腐蝕相關(guān)細菌是PVC和鑄鐵生物膜中最具優(yōu)勢的細菌，而常見條件致病菌在不同材質(zhì)管網(wǎng)中相對豐度不同，且不同材料表面上的細菌群落具有特定的細菌種群，不同管道材料(PVC和鑄鐵)對微生物群落，特別是對細菌組成影響顯著，多種微生物會在不同的管材上選擇性繁殖。王薇等[54]利用 Roche 454 GSFLX+測序儀進行測序，研究了灰口鑄鐵管、鍍鋅管和不銹鋼復(fù)合管對供水管網(wǎng)生物膜微生物種群多樣性的影響，灰口鑄鐵管生物膜種群多樣性最高，鍍鋅管生物膜種群多樣性相對較為單一，不銹鋼復(fù)合管生物膜種群多樣性最低，不同管材生物膜細菌群落組成差異很大。Yu等[55]分析了管道材料銅、氯化聚氯乙烯、聚丁烯、聚乙烯、不銹鋼、鍍鋅鋼對生物膜形成潛力和微生物群落的影響，細菌16S rDNA片段的變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)顯示，不同材料之間存在顯著差異，管道材料不僅影響生物膜形成潛力，而且影響微生物多樣性。Inkinen等[56]利用16S rRNA和16S rRNA基因測序，對銅和交聯(lián)聚乙烯(PEX)飲用水管道生物膜在兩種不同處理條件(額外消毒和磁化水處理)下的細菌群落變化。結(jié)果表明，管材對分枝桿菌的產(chǎn)生有一定的影響，對磁化水處理的銅管的細菌群落有影響，而對磁化水處理的PEX管的細菌群落影響不明顯。值得一提的是，由于基于DNA的測序無法區(qū)分活細菌與死細菌，該研究同時構(gòu)建了樣本的16S rDNA和16S rRNA庫，以便更好地研究細菌群落的活性。

DWDS中的微生物群落具有很強的復(fù)雜性，是因其受到各種因素的聯(lián)合影響。來自出廠水中攜帶的微生物和消毒副產(chǎn)物，分配系統(tǒng)的管材、生物膜、沉積物等，以及分配過程的水力條件、水齡(時間)、地點(空間)等均會對分配系統(tǒng)中的微生物群落造成影響，可能引起微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化。Liu等[53]、Yu等[55]和Inkinen等[56]的研究均表明了管材對于分配系統(tǒng)中微生物群落的選擇性。

除管網(wǎng)材質(zhì)外，時空變化亦是影響末梢水生物安全的重要因素。Wang等[57]研究了管網(wǎng)中不同水齡的4個樣本，結(jié)果顯示，隨著水齡的增長，余氯逐漸減少，溶解有機質(zhì)、細菌總數(shù)和細菌多樣性增加。但是也有相反的報道，如Hwang等[58]對5個地點的水樣微生物群落的研究表明，采樣地點和水齡(<21.2 h)對大多數(shù)時間點樣品的微生物組成無明顯影響。Perrin等[59]研究巴黎DWDSs的細菌群落，結(jié)果表明，菌絲微桿菌和幽門桿菌是最具代表性的細菌屬，細菌群落在空間上相當穩(wěn)定，隨著時間的推移略有波動。Roeselers等[60]從荷蘭32個飲用水供水管網(wǎng)的不同地點收集水樣，結(jié)果顯示，出廠水的微生物群落結(jié)構(gòu)與末梢水沒有實質(zhì)性差異，同一供水管網(wǎng)的特定群落展現(xiàn)出時間上的穩(wěn)定性，同一供水管網(wǎng)內(nèi)的末梢水樣顯示出非常相似的群落結(jié)構(gòu)。

2.4 其他

除了上述水處理工藝、配水系統(tǒng)中生物膜和管材以及時間的影響之外，還有許多其他方面的對飲用水微生物的研究，例如水力條件[61]、水化學(xué)因素[62]等。Liu等[51]利用Illumina MiSeq進行DNA測序，確定了水源、處理水和配水系統(tǒng)在利用Bayesian “SourceTracker”方法塑造龍頭水細菌群落方面的比例貢獻。

Douterelo等[63]研究了小流量、穩(wěn)態(tài)流量和大流量水力條件對試驗配水系統(tǒng)細菌群落結(jié)構(gòu)和組成的影響，結(jié)果表明，在大流量水力條件下，細菌群落的物種豐富度和多樣性有提高的趨勢。

在對細菌群落多樣性分析方面，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，高通量測序技術(shù)具備一定優(yōu)勢。Perrin等[59]研究了巴黎4個飲用水分配系統(tǒng)的細菌群落，比較了基于培養(yǎng)方法描述的細菌多樣性和基于高通量測序方法描述的細菌多樣性。結(jié)果表明，基于培養(yǎng)的方法所展現(xiàn)的細菌多樣性，僅為基于高通量測序法的1.3%～1.8%。僅小部分的細菌多樣性能夠被傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所鑒定。高通量測序法則顯示高靈敏度的特點，使用高通量技術(shù)能夠更準確地描述微生物群落的狀態(tài)以及檢測其內(nèi)部和外部發(fā)生的干擾。

3 總結(jié)與展望

本文基于16S rRNA基因的特征，總結(jié)并分類分析了16S rRNA應(yīng)用于飲用水的微生物多樣性研究，包括源水水質(zhì)、水處理流程、供水管網(wǎng)條件等因素對微生物多樣性的影響。結(jié)果表明，水源條件、處理工藝、管網(wǎng)條件等均會對末梢水微生物群落多樣性造成影響，其中，水源條件與末梢水微生物種群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大，處理工藝與管網(wǎng)條件對龍頭水中微生物種群豐度的影響較大。

16S rRNA測序技術(shù)為飲用水微生物多樣性研究帶來了極大的幫助，但仍存在一些問題，如僅采用16S rRNA分析無法對某些差異較小的細菌鑒定到種，基于PCR技術(shù)可能帶來的污染和假陽性問題等。在此，對16S rRNA測序技術(shù)及飲用水微生物研究做出以下幾點預(yù)測。

(1)高通量測序技術(shù)的不斷革新。NGS的出現(xiàn)使得微生物基因研究的成本大幅度降低，試驗時間大幅度縮短，帶來了很好的經(jīng)濟和效率收益，加快推動了微生物多樣性的研究。Illumina測序平臺繼推出Hiseq、Miseq之后，近幾年新推出了Novaseq和iSeq，以適應(yīng)更多的需求?？赏ㄟ^改進文庫構(gòu)建[64-65]和測序讀長質(zhì)量控制[66-67]的方法來改善平臺的數(shù)據(jù)分析，不斷完善自身，降低錯誤率，提高應(yīng)用能力。

(2)不同研究技術(shù)的結(jié)合使用。為了更好地研究飲用水微生物，只使用單一的方法是不夠的，因為任何方法都有其局限性，應(yīng)當合理地結(jié)合使用不同的方法，以求對樣本進行更全面的描述和理解。例如:研究量較少時，第一代Sanger測序依然是一種選擇；需要較長讀長時，單分子測序技術(shù)的應(yīng)用則更適合；需要較高通量時，高通量測序技術(shù)則為較好的選擇；為了對樣品進行初步的篩選或評估，可以使用指紋圖譜技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)進行微生物定量分析和群落結(jié)構(gòu)分析等。

(3)研究規(guī)模的不斷擴大。目前，對飲用水微生物多樣性的研究大都是集中于一個方面(如管材、時間、消毒劑等)、一項處理流程或者一段運輸分配路徑對飲用水微生物多樣性的影響，且對單一方面的研究也只局限于某一小區(qū)域的樣品分析。未來應(yīng)當有更多的關(guān)于可能影響飲用水微生物的多種因素(飲用水處理全流程)的更大規(guī)模(市級供水管網(wǎng)、全國管網(wǎng))的項目及研究，以便更深刻地了解飲用水微生物的各項特性，從而對其進行針對性的處理。