符勇耀 楊利平 鄭開敏 徐文姬

摘 ?要：為獲得四倍體藥用萬壽菊材料，采用秋水仙素對藥用萬壽菊‘內(nèi)蒙1號的種子進行多倍體誘導研究。以0.15%濃度的秋水仙素處理露白的萬壽菊種子24 h，幼苗變異率較佳，可達到56%。幼苗定植于田間，初步篩選并標記形態(tài)變異植株，自花授粉后采收種子播種并觀測子代形態(tài)指標，對形態(tài)變異明顯的植株進行流式細胞儀檢測，確定獲得15株純合四倍體。通過將四倍體與二倍體進行比較，四倍體植株莖粗、柵欄組織厚度、柵欄組織與海綿組織的比例和單朵花重量顯著高于二倍體植株，四倍體植株總?cè)~量、葉寬、葉長、葉長寬比、葉片氣孔密度和單株花朵數(shù)量顯著低于二倍體植株。獲得的四倍體萬壽菊植株單株花總重量比二倍體顯著增加。

關(guān)鍵詞：萬壽菊;多倍體;育種;誘變

中圖分類號：S567 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： To obtain the material of polyploid medicinal marigold， colchicine was used for the polyploid induction with the seeds of medicinal marigold ‘Neimeng No. 1. The results showed that 0.15% of colchicine treated for 24 h was the best selection of the seedling induction of Tagetes erecta， reaching 56% of mutation rate. The seedlings were planted in the field and preliminary screening and marking of morphological variant plants were carried out. Seeds were harvested after pollination and seeded and morphological indicators of progenies were observed. Flow cytometry was used to detect the plants with obvious morphological variation and a total of fifteen tetraploid plants were identified. By contrast， the stem diameter， palisade tissue thickness， ratio of palisade tissue to spongy tissue and single flower weight of tetraploid plants were significantly higher than those of diploid plants， and the total leaf weight， leaf width， leaf length-width ratio， leaf stomatal density and number of flowers per plant of tetraploid plants were significantly lower than those of diploid plants. The total flower weight per plant of tetraploid plants was significantly increased in contrast to that of diploid plants.

Keywords： Tagetes erecta; polyploid; breeding; induction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.017

萬壽菊（Tagetes erecta）為菊科萬壽菊屬一年生植物，原產(chǎn)墨西哥等美洲地區(qū)[1]。根據(jù)其用途可分為花用萬壽菊和藥用萬壽菊兩大類，其中藥用萬壽菊花瓣中的葉黃素含量很高，約占花瓣色素總質(zhì)量的90%，因此萬壽菊成為提取天然葉黃素的普遍植物材料[2]。藥用萬壽菊產(chǎn)業(yè)的終端產(chǎn)品葉黃素具有抗氧化、抗白內(nèi)障、防止老年視黃斑退化、降低患癌率和防治冠心病等用途，在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域普遍應用[3]。目前，遼寧、內(nèi)蒙古和云南等?。▍^(qū)）是我國藥用萬壽菊的主要栽培地，萬壽菊種植和葉黃素的提取加工已經(jīng)成為地方脫貧致富的特色產(chǎn)業(yè)[4-7]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科技的發(fā)展，人們對葉黃素產(chǎn)品的需求逐漸增加，除了擴大種植面積來滿足市場需求外，提高萬壽菊鮮花單位面積產(chǎn)量和葉黃素含量成為當前研究的熱點之一。目前，在提高栽培技術(shù)和雜交育種篩選高產(chǎn)品種提高萬壽菊產(chǎn)量方面已有較多報道，如有學者篩選出適應種植地氣候條件的高產(chǎn)品種和栽培技術(shù)，以提高萬壽菊植株的花產(chǎn)量[8-9]，也有育種者利用雜交優(yōu)勢培育出萬壽菊花朵產(chǎn)量或色素含量均有提高的品種[10-12]。

通常多倍體植物的一些性狀會比二倍體更加優(yōu)良，比如植株高大、產(chǎn)量提高和適應性增強等，因此多倍體育種已經(jīng)被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并取得良好效果，如小麥（Triticum aestivum）、油菜（Brassica napus）和棉花（Gossypium spp.）等多倍體作物產(chǎn)量明顯提高、適應性增強[13]，藥用植物四倍體金銀花（Lonicera japonica）和板藍根（Baphicacanthus cusia）有效成分含量比普通二倍體高出約40%～60%[14-15]。目前國內(nèi)生產(chǎn)中所用的藥用萬壽菊品種多為二倍體（2n=2x=24），有關(guān)萬壽菊多倍體的研究鮮有報道。劉金鳳等[16]采用化學誘導萬壽菊幼苗生長點成功獲得變異株;He等[17]利用秋水仙素處理萬壽菊雄性不育系（M525AB）并獲得四倍體萬壽菊材料，但多倍體后代的形態(tài)表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀未見描述，栽培實踐中未見多倍體萬壽菊品種出現(xiàn)。農(nóng)業(yè)企業(yè)主要以采摘萬壽菊鮮花出售獲得經(jīng)濟效益，增加萬壽菊單株鮮花產(chǎn)量或提高葉黃素含量成為育種的主要目標之一。培育多倍體萬壽菊材料，有可能獲得鮮花產(chǎn)量增加的新種質(zhì)，進而培育獲得萬壽菊多倍體新品種，對于藥用萬壽菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以重慶市黔江區(qū)木蓮山種養(yǎng)殖股份合作社基地提供的‘內(nèi)蒙1號藥用萬壽菊二倍體（2n= 2x=24）種子為材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多倍體誘導及栽培 ?2017年春精選顆粒飽滿、無病蟲害的萬壽菊種子，清水浸泡催芽處理至稍露白，以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的秋水仙素溶液避光浸泡，震蕩處理12、24、48、60、72 h，每組處理50粒種子，清水處理50粒種子為對照。重復3次。秋水仙素處理后的種子用清水沖洗3次后，點播在72穴的育苗盤，混合基質(zhì)（V草炭∶V蛭石=3∶1），幼苗4片真葉時分為2組進行露底高畦定植，株行距為50 cm × 50 cm，定植后幼苗死亡及時替換。播種和定植之后常規(guī)水肥管理，株高30 cm時統(tǒng)一去除頂芽。

1.2.2 ?多倍體初步篩選 ?誘變的萬壽菊種子長出胚芽后，觀察胚軸和子葉的狀況，與空白組進行比較，將下胚軸增粗，子葉增厚，或子葉畸形的植株視為變異苗。待植株長出1對真葉時，統(tǒng)計植株的變異率（即形態(tài)學上發(fā)生任何改變的幼苗）和存活率（存在已萌發(fā)卻在一定時間無法生長的或缺失生長點的幼苗不計在內(nèi)）。當幼苗出現(xiàn)2～3對真葉時，分處理變異組和空白組分組進行露地栽培。植株長勢穩(wěn)定后，將處理過的植株與空白組進行比較，處理組出現(xiàn)葉片加厚或葉色加深的植株，進行掛牌標記，初步確定為變異植株。2017年對初步篩選出的形態(tài)變異株萬壽菊套袋自花授粉，獲得子一代種子（F1）。

2018年春將萬壽菊形態(tài)變異株子代種子和對照種子育苗、定植，方法同1.2.1。植株長勢穩(wěn)定后，再次將形態(tài)變異株子代植株與空白組進行比較，處理組出現(xiàn)葉片加厚或葉色加深的植株，進行掛牌標記，確定為變異植株，做多倍體鑒定材料。

1.2.3 ?多倍體鑒定 ?F1代形態(tài)變異植株高約40 cm時，選擇形態(tài)（如葉片顏色、大小，莖干直徑或花朵大小等）變異明顯的植株，取其中部的葉片，用濾紙夾住并浸濕濾紙，放進封口袋中，注明植株編號，置于裝有冰袋的保溫箱中，寄送北京德世達科技有限公司進行流式細胞儀檢測（檢測儀器：德國Partec CyFlow Space試劑盒，Partec CyStain UV Precise P），二倍體為對照。得到染色體倍性測試報告和分析樣本的測試圖，確定四倍體植株。

1.2.4 ?萬壽菊四倍體和二倍體形態(tài)特征比較 ?分別挑選10株四倍體和二倍體植株，待植株現(xiàn)蕾時分別測量植株總?cè)~量、葉片面積和葉片長度、植株的莖粗、葉片橫切柵欄組織與海綿組織的比例，單株花產(chǎn)量統(tǒng)計22株。測量時間為天氣晴朗的早晨9：00—10：00。

（1）莖粗和總?cè)~量。利用游標卡尺，對植株主莖的基部向上第4節(jié)處進行莖的直徑測量。記錄植株基部叢生枝的數(shù)量，再挑選中等大小1枝叢生枝，記錄其側(cè)枝的對數(shù)和第1對側(cè)枝、第4對側(cè)枝和靠近頂芽的最后1對側(cè)枝的葉量，以三者的平均值乘以側(cè)枝的對數(shù)，再加上頂芽周圍的葉量，可得到1枝叢生枝的平均葉量，經(jīng)計算，即可得到植株總?cè)~量。

（2）葉片形態(tài)及葉面積。采摘每株莖中部的新鮮葉片并清理干凈，保持原狀粘貼在透明膠帶上，用葉面積儀（杭州托普有限公司YWJ-B160- 10）進行測量，記錄單葉裂片的面積、長度、寬度和長寬比，每組葉片用葉面積儀重復測3次。

（3）氣孔特征。分別選取四倍體和二倍體植株莖中部的葉片（朝南），獲取單葉尖部裂片中部的上、下表皮制作表皮臨時裝片，觀察氣孔密度和氣孔大小。

（4）葉片橫切面柵欄組織與海綿組織的比例。取四倍體和二倍體植株莖中部單葉葉片（朝南），用清水將葉面清洗干凈，摘下相同位置的單葉裂片制作徒手切片，顯微鏡下測量葉片橫切面的柵欄組織與海綿組織的比例。

（5）單株花產(chǎn)量。萬壽菊植株進入始花期開始對四倍體和二倍體植株每一株的花朵數(shù)量進行統(tǒng)計，每周記錄1次，直到最后一朵花盛開。在同一植株花期的早、中、晚三個階段各取1朵發(fā)育成熟的盛花，稱重，取平均值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?多倍體誘導

2.1.1 ?秋水仙素對萬壽菊誘導的效果 ?萬壽菊種子經(jīng)秋水仙素處理后進行容器育苗，約12 d左右出苗，誘導過的幼苗出苗整齊度低于對照。播種后第25天統(tǒng)計幼苗存活率和變異率，變異苗出現(xiàn)多種特征，如兩片子葉的邊緣相連接、兩片子葉一大一小、子葉變厚有棱、真葉畸形、下胚軸增粗、胚根短、生長點損壞、發(fā)芽時間晚和生長緩慢等（圖1）。不同秋水仙素處理誘導萬壽菊變異率存在一定的差異。當處理時間為24 h，秋水仙素濃度為0.15%時，其幼苗誘變率最高，為56%;當處理時間為12 h，秋水仙素濃度為0.05%時，誘導效果最差，誘變率為24%（表1）。隨著處理時間的增加，不同濃度秋水仙素誘變率先增加后降低;在較短的處理時間內(nèi)（12 h和24 h），處理濃度越高，變異率越高;在較長處理時間下（48 h，60 h和72 h），處理濃度增加，變異率增加不明顯。隨著處理時間的增加，各處理的幼苗存活率降低，在秋水仙素濃度為0.20%時，表現(xiàn)最明顯（表1）。

2.1.2 ?多倍體田間初步篩選 ?2018年7月下旬田間栽培的萬壽菊植株開始現(xiàn)蕾，植株生長基本穩(wěn)定。觀察發(fā)現(xiàn)變異植株與對照相比其葉片深綠色，葉片較厚無韌性，單葉上的裂片寬大，葉柄和莖稈較粗，總?cè)~量偏低且植株生長緩慢。這些形態(tài)明顯發(fā)生變異的植株，可初步確認為多倍體，進入下一步檢查鑒定。

2.2 ?多倍體鑒定

對經(jīng)初步篩選得到的形態(tài)變異植株進行標記，通過與二倍體植株對比，選取葉片厚度顯著增加、葉色深綠色或生長緊湊的植株進行流式細胞儀鑒定，將二倍體植株葉片作為參照，由樣本的熒光強度X-Mean判斷倍性，將參照二倍體峰設在100，則四倍體峰在200，單倍體在50。在篩選的150株明顯變異的植株中，編號36、67、78、81、82、88、89、90、92、95、98、100、101、104、105、106、108、116、152、115、117、148的植株在相對熒光強度值50～200的位置出現(xiàn)2個峰（圖2B），表明這22株為嵌合體;編號12、59、62、66、71、80、91、96、97、102、110、118、120、121、114的植株在相對熒光強度值200的位置出現(xiàn)1個峰（圖2C），表明這15株為純合四倍體;其余植株（除編號64）在相對熒光強度值100的位置出現(xiàn)1個峰（圖2A），表明其為二倍體。

2.3 ?四倍體和二倍體植株形態(tài)特征

2.3.1 ?莖粗、葉量和葉面積 ?四倍體和二倍體植株在葉量、莖粗等性狀上有明顯的差異。四倍體植株的莖干變粗，總?cè)~量減少，其中四倍體植株莖粗比二倍體植株增加0.18 cm，總?cè)~量僅為二倍體的28.55%（表2，圖3A，圖3B）。四倍體萬壽菊與二倍體相比，單片葉面積未發(fā)生顯著變化;葉片的長度、寬度及長寬比與二倍體萬壽菊植株存在顯著差異（表3）。

2.3.2 ?葉片微形態(tài) ?萬壽菊四倍體與二倍體植株的葉表皮氣孔密度、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積均具有顯著差異，而四倍體植株葉表皮氣孔長寬比未發(fā)生顯著變化。四倍體植株氣孔密度明顯小于二倍體，其中葉上表皮氣孔密度是二倍體的47.22%，葉下表皮氣孔密度是二倍體植株的60.80%，其上表皮氣孔長度和寬度比二倍體植株分別增加了50.34%和51.12%（圖4，表4，表5）。

欄組織增加，植物光合能力增強。四倍體植株葉片柵欄組織厚度、柵欄組織與海綿組織的比例與二倍體植株具有顯著差異，四倍體萬壽菊植株柵欄組織比二倍體植株增厚了58.86%，四倍體植株海綿組織厚度與二倍體植株相比差異不顯著（圖5，表6）。

2.3.3 ?單株鮮花產(chǎn)量 ?鮮花產(chǎn)量是萬壽菊育種目標之一，在其他栽培條件相同的情況下花朵大小、葉黃素含量和單株產(chǎn)量顯得最為重要。分析發(fā)現(xiàn)四倍體萬壽菊植株平均單朵花的花徑明顯大于二倍體（圖3 C，圖3 D），單朵花的重量顯著高于二倍體，其平均每株花朵的數(shù)量顯著低于二倍體植株（表7）。四倍體平均單株花產(chǎn)量為772.25 g，二倍體平均單株花產(chǎn)量為705.22 g，四倍體單株花產(chǎn)量比二倍體顯著增加。四倍體植株與對照的花期沒有顯著差異。

3 ?討論

‘內(nèi)蒙1號萬壽菊種子經(jīng)過0.15%秋水仙素誘導24 h效果最好，幼苗存活率為58%，誘變率達56 %。幼苗和田間成年植株形態(tài)初步篩選出形態(tài)明顯發(fā)生變異的植株，但初選時當代變異株比較多，并且植物形態(tài)變化上具有一定的連續(xù)性;同時也發(fā)現(xiàn)當代變異植株通常生長緩慢，可能受到秋水仙素處理的影響，不利于選擇多倍化表型。為此，蕾期對變異株套袋并自花授粉后采收種子播種并觀測子代形態(tài)指標，子代中出現(xiàn)150株形態(tài)變異株，流式細胞儀檢測確定篩選的個體中有15株為純合四倍體，并且這15株的莖、葉的形態(tài)和微形態(tài)符合多倍體的基本特征，其中四倍體植株莖粗、柵欄組織厚度、柵欄組織與海綿組織的比例和單朵花重量顯著高于二倍體，四倍體植株總?cè)~量、葉寬、葉長、葉長寬比、氣孔密度和單株花朵數(shù)量顯著低于二倍體植株。確定的四倍體不僅莖干粗壯抗倒伏，而且單株鮮花產(chǎn)量顯著高于二倍體，基本達到了育種目標。此外，子代中也出現(xiàn)嵌合體，占14.7%，其表型主要是介于四倍體和對照組之間，與前人研究中也發(fā)現(xiàn)個別植物嵌合體自交可以獲得嵌合體后代相似[18-19]。二倍體植株的比率占到了75.3%，說明有可能當代變異植株的染色體數(shù)目并沒有發(fā)生加倍，大部分形態(tài)變異是由于在自交過程中，染色體發(fā)生重組引起的變化。有研究者用秋水仙素浸泡處理花用萬壽菊雄性不育系（M525AB）種子，發(fā)現(xiàn)濃度0.05%，處理3 h和6 h存活率為41%～50%，變異率為89%[17]。本試驗中使用秋水仙素的濃度提高了3倍，處理時間增加4～8倍，而存活率相當，誘變率略低。兩者之間差異很大，產(chǎn)生差異的原因可能是萬壽菊不同品種基因型導致。

單倍體育種技術(shù)只需2個世代便可獲得純合的DH系，有效縮短育種周期。通常獲得單倍體的途徑有利用高效誘導系為父本對目標作物授粉[20-21]，也有利用Co?射線輻射授粉獲得作物單倍體[22]。本研究在確定獲得15株純合四倍體的同時，也發(fā)現(xiàn)變異株子代群體中有7株形態(tài)明顯矮小、細弱的個體，流式細胞儀檢測確定其中的1株（編號64）為單倍體個體。秋水仙素處理萬壽菊子代中產(chǎn)生單倍體植株現(xiàn)象未見報道，產(chǎn)生單倍體可能是種子來源的二倍體親本產(chǎn)生。

染色體計數(shù)法鑒定植物倍性是一種較為常用且精準的方法，但制作染色體壓片的實驗步驟較為繁瑣復雜且耗時長，需具備熟練的操作技術(shù)，不適合大量樣品的檢測[23]。采用流式細胞儀鑒定法，樣品制備方便、靈敏度高、分析快速、植物損傷性小，是鑒定大量試驗樣本倍性的最快速有效的方法[24]，如用流式細胞儀鑒定非洲菊大孢子再生植株群體的倍性，其準確率可達95%，利用流式細胞儀鑒定誘變后的薄皮甜瓜，再結(jié)合氣孔特征輔助鑒定，可以快速、準確地確定變異株的倍性[25-26]。采用形態(tài)學篩選和流式細胞儀鑒定組合方法，可有效彌補待檢測群體較大和萬壽菊染色體小，壓片計數(shù)操作困難的缺點[27]，使四倍體萬壽菊的鑒定和篩選變得準確高效。

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