胡文斌 洪青梅 李婧 濮文輝 何云 李洪立 李瓊

摘 ?要：為了準(zhǔn)確鑒定火龍果主要商業(yè)品種和評(píng)估其遺傳多樣性，本研究利用20對(duì)火龍果SSR核心引物對(duì)58個(gè)火龍果品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)，共檢測(cè)到116個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（Na）為5.8個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）為2.0519，觀測(cè)雜合度（Ho）為0.3318，期望雜合度（He）為0.4603，多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）為0.417?；谶z傳相似系數(shù)聚類結(jié)果，將火龍果主要商業(yè)品種分為3大類群。依據(jù)20對(duì)SSR引物在58個(gè)品種中擴(kuò)增的特異帶型組合，選取其中9對(duì)引物采用引物-帶型組合法構(gòu)建了58個(gè)火龍果品種的指紋圖譜，品種鑒定的置信概率幾乎為100%。研究結(jié)果可為火龍果種質(zhì)分類、品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：火龍果;SSR標(biāo)記;指紋圖譜;品種鑒定;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S667 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to accurately identify pitaya cultivars and evaluate their genetic diversity， 20 pairs of SSR core pri-mers were used to analyze the genetic diversity of 58 pitaya varieties， and polymorphic alleles were detected by capil-lary electrophoresis. Totally， 116 polymorphic alleles were revealed， with an average of 5.8 for each primer pairs. The average number of alleles （Na）， number of effective alleles （Ne）， observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， and polymorphism information content （PIC） was 5.8， 2.0519， 0.3318， 0.4603 and 0.417， respectively. Based on the clustering results of genetic similarity coefficient， the main commercial cultivars of pitaya were divided into three groups. Based on 20 pairs of SSR primers amplified from 58 cultivars， the fingerprints of 58 cultivars of pitaya were constructed using 9 pairs of primers. A strategy of combining primer pair with distinct alleles for fingerprint construction was developed and applied to the 58 cultivars. The confidence probability of variety identification was almost 100%. The research results would provide important theoretical basis and technical support for the germplasm classification， cultivar identification and varieties property protection of pitaya.

Keywords： pitaya; SSR; fingerprint; variety identification; genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.016

火龍果（Hylocereusundatus Britt. & Rose）又名紅龍果，屬仙人掌科（Cactaceae）多年生攀緣植物，原產(chǎn)于墨西哥南部及中美洲諸國(guó)的太平洋沿岸地區(qū)?；瘕埞墙臧l(fā)展起來的具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]、藥用價(jià)值[2-4]，以及觀賞價(jià)值[5]的新興熱帶亞熱帶果樹。在中國(guó)、越南、美國(guó)、泰國(guó)、以色列、哥倫比亞、厄瓜多爾、巴西、澳大利亞等國(guó)家有大規(guī)模種植，目前中國(guó)的種植面積大約有80 000 hm2，主要分布在廣東、廣西、海南、貴州、云南、福建等省（區(qū)），但是火龍果現(xiàn)有品種存在嚴(yán)重的同物異名、同名異物以及品種混淆等問題，由于主要商業(yè)品種外形特征極為相似，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類手段難以有效鑒定。為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有資源特別是商業(yè)品種的準(zhǔn)確鑒定，亟需開展DNA分子身份證構(gòu)建相關(guān)研究。

2005年國(guó)際植物新品種權(quán)保護(hù)組織（UPOV），將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP，目前國(guó)家認(rèn)定的植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以SSR、SNP、IDP標(biāo)記為首選標(biāo)記[6]，主要是采用SSR。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記（simple sequence repeat， SSR）具有按照孟德爾遺傳方式分離、共顯性遺傳、位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)作物品種鑒定的研究上得到了廣泛應(yīng)用。SSR在水稻[7]、玉米[8]、小麥[9]等農(nóng)作物品種鑒定上的研究，不僅形成了有效的鑒定技術(shù)體系，構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，還將其應(yīng)用于實(shí)踐中。目前水稻[10]、玉米[11]、大豆[12]、小麥[13]等都建立了基于SSR標(biāo)記的品種鑒定技術(shù)規(guī)程，發(fā)布相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)分別在中國(guó)水稻、玉米、大豆和小麥等品種鑒定中得到了實(shí)施和應(yīng)用。SSR標(biāo)記在火龍果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中已得到應(yīng)用[14-15]，但尚未有主要商業(yè)品種分子身份證構(gòu)建相關(guān)報(bào)道。為了構(gòu)建適合火龍果品種鑒定的分子身份證，本試驗(yàn)以58份火龍果主要商業(yè)品種為材料，從前期引物篩選所得火龍果SSR核心引物中選擇20對(duì)引物開展遺傳多樣性分析和分子身份證構(gòu)建研究，以期為火龍果種質(zhì)分類、品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試的58份火龍果品種資源（表1）主要來自火龍果主產(chǎn)區(qū)，包括國(guó)內(nèi)的海南、云南、廣西、廣東、福建、貴州、臺(tái)灣等?。▍^(qū)）的火龍果主產(chǎn)區(qū)，以及國(guó)外的美國(guó)、越南、以色列、厄瓜多爾、哥倫比亞、巴西、澳大利亞等國(guó)家的火龍果主產(chǎn)區(qū)。以上材料均保存于海南儋州中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部火龍果種質(zhì)資源保護(hù)海南創(chuàng)新基地。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?使用天根生化科技（北京）有限公司高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350）提取58份火龍果幼嫩莖樣品的總DNA，操作參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。樣品統(tǒng)一稀釋到20 ng/μL后，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?SSR程序及PCR產(chǎn)物檢測(cè) ?火龍果SSR引物由前期核心引物篩選試驗(yàn)所得（表2），PCR產(chǎn)物檢測(cè)使用毛細(xì)管電泳，普通引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。毛細(xì)管電泳所需熒光引物由武漢誠(chéng)至生物科技有限公司合成，分別在各引物對(duì)的F向引物的5端加上FAM或HEX熒光修飾基團(tuán)。

SSR熒光引物反應(yīng)體系（共10 μL）：PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，含2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，帶熒光的F-primer（10 μmol/L）0.5 μL，R-primer（10 μmol/L）0.5 μL，模板DNA（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 2.0 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，復(fù)性30 s（根據(jù)引物Tm值設(shè)計(jì)退火溫度），72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋10倍后，取1 μL PCR稀釋產(chǎn)物+9 μL甲酰胺（含1%分子量?jī)?nèi)標(biāo)）變性后上DNA分析儀ABI 3730xl（美國(guó)）進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)。

1.2.3 ?數(shù)據(jù)處理與遺傳多樣性分析 ?將毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入到GeneMarker分析軟件中，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，每對(duì)引物導(dǎo)出PDF峰圖文件。根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果，選擇條帶清晰、多態(tài)性高的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將同一位點(diǎn)的所有等位基因從小到大排列，有條帶記為“1”，空白記為“0”，統(tǒng)計(jì)所得的數(shù)據(jù)利用Excel軟件轉(zhuǎn)換成NTSYS-2.10所需要的格式，利用軟件NTSYSpc2.10計(jì)算遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA），利用篩選出的SSR核心引物對(duì)58份火龍果種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。用Cervus軟件和Popgene軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，等位基因數(shù)（No. ofalleles，Na）、有效等位基因數(shù)（No. of effective alleles，Ne）、香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon sinformation index，I）、Nei氏期望雜合度（Neis expected heterozygosity，Neis）、觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）等參數(shù)使用Popgene軟件計(jì)算，各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC值）由Cervus軟件計(jì)算。

1.2.4 ?指紋圖譜構(gòu)建 ?從上述結(jié)果中選擇適當(dāng)鑒定力強(qiáng)的SSR引物構(gòu)建主要商業(yè)品種的指紋圖譜，以所分析的SSR引物名稱為前綴，該標(biāo)記在某樣品上擴(kuò)增帶的分子量為后綴，得到每個(gè)品種在某個(gè)標(biāo)記的帶型編號(hào)，按照固定的引物排序綜合不同引物分析結(jié)果，串聯(lián)各帶型編號(hào)，形成該品種的SSR指紋圖譜。根據(jù)指紋圖譜出現(xiàn)的概率公式P=1/2n（n為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，2n則為檢測(cè)n個(gè)位點(diǎn)涉及的所有可能的試驗(yàn)材料個(gè)數(shù)），統(tǒng)計(jì)圖譜的置信概率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?主要商業(yè)品種的SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

從前期實(shí)驗(yàn)得到的火龍果SSR標(biāo)記核心引物中篩選出20對(duì)引物，對(duì)58份樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析（部分檢測(cè)結(jié)果見圖1）。20對(duì)SSR引物在58份火龍果種質(zhì)資源中共檢測(cè)出116個(gè)等位變異，多態(tài)性條帶數(shù)為116個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)100%。等位基因數(shù)變化范圍為2～13，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（Na）5.8個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）變化范圍為1.0194～3.3029，平均值為2.0519，香農(nóng)信息指數(shù)（I）平均為0.9186，觀測(cè)雜合度（Ho）平均為0.3318，期望雜合度（He）平均為0.4603，多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）平均為0.417，說明引物的多態(tài)性較高，有效揭示了58份火龍果主要商業(yè)品種的遺傳多樣性，同時(shí)說明這些引物能用于主要商業(yè)品種的指紋圖譜構(gòu)建（表3）。其中引物HU-ssr15、HU-ssr67、HU-ssr91的PIC值高，分別有7、9、13個(gè)等位變異，對(duì)應(yīng)的基因型有11、15、16個(gè)，有很高的鑒別能力，可以將絕大多數(shù)材料鑒別出來，可以作為指紋圖譜構(gòu)建的優(yōu)選引物。

2.2 ?主要商業(yè)品種聚類分析

根據(jù)20對(duì)核心引物擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用NTSYS- pc2.1軟件，依據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA算法對(duì)58個(gè)種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。從圖2可見，在遺傳相似系數(shù)為0.72時(shí)，58份火龍果商業(yè)品種總體上被分為3個(gè)類群。其中第1類只包含了H057（‘翠西亞）;第2類包括H018（厄瓜多爾‘燕窩果）、H022（‘糖龍）、H050（哥倫比亞‘燕窩果）、H054（‘秘魯燕窩）、H056（‘紅皮燕窩）;第3類為常見的主栽品種和地方品種，主要量天尺屬類或雜交群體，總共有52份。包括‘大紅‘金都一號(hào)‘蜜紅‘蜜寶‘石火泉‘富貴紅‘帝龍‘福龍‘甜龍等系列品種，越南、澳大利亞等國(guó)主栽品種，也包括廣西、廣東、海南、部分火龍果品種用HU-ssr15引物擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)圖示例，HU-ssr15引物在所有樣品中共擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)7個(gè)，分別是131、135、137、139、141、145、149 bp。

貴州等地方審定品種，這一類群又可以分為多個(gè)亞類群，基本上為紅皮紅肉、紅皮白肉、雙色等系列品種。這些品種遺傳相似系數(shù)基本在0.90以上，說明現(xiàn)有主栽品種差異小，遺傳背景狹窄，其中H002（‘蜜紅）與H048（‘大龍）、H020（‘越南白肉）與H046（‘晶紅龍）等之間的相似系數(shù)接近為0.99，說明它們之間的親緣關(guān)系近。

2.3 ?指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)20對(duì)核心引物擴(kuò)增結(jié)果可以將所有品種區(qū)分開，選取最優(yōu)的9對(duì)引物組合（HU-ssr03、HU-ssr15、HU-ssr23、HU-ssr36、HU-ssr56、HU-ssr67、HU-ssr68、HU-ssr74、HU-ssr91）就可以將58份品種完全區(qū)分，將代表每個(gè)樣品等位基因位點(diǎn)有無的“1”和“0”按順序組成數(shù)字指紋，構(gòu)建了58份主要商業(yè)品種和優(yōu)良品系的指紋圖譜（表4）。這些引物的多態(tài)性位點(diǎn)有65個(gè)，根據(jù)概率公式1/2n可知，理論上在265份品種中才有可能存在2個(gè)品種的電泳圖譜完全相同，置信概率幾乎為100%，該指紋圖譜可準(zhǔn)確檢測(cè)其中任何品種。其中引物HU-ssr91的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)達(dá)13個(gè)，可以區(qū)分H001（‘大紅）、H022（‘糖龍）、H057（‘翠西亞）等16個(gè)品種。

3 ?討論

本研究使用的20個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)58份樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果中，檢測(cè)出116個(gè)等位變異，多態(tài)性條帶數(shù)為116個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)100%，等位基因數(shù)變化范圍為2～13，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（Na）5.8個(gè)，多態(tài)性好。但是有效等位基因數(shù)（Ne）變化范圍為1.0194～ 3.3029，平均值為2.0519，香農(nóng)信息指數(shù)I為0.0542～1.5693，平均為0.9186，觀測(cè)雜合度（Ho）0.0000～0.8750，平均為0.3318，期望雜合度（He）為0.0192～0.7033，平均為0.4603，多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）為 0.019～0.658，平均為0.417，在0.25 < PIC < 0.50之間，為中度多態(tài)性，其中20個(gè)標(biāo)記中有7個(gè)具有高度多態(tài)性（PIC > 0.50），10個(gè)具有中度多態(tài)性（0.25 < PIC < 0.50），3個(gè)標(biāo)記為低度多態(tài)性（0 < PIC < 0.25），說明引物的多態(tài)性較高，能有效揭示58份火龍果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，也能很好地鑒別現(xiàn)有主要商業(yè)品種。然而，雖然本研究的樣品數(shù)增加了，但是相較于前期引物篩選所用18份材料得出的結(jié)果（PIC為0.471、13個(gè)高度多態(tài)性，相關(guān)結(jié)果文章已發(fā)表于《熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)》2020年12期），整體多態(tài)性指數(shù)都有降低，說明58份樣品的多樣性不夠。而聚類分析結(jié)果也證明火龍果主要商業(yè)品種豐富度不夠，遺傳背景較狹窄。除了第1類H057（‘翠西亞）和第2類H018（厄瓜多爾‘燕窩果）、H022（‘糖龍）、H050（哥倫比亞‘燕窩果）、H054（‘秘魯燕窩果）、H056（‘紅皮燕窩果），其他的大部分材料相似度很高。H057（‘翠西亞）棱邊緣木栓化、棱邊緣波浪形、枝條帶粉狀物、刺多而細(xì)長(zhǎng)、果皮暗紅色、果肉紫肉、果無刺，與美國(guó)品種El特征很相似，從表型描述上基本符合量天尺屬的Hylocereus ocamponis表型特征，明顯區(qū)別于其他類型火龍果。H018（厄瓜多爾‘燕窩果）、H022（‘糖龍）、H050（哥倫比亞‘燕窩果）、H054（‘秘魯燕窩果）、H056（‘紅皮燕窩果）可以基本概括為燕窩果類。因此，需加強(qiáng)國(guó)外原生種資源的引進(jìn)，選擇遺傳差異大的種質(zhì)作為親本，這樣有助于擴(kuò)大雙親的遺傳基礎(chǔ)，提高火龍果育種的效率。而為了更好更準(zhǔn)確地進(jìn)行火龍果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，需要篩選更多的多態(tài)性位點(diǎn)。另外由于火龍果沒有公開發(fā)表的基因組序列信息，無法保證所用SSR位點(diǎn)在基因組上均勻分布且每一條染色體上有位點(diǎn)分布，如果要建立品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，需要更多的引物篩選與完整的基因組信息。

早期的RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等分子標(biāo)記方法由于分型不穩(wěn)定、基因型過多、重復(fù)性差、非共顯性等原因，不太適合做種質(zhì)資源的精準(zhǔn)鑒定與遺傳多樣性分析。目前主要用SSR、SNP標(biāo)記開展相關(guān)研究。SSR由于重復(fù)性好、多態(tài)性高且共顯性標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)條件要求不高而成為主要應(yīng)用標(biāo)記。雖然本研究利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了現(xiàn)有主要商業(yè)品種的分子身份證，實(shí)現(xiàn)了品種鑒定，對(duì)完成現(xiàn)有主要商業(yè)品種分類、品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供了技術(shù)支撐。但是SSR標(biāo)記也有其缺點(diǎn)：由于DNA聚合酶的“滑動(dòng)”現(xiàn)象容易出現(xiàn)錯(cuò)誤基因型，SSR位點(diǎn)差異小需要精準(zhǔn)確定位點(diǎn)大小比較難。這些缺點(diǎn)導(dǎo)致SSR有一定的錯(cuò)誤率。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在基因組水平上的SNP（單核苷酸引起的序列多態(tài)性）、MNP（多個(gè)核苷酸引起的序列多態(tài)性）應(yīng)用越來越廣泛，小麥[16]、玉米[17]、大豆[18]、油菜[19]等主要農(nóng)作物都開展利用SNP標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的相關(guān)研究，但是單個(gè)SNP位點(diǎn)鑒定能力有限，需要大量的SNP位點(diǎn)才能實(shí)現(xiàn)鑒定目標(biāo)，加上SNP位點(diǎn)太多，多態(tài)性位點(diǎn)篩選工作量大;另外SNP位點(diǎn)檢測(cè)也存在一定的錯(cuò)誤率。新的標(biāo)記法MNP標(biāo)記可以避免SSR、SNP的缺點(diǎn)、充分利用了SNP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確率高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有效的鑒定方法。后期我們將基于MNP標(biāo)記法開展火龍果種質(zhì)資源鑒定研究。

由于我國(guó)不是火龍果的原產(chǎn)國(guó)，國(guó)內(nèi)引進(jìn)的大部分火龍果種質(zhì)資源以商業(yè)化品種為主，在火龍果育種過程中可利用的親本資源不多，再加上集中利用少數(shù)親本導(dǎo)致國(guó)內(nèi)火龍果種質(zhì)資源遺傳多樣性低。需要加強(qiáng)國(guó)外原生種資源的引進(jìn)，提升資源豐富度。同時(shí)未來將結(jié)合SSR與MNP標(biāo)記法開展火龍果種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性研究，提高技術(shù)水平，利用合適的分子標(biāo)記以期建立更準(zhǔn)確更標(biāo)準(zhǔn)化的品種鑒定技術(shù)規(guī)程，更系統(tǒng)更準(zhǔn)確地對(duì)火龍果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，選擇遺傳差異大的種質(zhì)作為親本，充分利用現(xiàn)有資源，提高火龍果育種的效率，為火龍果分類、育種、品種鑒定、新品種權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。種質(zhì)資源和育種輔助技術(shù)雙管齊下，提升育種效率，加快培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)異品種，推動(dòng)我國(guó)火龍果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)