曾小玲 趙瑞麗 鐘開勤 朱朝輝 謝鑫鑫 溫慶放

摘 ?要：為探討軟腐病菌侵染下菜心轉(zhuǎn)錄組功能基因信息，采用BGISEQ-500高通量測序技術(shù)對軟腐病菌侵染下菜心葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，平均每個(gè)樣獲得47.27 M clean reads，Q20值均大于95%，共檢測到表達(dá)的Unigene為36 760個(gè)，其中已知的有35 327個(gè)，預(yù)測新Unigene有1 433個(gè);共檢測出19 549個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其長度主要集中在300～2000 nt。功能注釋結(jié)果顯示，有32 047個(gè)Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫獲得注釋，其中注釋到蕓薹屬白菜上的Unigene最多;GO功能共注釋到12 588個(gè)Unigene;KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到18 583個(gè)Unigene，涉及到137個(gè)代謝通路。共獲得21 776個(gè)組間差異表達(dá)基因（differential expression genes， DEGs），其中對照與發(fā)病前期組間的DEGs有15 007個(gè)，6 137個(gè)上調(diào)表達(dá)，8 870個(gè)下調(diào)表達(dá);發(fā)病前期與發(fā)病中期組間DEGs有13 118個(gè)，10 278個(gè)上調(diào)表達(dá)，2 840個(gè)下調(diào)表達(dá);發(fā)病中期與發(fā)病后期組間DEGs有11 293個(gè)，1 790個(gè)上調(diào)表達(dá)，9 503個(gè)下調(diào)表達(dá)。DEGs的Ven圖分析顯示5 110個(gè)基因在每組間均存在差異，DEGs功能分析顯示DEGs參與泛素蛋白降解途徑、過氧化物酶體途徑、光合碳固定途徑、糖酵解途徑等多種生命活動(dòng)。本研究結(jié)果為深入開展菜心抗軟腐病基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菜心;軟腐病;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S436.34 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To explore the functional gene information in flowering Chinese cabbage （Brassica campestris L. ssp. Chi-nensis （L.） var. utilis Tsen et Lee） inoculated by soft rot disease， the transcriptome of flowering Chinese cabbage was sequenced by BGISEQ-500 high-throughput sequencing technology. The results showed that average obtained 47.27 M clean reads and the Q20 base was more than 95%. A total of 36 760 Unigene transcripts were detected， of which 35 327 were known and 1 433 were predicted. A total of 19 549 new transcripts were detected， the length of which was mainly between 300 and 2000 nt. Functional annotation results showed that 32 047 Unigene were annotated in NR database， among which Unigenes were annotated most on Brassica rapa ssp. Pekinensis. GO function was annotated with 12 588 Unigene. Kegg database was annotated with 18 583 Unigene， involving 137 metabolic pathways. A total of 21 776 differential expression genes （DEGs） were obtained， including 15 007 DEGs， 6 137 up-regulated genes and 8 870 down- regulated genes between the control and premorbid groups. There were 13 118 DEGs， 10 278 up-regulated genes and 2840 down-regulated genes between pre-onset and mid-onset. There were 11 293 DEGs， 1 790 up-regulated genes and 9503 down-regulated genes. Analysis of the DEGs Ven map showed that 5 110 genes were different in each group. Functional analysis of DEGs showed that the differentially expressed genes were involved in various life activities， such as ubiquitin degradation pathway， peroxisome pathway， photosynthetic carbon fixation pathway， glycolytic process pathway and so on. The results of this study would lay a foundation for further studies on the ge-nome and molecular biology of resistance to soft rot of flowering Chinese cabbage.

Keywords： flowering Chinese cabbage; soft rot; transcriptome; differentially expressed genes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.032

菜心（Brassica campestris L. ssp. Chinensis （L.） var. utilis Tsen et Lee）為十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個(gè)變種，又名菜薹，是中國南方的特產(chǎn)蔬菜之一。近年來，隨著菜心栽培面積的擴(kuò)大和重茬現(xiàn)象的出現(xiàn)，菜心病害逐年加重，其中細(xì)菌性軟腐病是危害菜心的主要病害之一。蔬菜細(xì)菌性軟腐病是由軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種（Erwinia carotovora ssp. carotovora， Ecc）引起的一種流行性死體營養(yǎng)型細(xì)菌病害，其病原菌可存于植物表面和土壤中，通過傷口或自然孔口進(jìn)入植物體內(nèi)，主要依靠Types II蛋白分泌系統(tǒng)合成和分泌水解酶降解植物細(xì)胞壁，使植物組織呈浸漬狀[1-2]，主要侵染大白菜[3]、魔芋[4]、西葫蘆[5]等蔬菜。該病害發(fā)病較重時(shí)可造成蔬菜嚴(yán)重減產(chǎn)，而且在儲(chǔ)藏運(yùn)輸過程中易造成腐爛，嚴(yán)重影響品質(zhì)。目前，現(xiàn)有的蔬菜育種材料中具有抗軟腐病的材料較少，且關(guān)于該病害的研究主要集中于物理防治[3-4， 6]、轉(zhuǎn)基因[7-8]和分子標(biāo)記[9]等方面，而對于該病害的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。因此，開展與軟腐病抗性相關(guān)的功能基因的研究，對提高現(xiàn)有育種材料的抗軟腐病能力、培育具有抗軟腐病蔬菜新品種有重要的意義。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組分析植物功能基因的研究成果層出不窮。練冬梅等[10]分析了冰菜鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出8個(gè)與抗鹽性相關(guān)的差異表達(dá)基因;王華等[11]在轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上研究不同水分條件下杜鵑花轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，杜鵑花在不同水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要是通過3種轉(zhuǎn)錄因子（ERF、bHLH和MYB）協(xié)同完成的;戎利勤等[12]完成了小花草玉梅的轉(zhuǎn)錄組測序，并從中篩選出12個(gè)與花發(fā)育緊密相關(guān)的MADS基因;張尉欣等[13]通過對鎘脅迫下的菜心進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了菜心響應(yīng)鎘脅迫的主要通路及基因;陳靜芳[14]通過分析熱脅迫下菜心轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4份菜心材料的42個(gè)差異表達(dá)基因構(gòu)成菜心共同熱脅迫響應(yīng)機(jī)制，2份強(qiáng)耐熱性菜心材料的132個(gè)差異表達(dá)基因構(gòu)成了特有的熱脅迫響應(yīng)機(jī)制。由此可見，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)成為功能基因研究的高效手段。而關(guān)于軟腐病菌侵染菜心的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，其分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究采用BGISEQ-500平臺(tái)的測序技術(shù)，對軟腐病菌侵染下的菜心葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析菜心軟腐病發(fā)病過程中基因的表達(dá)變化，探究菜心對軟腐病應(yīng)答的分子機(jī)理，為菜心抗軟腐病基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以福州市蔬菜科學(xué)研究所自主研發(fā)的菜心新品種‘綠星為材料，種子經(jīng)消毒點(diǎn)播于32孔的穴盤中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。待幼苗長至3～4片新葉時(shí)，在每株植株上部第2片葉片基部的中脈注射OD值為0.5軟腐病菌菌液15 μL，套透明薄袋保濕，觀察其發(fā)病情況。選取發(fā)病前期、中期、后期的葉片作為材料，以未侵染的葉片作為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的葉片混合均勻后置于冷凍管中用液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，樣品委托華大基因科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 ?測序數(shù)據(jù)分析

將獲得的數(shù)據(jù)用SOAPnuke軟件進(jìn)行過濾分析，采用HISAT軟件（Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts）將獲得的clean reads與白菜基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對，使用Bowtie2將clean reads比對到基因序列，采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，用perl腳本對獲得的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行長度統(tǒng)計(jì)。

1.3 ?序列注釋和功能分類

采用Blast比對工具，將菜心轉(zhuǎn)錄組獲得的Unigene與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，將E值設(shè)置為≤ E-5，根據(jù)基因的相似性進(jìn)行功能注釋，得到與菜心Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。公共數(shù)據(jù)庫包括非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（non-redundant protein database， Nr）、基因本體論數(shù)據(jù)庫（gene ontology， GO）、東京基因與基金組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）。

1.4 ?差異基因分析

用DEGseq方法[15]對差異表達(dá)的基因進(jìn)行檢測，以Fold Change≥2且Q-value≤0.001作為顯著差異表達(dá)基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)分析差異基因的表達(dá)和功能。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)與質(zhì)量評估

使用BGISEQ-500平臺(tái)共測12個(gè)樣品，每個(gè)樣品平均產(chǎn)出7.09 Gb數(shù)據(jù)，Q20的值均大于95%，Q30的值均大于86%，說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足后續(xù)要求。將獲得的clean reads與白菜基因組進(jìn)行比對，平均比對率為78.25%，比對到基因的平均比對率為59.66%。共檢測到表達(dá)的Unigene數(shù)為36 760個(gè)，其中已知的Unigene有35 327個(gè)，預(yù)測新Unigene有1 433個(gè);共檢測出19 549個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中13 279個(gè)屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型，1 466個(gè)屬于新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本，剩下的4 804個(gè)屬于長鏈非編碼RNA，其中新轉(zhuǎn)錄本長度主要集中在300～2000 nt，占78.58%（圖1）。

2.2 ?基因注釋

2.2.1 ?Nr功能注釋 ?將獲得的Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，共獲得32 047條注釋，注釋到蕓薹屬的Unigene占93.08%，其中注釋到白菜的Unigene最多，占70.77%，其次為油菜（17.71%），注釋到甘藍(lán)的Unigene為4.57%，注釋到除此以外的其他科屬植物的Unigene占比較小，每種植物均小于3%（表1）。

2.2.2 ?GO功能分類 ?GO功能共注釋到12 588條菜心Unigene，可劃分為分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程3大類，又分為50個(gè)亞類。分子功能大類中注釋到結(jié)合活性（10 031個(gè)）和催化活性（8 838個(gè)）的Unigene數(shù)量最多;細(xì)胞組分功能大類中注釋到細(xì)胞（8 727個(gè)）、膜（7 373個(gè)）、細(xì)胞器（6 457個(gè)）、膜部分（6 423個(gè)）的Unigene數(shù)量較多;生物學(xué)過程大類中以細(xì)胞過程（7 554個(gè)）和代謝過程（6 790個(gè)）的Unigene較多（表2）。

2.2.3 ?KEGG代謝通路分析 ?菜心18 583個(gè)Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋，共注釋到137個(gè)代謝通路，其中注釋到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1211個(gè)）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（1 204個(gè)）、植物-病原菌相互作用（1 179個(gè)）、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（1 111個(gè)）4條代謝通路的Unigene數(shù)量較多，其他代謝通路的Unigene相對較少。此結(jié)果說明，菜心的代謝活動(dòng)較為活躍（表3）。

2.3 ?FPKM值分析

對FPKM值統(tǒng)計(jì)分析表明，菜心低表達(dá)量的單基因簇集中在發(fā)病后期，高表達(dá)量的單基因簇集中在發(fā)病中期。菜心單基因簇FPKM值低于0.1的有2547個(gè)，說明能檢測到極低水平的基因表達(dá)，檢測的靈敏度較高;FPKM值大于300的有29個(gè)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、光合作用等多種生物途徑。

2.4 ?差異基因分析

通過組間差異表達(dá)基因（differential expression genes， DEGs）分析（表4），共獲得21 776個(gè)DEGs，其中對照與發(fā)病前期組間的DEGs有15 007個(gè)，6137個(gè)上調(diào)表達(dá)，8870個(gè)下調(diào)表達(dá);發(fā)病前期與發(fā)病中期組間DEGs有13 118個(gè)，10 278個(gè)上調(diào)表達(dá)，2840個(gè)下調(diào)表達(dá);發(fā)病中期與發(fā)病后期組間DEGs有11 293個(gè)，1790個(gè)上調(diào)表達(dá)，9503個(gè)下調(diào)表達(dá)。將DEGs作Ven圖分析發(fā)現(xiàn)，有5110個(gè)基因在每組間均存在差異（圖2）。

經(jīng)基因的相似度和同源性分析，從菜心4個(gè)不同感病時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)掘大量與軟腐病病程相關(guān)的基因。其中泛素蛋白降解途徑相關(guān)基因有E1、E2、E3和UCH-L等，過氧化物酶體途徑有CAT、XDH和SOD等，光合碳固定途徑相關(guān)基因有PEPCK、ALDO和RubisCO等，糖酵解途徑相關(guān)基因有PGK、ALDH3I1、PFK和PDH E1等，以及其他抗病相關(guān)基因WRKY、NBS-LRR、NSP和AP2等。

進(jìn)一步分析與抗氧化相關(guān)的DEGs，發(fā)現(xiàn)參與到過氧物酶體途徑的DEGs有112個(gè)，其中2-羥基酸氧化酶有8個(gè)，超氧化物歧化酶有6個(gè)，長鏈酰基輔酶A合成酶和脂肪酰輔酶A還原酶均有5個(gè);參與到抗壞血酸代謝途徑的DEGs有87個(gè)，其中醛脫氫酶有7個(gè)，肌醇磷酸酶有6個(gè)，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶有5個(gè)（表5）。

3 ?討論

利用高通量測序技術(shù)分析植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘植物代謝途徑、調(diào)控機(jī)制等信息已成為研究熱點(diǎn)。利用該技術(shù)，紫背天葵[16]、黨參[17]、青籬柴[18]、黃秋葵[19]、番茄[20]等物種已完成了轉(zhuǎn)錄組測序和功能注釋，并從中發(fā)掘出一些重要功能基因加以利用。本研究利用高通量測序技術(shù)構(gòu)建了軟腐病菌侵染下菜心葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對獲得的序列在相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和功能注釋，發(fā)現(xiàn)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白代謝、糖代謝和能量代謝等多種途徑相關(guān)基因的表達(dá)均發(fā)生改變。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白能夠與目標(biāo)元件發(fā)生特異性結(jié)合，抑制或激活目標(biāo)基因的表達(dá)，從而參與植物的脅迫應(yīng)答、衰亡等一系列生理活動(dòng)，在植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制中具有重要的調(diào)控作用[21]。趙雪等[22]、范榮偉等[23]研究大白菜BrWRKY33基因上游調(diào)控序列功能及其在軟腐病抗性方面的作用，認(rèn)為BrWRKY33在擬南芥抗軟腐病SA/ET介導(dǎo)的防御過程中正調(diào)控下游基因的表達(dá)。菜心中WRKY基因序列BraA03g006670.3C、BraA07g 030410.3C在軟腐病發(fā)病過程中均差異上調(diào)表達(dá)，正調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而調(diào)控植株抗病能力;BraA09g035200.3C序列在軟腐病發(fā)病前期差異上調(diào)表達(dá)，發(fā)病中期和后期下調(diào)表達(dá);BraA02g 019440.3C和BraA06g041930.3C序列在軟腐病發(fā)病前期和中期差異上調(diào)表達(dá)，發(fā)病后期下調(diào)表達(dá);BraA01g006320.3C、BraA07g042700.3C和BraA09g029190.3C序列在軟腐病發(fā)病過程中差異下調(diào)表達(dá)，負(fù)調(diào)控下游基因的表達(dá)，改善植株抗病能力。由此可見，菜心WRKY基因在軟腐病發(fā)病過程中調(diào)控功能的復(fù)雜性。

油菜素類固醇（brassinosteroids， BRs）是一種新型植物生長激素，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、形態(tài)建成、頂端優(yōu)勢、葉片和葉綠體衰老、基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，其中油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）是生物活性最強(qiáng)的一種BRs[24]，外源施用可提高植株對根腐病、病毒病、白粉病的抗性[25-26]。BR合成基因編碼的蛋白大多屬于細(xì)胞色素P450超級(jí)家族，如CYP90B1/DWF4、CPD和DWF1等[27]。菜心細(xì)胞色素P450 85A2家族的不同基因調(diào)控軟腐病的方式不同，序列BraA02g039080.3C在軟腐病發(fā)病前期和中期差異上調(diào)表達(dá)，發(fā)病后期差異下調(diào)表達(dá)，序列BraA06g036240.3C在軟腐病發(fā)病中期差異上調(diào)表達(dá)，前期和發(fā)病后期差異下調(diào)表達(dá);P450 90A1（BraA10g028480.3C）在軟腐病發(fā)病前期差異上調(diào)表達(dá)，發(fā)病中期和后期差異下調(diào)表達(dá)。BRI1是位于質(zhì)膜上的富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat repeat， LRR）的受體樣蛋白激酶，是BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始的受體[28]。BR信號(hào)通路打開的第一步是BRI1與BR類物質(zhì)（如BL）特異性結(jié)合，此時(shí)BRI1的負(fù)調(diào)控蛋白BRI1 associated kinase1（BAK1）從細(xì)胞膜上解離而解除對BRI1的抑制，使BR信號(hào)向下傳遞[29]。菜心BAK1（BraA10g010250.3C）和BRI1（BraA06g 044360.3C）在軟腐病發(fā)病中期均差異上調(diào)表達(dá)，前期和發(fā)病后期均差異下調(diào)表達(dá)。