劉海洪，崔 喆，2，付 鵬，2*

（1.鄭州大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省先進(jìn)尼龍材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

聚異戊二烯橡膠具有順式-1，4-結(jié)構(gòu)含量和相對(duì)分子質(zhì)量大、凝膠含量小、純凈、無雜質(zhì)、透明、有光澤等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥包裝材料和醫(yī)療器械配件，如注射液用膠塞、真空采血器膠塞、橡膠墊片、預(yù)灌封注射器用橡膠針頭護(hù)帽和輸液器用橡膠肝素帽等中大量應(yīng)用[1-5]。

市場(chǎng)上流通的藥用聚異戊二烯橡膠生產(chǎn)時(shí)所用的催化劑主要有齊格勒型催化劑、烷基鋰型催化劑和稀土化合物催化劑等。目前比較典型的藥用聚異戊二烯橡膠是美國(guó)科騰聚合物有限公司采用烷基鋰型催化劑生產(chǎn)的IR0307和廣東茂名石化有限公司采用齊格勒型催化劑生產(chǎn)的IR80[6-9]。

聚異戊二烯橡膠是異戊二烯單體經(jīng)過聚合反應(yīng)而制得的，生產(chǎn)過程中除需要添加催化劑外，還需要添加溶劑、防老劑和穩(wěn)定劑等，將這些添加劑的含量控制在一定限度范圍內(nèi)，對(duì)保證聚異戊二烯橡膠的化學(xué)安全性和生物安全性很關(guān)鍵。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)對(duì)于醫(yī)用基礎(chǔ)橡膠材料的生物安全性，如原材料的細(xì)胞毒性、過敏性、刺激性、全身毒性和遺傳毒性等越來越重視[10-11]。本工作主要對(duì)藥用聚異戊二烯橡膠生物安全性指標(biāo)中的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。細(xì)胞毒性的檢測(cè)，是將一定量的供試品溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)細(xì)胞，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)增殖和抑制影響的觀察，評(píng)價(jià)供試品對(duì)體外細(xì)胞潛在毒性的作用[12]。

在GB/T 14233.2—2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》中，細(xì)胞毒性試驗(yàn)主要是針對(duì)醫(yī)療器械浸提液[浸提介質(zhì)是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉（NaCl）注射液]，采用四唑鹽比色法和顯微鏡觀察法進(jìn)行；在GB/T 16886.5—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》中，在細(xì)胞毒性試驗(yàn)的試樣制備過程中，對(duì)于浸提介質(zhì)的選擇要先進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)浸提過程中使用含血清培養(yǎng)基時(shí)，只能采用（37±2）℃下不短于24 h的浸提條件。

本工作選擇IR0307和IR80為研究對(duì)象，采用不同浸提介質(zhì)和浸提處理方法，研究對(duì)比兩種橡膠樣品的細(xì)胞毒性，探討影響聚異戊二烯橡膠細(xì)胞毒性的因素，從而為藥用聚異戊二烯橡膠的生產(chǎn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要原料和試劑

IR0307，美國(guó)科騰聚合物有限公司產(chǎn)品；IR80，廣東茂名石化有限公司產(chǎn)品；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl注射液（簡(jiǎn)稱0.9%NaCl注射液）和純化水，市售品。

1.2 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、振蕩器、分度值為0.001 g的電子天平、定時(shí)器、移液器和96孔培養(yǎng)板等。

1.3 試樣制備

1.3.1 供試品及對(duì)照品制備

供試液：取潔凈的供試品（橡膠材料），必要時(shí)用適宜的清潔劑清除油污，再用純化水沖洗干凈，用濾紙吸干后切成0.5 cm×2 cm的長(zhǎng)條，置于玻璃容器內(nèi)，加浸提液（按照0.2 g供試品加1 mL浸提液的比例），使浸提液浸沒供試品。

供試品浸提條件及處理方法分為兩種：（a）將放置供試品的容器置于高壓滅菌器內(nèi)，在121 ℃下浸提60 min，冷卻至室溫，用該浸提液作為溶劑配制MEM（Minimum Essential Medium）培養(yǎng)基，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清后用于試驗(yàn)；（b）供試品于密閉容器內(nèi)在37 ℃下浸提24 h，冷卻至室溫，用該浸提液作為溶劑配制MEM培養(yǎng)基，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清后用于試驗(yàn)。

陰性對(duì)照品：按3 cm2對(duì)照品加1 mL浸提液的比例添加浸提介質(zhì)，浸提液制備方法同供試品。

陽(yáng)性對(duì)照品：體積分?jǐn)?shù)為10%的二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基。

空白對(duì)照品：采用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞懸浮液制備

對(duì)已培養(yǎng)48～72 h、生長(zhǎng)旺盛的L-929細(xì)胞消化2～3 min，加入MEM培養(yǎng)液，混勻并計(jì)數(shù)，配制成每毫升10 000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，備用。

1.4 測(cè)試分析

1.4.1 顯微鏡觀察法

將配制好的細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液，按照GB/T 14233.2—2005中顯微鏡觀察法的試驗(yàn)要求，培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 四唑鹽比色法

四唑鹽比色法的原理是活細(xì)胞的線粒體酶可將黃綠色的四唑鹽降解生成藍(lán)紫色物質(zhì)，用二甲基亞砜將其溶解成溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度，從而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例[13]。試驗(yàn)過程是測(cè)定供試品浸提液與L-929細(xì)胞直接接觸產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，以細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）進(jìn)行分級(jí)[14-15]。

本工作采用四唑鹽比色法結(jié)合顯微鏡觀察法測(cè)定橡膠體外細(xì)胞毒性。按照1.4.1節(jié)的步驟制備供試品，培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；然后每孔加入20 μL四唑鹽比色法溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，在振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上以570 nm為測(cè)量波長(zhǎng)、630 nm為參考波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算試樣的細(xì)胞RGR：

式中，R為細(xì)胞RGR，A為供試品或陰性、陽(yáng)性對(duì)照品的吸光度，A0為空白對(duì)照品的吸光度。

1.4.3 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

在GB/T 14233.2—2005細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，在顯微鏡下觀察分析細(xì)胞形態(tài)；在四唑鹽比色法試驗(yàn)中，根據(jù)細(xì)胞RGR，細(xì)胞毒性反應(yīng)被判定為0，1，2，3和4五個(gè)等級(jí)（見表1）。陰性對(duì)照品的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)應(yīng)不大于1，陽(yáng)性對(duì)照品的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)至少為3，才表明試驗(yàn)成立。供試品的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)應(yīng)不大于2才合格。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)Tab.1 Cytotoxicity reaction grade

2 結(jié)果與討論

2.1 以0.9%NaCl注射液為浸提介質(zhì)的試驗(yàn)分析

2.1.1 顯微鏡觀察法

以0.9%NaCl注射液作為浸提介質(zhì)，分別采用121 ℃×60 min和37 ℃×24 h兩種浸提條件處理供試品，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如表2所示。

表2 兩種浸提條件下的細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察結(jié)果Tab.2 Cell morphology observation by microscope under two extraction conditions

2.1.2 四唑鹽比色法

以0.9%NaCl注射液作為浸提介質(zhì)處理供試品，顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，四唑鹽比色法測(cè)定的細(xì)胞毒性見表3。

圖1 0.9%NaCl注射液浸提條件下顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)（放大40倍）Fig.1 Cell morphology observed by microscope under 0.9%NaCl injection extraction conditions（magnified by 40 times）

由表3可知：以0.9%NaCl注射液作為浸提介質(zhì)，在121 ℃×60 min浸提條件下，IR0307和IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)均為2；在37 ℃×24 h浸提條件下，IR0307和IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)均為1。

表3 0.9%NaCl注射液浸提條件下細(xì)胞毒性分析結(jié)果Tab.3 Cytotoxocity analysis results under 0.9%NaCl injection extraction conditions

2.2 以純化水為浸提介質(zhì)的試驗(yàn)分析

2.2.1 顯微鏡觀察法

以純化水作為浸提介質(zhì)，采用121 ℃×60 min的浸提條件處理供試品，顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)如表4所示。

表4 純化水浸提條件下細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察結(jié)果Tab.4 Cell morphology observation by microscope under purified water extraction

2.2.2 四唑鹽比色法

以純化水作為浸提介質(zhì)，在121 ℃×60 min的浸提條件下處理供試品，顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示，四唑鹽比色法測(cè)定的細(xì)胞毒性如表5所示。

從圖2可以看出，采用純化水浸提121 ℃×60 min，細(xì)胞形態(tài)正常。

圖2 純化水浸提條件下顯微鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)（放大40倍）Fig.2 Cell morphology observed by microscope under purified water extraction（magnified by 40 times）

從表5可以看出：采用純化水浸提121 ℃×60 min，IR0307的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)為1，IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)為2，IR0307的細(xì)胞毒性小于IR80。

表5 純化水浸提條件下細(xì)胞毒性分析結(jié)果Tab.5 Cytotoxocity analysis results under purified water extraction

3 結(jié)論

本工作采用顯微鏡觀察法和四唑鹽比色法測(cè)定聚異戊二烯橡膠體外細(xì)胞毒性，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果有如下初步判斷。

（1）采用0.9%NaCl注射液為浸提介質(zhì)，在37℃×24 h浸提條件下，IR0307和IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)均為1。

（2）采用0.9%NaCl注射液為浸提介質(zhì)，在121℃×60 min浸提條件下，IR0307和IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)均為2。

（3）采用純化水為浸提介質(zhì)，在121 ℃×60 min浸提條件下，IR0307的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)為1，IR80的細(xì)胞毒性反應(yīng)等級(jí)為2，IR0307的細(xì)胞毒性小于IR80。

（4）聚異戊二烯橡膠采用0.9%NaCl注射液浸提時(shí)，由于0.9%NaCl注射液配制的MEM培養(yǎng)基滲透壓偏高，在121 ℃×60 min浸提條件下細(xì)胞狀態(tài)為非正常狀態(tài)，這有待進(jìn)一步優(yōu)化。

相關(guān)資料顯示，引起聚異戊二烯橡膠本身產(chǎn)生細(xì)胞毒性的物質(zhì)主要與橡膠生產(chǎn)過程中所用的催化劑、溶劑、防老劑、抗氧劑以及穩(wěn)定劑的種類和含量有關(guān)，在聚異戊二烯橡膠生產(chǎn)過程中，建議控制催化劑的殘留量以及雜質(zhì)和金屬離子的含量和種類，使用潔凈的非污染型防老劑和穩(wěn)定劑。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)聚異戊二烯橡膠的企業(yè)不斷增多，生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)品質(zhì)量不斷提升，但產(chǎn)品主要還是用于非醫(yī)用橡膠制品，如輪胎、工業(yè)橡膠制品、輸送帶、襯墊和密封件等[16]。隨著醫(yī)用橡膠制品用量和規(guī)模的提升，開發(fā)生產(chǎn)符合醫(yī)用要求的聚異戊二烯橡膠并確保聚異戊二烯橡膠的細(xì)胞毒性符合相關(guān)法規(guī)要求是一項(xiàng)很有必要的工作。