歐蘇文 羅康佳 管子龍 黃睿

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在2018年全球癌癥統(tǒng)計中發(fā)病率位于第三位，在癌癥相關(guān)死亡原因中排第二位［1］。然而，這種疾病發(fā)生與發(fā)展的確切機制仍有待發(fā)掘。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是癌細胞的一個小亞群，被認為是腫瘤生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療耐藥的驅(qū)動力［2］。癌細胞的生物學(xué)行為受遺傳、環(huán)境等多種因素影響，而這些最終都作用在基因的表達調(diào)控上。MicroRNAs是一類參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小分子非編碼RNA。在腫瘤細胞中，通常會出現(xiàn)一些基因和信號通路的異常激活或失活。而MicroRNAs在這些異常通路中發(fā)揮著重要作用。已有大量的研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs在結(jié)直腸癌干細胞（colorectal cancer stem cells，CCSCs）自我更新、增殖、分化、耐藥等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此我們總結(jié)了MicroRNAs調(diào)控結(jié)直腸癌干細胞特性的各種機制（尤其是作用于多種信號通路）以及MicroRNAs在結(jié)直腸癌診治中的應(yīng)用前景。進一步闡明MicroRNAs在結(jié)直腸癌干細胞中的分子機制，有助于更好地理解CCSCs的生物學(xué)行為，并在結(jié)直腸癌的臨床治療中啟發(fā)新的思考。

一、腫瘤干細胞學(xué)說的發(fā)展

一段時間以來，人們廣泛地認為所有腫瘤細胞都具有無限增殖的能力。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)擁有致瘤能力的細胞僅局限于腫瘤細胞的一個亞群。在20世紀中下葉，一些研究者提出了CSCs概念，認為CSCs是腫瘤自我更新的來源，也是腫瘤轉(zhuǎn)移擴散的種子［3］。隨后有研究者提出了一種腫瘤生長的干細胞模型，認為腫瘤細胞群體是異質(zhì)性的，并預(yù)測了三種腫瘤細胞亞群：包括干細胞、增殖能力有限的中間細胞和終末細胞。該模型對腫瘤細胞進行等級分層，從干細胞到終末細胞的分化轉(zhuǎn)變中，腫瘤細胞的自我更新和增殖潛能逐漸下降［4］。1997年，Bonnet等［5］發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)表型為CD34+CD38-的白血病細胞能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)引發(fā)白血病，首次證實了白血病干細胞的存在。此后，研究者相繼在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等各種實體瘤中證實了CSCs的存在。這些研究共同支持基于以下四個特性的CSCs模型：（1）腫瘤中觀察到細胞異質(zhì)性是由其等級結(jié)構(gòu)分層造成的；（2）腫瘤的分級是由少數(shù)具有自我更新能力的CSCs推動的，而瘤體大部分是由非CSCs構(gòu)成，它們只能短暫增殖而對長期生長沒有貢獻；（3）CSCs的身份是比較固定的，非CSCs在異種移植試驗中很少引發(fā)腫瘤，腫瘤結(jié)構(gòu)分層的可塑性是有限的；（4）CSCs對化療和放療有抵抗力，這一現(xiàn)象解釋了常規(guī)放化療之后腫瘤的復(fù)發(fā)［2］。

二、結(jié)直腸癌干細胞

2007年，O'Brien等［6］首次在結(jié)直腸癌細胞中鑒定出CD133+這一亞群，它們比其他腫瘤細胞擁有更強的自我更新、增殖和致瘤能力，并且能重建腫瘤的異質(zhì)性。這一發(fā)現(xiàn)證實了CCSCs的存在。根據(jù)CSCs理論，將CCSCs特性歸納為：（1）無限的自我更新能力；（2）無限的增殖潛能；（3）多向分化的潛能；（4）啟始腫瘤形成和重建腫瘤異質(zhì)性的能力；（5）抵抗放化療的能力。這些特性是CSCs驅(qū)動腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、抵抗治療和復(fù)發(fā)的根本原因。目前，還沒有特別理想的CCSCs標志物，但研究者已發(fā)現(xiàn)了一些分子可以用來較好地富集CCSCs，包括CD133、CD44、CD44v6、CD24、CD29、ALDH1、Lgr-5、EpCAM（ESA）、CD166、CD26、EphB2、DCLK1、Nanog、Oct-4、SOX-2等［7-8］。ALDH1作為CCSCs的表面標志比CD133和CD44有更好的特異性，在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤只需要25個ALDH1+的結(jié)腸癌細胞［9］。DCLK1的表達被認為可以特異性地標記CCSCs，而不是正常的腸道干細胞［8］。這些標志物聯(lián)合運用篩選出的細胞亞群干性往往比單個標志物更強。

三、MicroRNAs調(diào)控CCSCs相關(guān)特性

MicroRNAs（miRNAs）是一類長度為22個左右核苷酸的內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，成熟的miRNAs以RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的形式，通過其5'端的種子序列與位于靶mRNA 3'非翻譯區(qū)的序列互補結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯的抑制［10］。人類大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的mRNA都含有進化上保守的miRNAs結(jié)合位點，因此miRNAs對基因表達的影響是非常廣泛的。在結(jié)直腸癌中，miRNAs通過調(diào)控Wnt/β -catenin、 Notch、 PI3K/AKT、 JAK/STAT、 TGF-β/Smad等信號通路（見圖1）、干細胞轉(zhuǎn)錄因子以及與CCSCs生物學(xué)行為相關(guān)的其他基因的表達在CSCs的干性調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

圖1 miRNAs調(diào)控信號通路

1.miRNAs調(diào)控CCSCs的Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號的異常激活是大多數(shù)結(jié)直腸癌發(fā)生的啟動因素［11］。過度激活的Wnt信號對于維持CSCs的致瘤潛能和干性至關(guān)重要。在結(jié)直腸癌中，一些miRNAs通過激活Wnt/β-catenin信號促進CCSCs的干性。TGFβ/TGFβR2信號在細胞的很多生物過程中發(fā)揮著重要作用。miR-21通過靶向TGFβR2的mRNA來激活Wnt/β-catenin-TCF/LEF信號，增強了結(jié)直腸癌細胞的體外成球能力和在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的致瘤能力［12］。F框/WD-40域蛋白7（F-box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7）可以通過促進細胞核內(nèi)的β-catenin泛素化降解來抑制β-catenin信號。外泌體來源的miR-92a-3p通過抑制F框/WD-40域蛋白7表達來激活Wnt/β-catenin信號，從而促進結(jié)直腸癌細胞的干性、轉(zhuǎn)移和氟尿嘧啶/奧沙利鉑的耐藥等能力［13］。軸抑制因子2（axis inhibitor 2，Axin2）是Wnt誘導(dǎo)的負反饋調(diào)節(jié)因子，用以及時控制Wnt介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的終止。miR-103/107通過直接下調(diào)軸抑制因子2的表達，來延長Wnt/β-catenin信號的持續(xù)時間，促進了Wnt信號下游靶基因的表達，最終提高了結(jié)直腸癌細胞的干細胞樣特性，比如提高了CD44和DCLK1的表達水平，以及結(jié)直腸癌細胞的成球能力［14］。miR-146a通過靶向NUMB內(nèi)吞銜接蛋白（Numb）使β-catenin蛋白保持穩(wěn)定，提高了Wnt信號的活性，從而增加了CCSCs的對稱分裂，擴大了CSCs池、增加了CCSCs的致瘤能力和耐藥性［15］。

一些miRNAs通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活負調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的干性。在Wnt 3'非翻譯區(qū)有miR-34a的潛在結(jié)合位點，miR-34a可能通過降低Wnt/β-catenin信號來抑制氟尿嘧啶耐藥的結(jié)腸癌細胞的成球能力［16］。有研究發(fā)現(xiàn)catenin δ-1是細胞內(nèi)β-catenin轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)劑P21活化激酶4（p21 activated kinase 4，PAK4）的結(jié)合伙伴，PAK4的核積累可以促進β-catenin的核輸入和β-catenin/TCF介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［17］。miR-145通過直接靶向 catenin δ-1阻斷了Wnt/β-catenin信號激活，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄靶基因c-Myc和CyclinD1的下調(diào)，最終抑制了結(jié)直腸癌細胞的增殖活性。miR-145還通過下調(diào)catenin δ-1和肌成束蛋白1（fascin actin-bundling protein 1，F(xiàn)ascin-1）減弱了結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲活性［18］。有研究表明，泛素特異性肽酶22（ubiquitin specific peptidase 22，USP22）有促進β‐catenin核轉(zhuǎn)位的作用［19］。miR-30-5p 通過靶向USP22，下調(diào) Wnt/β‐catenin信號，抑制結(jié)直腸癌細胞的干性和化療耐藥［20］。在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-451會導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞的干細胞標記物（SOX-2和OCT-4）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）標記物Snail的表達以及腫瘤細胞的成球能力下降［21］。COX-2可通過抑制β-catenin的降解來激活Wnt信號［22］。在結(jié)腸癌干細胞球體中miR-451通過抑制巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）間接調(diào)控COX-2，進而影響βcatenin水平，從而抑制CCSCs，導(dǎo)致結(jié)腸癌干細胞的自我更新能力、致瘤性和對伊立替康的化療耐藥性下降［23］。此外，miR-200家族成員miR-141通過下調(diào)β-catenin的表達來抑制Wnt/β-catenin信號，降低了結(jié)直腸癌細胞的成球能力和化療耐藥［24］。

2.miRNAs調(diào)控CCSCs的Notch信號通路

Notch信號在腸道干細胞的自我更新和譜系分化的選擇方面發(fā)揮重要作用［25-26］。與腸道干細胞一樣，CCSCs也需要Notch信號進行自我更新。miR-34a調(diào)控Notch1的表達，使其在結(jié)腸癌干細胞分裂產(chǎn)生的子細胞中呈兩種區(qū)別明顯的表達水平，以此決定子細胞的命運：如果Notch的活性水平低于閾值，子細胞將分化為非CSCs，否則將仍為CSCs。并且高水平的miR-34a通過抑制Notch信號減少了結(jié)腸癌干細胞對稱分裂的比例，促進其分化，抑制其自我更新的能力［27］。免疫球蛋白kappa J區(qū)重組信號結(jié)合蛋白（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJ）是一種能在Notch信號通路中介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白。在依賴RBPJ的Notch信號中，RBPJ可以結(jié)合Notch胞內(nèi)域來激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞命運和凋亡等過程。miR-195-5p通過抑制Notch2和RBPJ來抑制結(jié)直腸癌細胞的干性［28］。TRF/miR-1280是一個既來自亮氨酸t(yī)RNA（tRNALeu）又來自miRNA前體（PremiRNA）的17bp片段，通過直接靶向經(jīng)典的鋸齒狀Notch配體2（jagged canonical Notch ligand 2，JAG2）來抑制Notch信號的活性，降低結(jié)直腸癌細胞中干細胞的比例，成球、致瘤能力以及EMT。

3.miRNAs調(diào)控CCSCs的JAK/STAT信號通路

JAK/STAT信號通路在腫瘤的增殖、化療耐藥和轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用［29-30］。在JAK/STAT信號通路中，與白細胞介素-6/10、干擾素（IFN）等多種配體結(jié)合后，JAK被激活；活化的JAK與細胞因子受體結(jié)合，使受體上的酪氨酸殘基磷酸化，進而將STAT重新招募到細胞因子受體上，使STAT被JAK磷酸化；磷酸化的STAT從受體中釋放出來，形成同源或異源二聚體，并轉(zhuǎn)移到細胞核中調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄［31］。JAK/STAT的激活受到細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）等負調(diào)控因子的嚴格調(diào)控。miR-196b-5p通過靶向SOCS1和SOCS3，引起STAT3信號通路的激活，從而促進結(jié)直腸癌細胞的干性，例如增加結(jié)直腸癌細胞球體形成能力、SP細胞比例、干細胞因子表達以及對氟尿嘧啶的耐受［32］。

4.miRNAs調(diào)控CCSCs的PI3K/AKT信號通路

磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是PI3K/AKT信號通路的負調(diào)控因子，通過誘導(dǎo)細胞周期停滯和細胞凋亡，參與細胞對電離輻射的復(fù)雜反應(yīng)［33］，也與腫瘤的耐藥相關(guān)［34］。有研究表明，PTEN是miR-106b作用的直接靶點。miR-106b通過直接下調(diào)PTEN，激活了PTEN下游的PI3K/AKT通路，從而促進了結(jié)直腸癌細胞對電離輻射的抗性，提高了腫瘤細胞的克隆成球能力和CD133、Sox2的表達，增加了結(jié)直腸癌細胞的干性［35］。此外，miR-21也可以通過抑制PTEN的表達來激活A(yù)KT信號，來提高結(jié)直腸癌細胞的耐藥等特性［36］。

5.miRNAs調(diào)控CCSCs的TGF-β/Smad通路

TGF-β信號在CSCs生物學(xué)行為調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在CD133+CCSCs中TGFBR1和TGFBR3的表達較高，CD133+CCSCs對TGF-β的敏感性增強［37］。TGF-β通路的激活參與調(diào)控CSCs的EMT［38］。miR-4666-3p可以靶向TGF-βR1，阻斷TGF-β1/Smad1通路的激活，從而抑制結(jié)腸癌干細胞的干性，比如致瘤能力和干性基因的表達下降。此外，TGF-β1是miR-329的靶基因，miR-329和miR-4666-3p一起協(xié)同阻斷TGF-β1/Smad通路的激活，來抑制結(jié)腸癌干細胞的干性［39］。

6.miRNAs調(diào)控CCSCs轉(zhuǎn)錄因子和其他基因的表達

miRNAs通過調(diào)控一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和基因調(diào)控CCSCs的干細胞樣特性（見圖2）。婆羅雙樹樣基因4（spalt like transcription factor 4，SALL4）是SALL基因家族的成員之一，參與維持胚胎干細胞的多能性［40］。miR-3622a-3p通過靶向SALL4降低了Wnt/β-catenin信號活性，抑制了結(jié)直腸癌細胞的干性、EMT和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移［41］。GATA結(jié)合蛋白6（GATA binding protein 6，GATA6）是一種在結(jié)腸干細胞擴增以及調(diào)節(jié)人結(jié)直腸癌細胞的干性方面發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子［42］。miR‐203通過直接抑制GATA6的表達來抑制人結(jié)腸癌細胞自我更新等干細胞特性［43］。Kruppel樣因子5（Kruppel like factor 5，KLF5）是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以通過促進β-catenin核定位來增強Wnt/β-catenin通路的活性［44］。miR-4711-5p通過靶向KLF5抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、成球能力以及干細胞標志物的表達［45］。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Octamer-binding transcription factor 4，Oct-4）是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，miR-20b-5p通過靶向Oct-4降低了結(jié)直腸癌細胞中CD133+CD44+干細胞亞群的比例，抑制了結(jié)直腸癌細胞的致瘤能力［46］。B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1（B-cell-specific moloney murine leukemia virus insection site 1，Bmi-1）是一種參與CSCs相關(guān)特性維持的干細胞因子［47］。在結(jié)直腸癌中，miR-215、miR-200c都可以通過下調(diào)BMI1的表達，促進結(jié)腸癌干細胞的分化，抑制其干性［48-49］。轉(zhuǎn)錄因子SOX2（sex determining region Y-box 2）是最初用于誘導(dǎo)成纖維細胞成為多能干細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。SOX2在腫瘤發(fā)生和干細胞維持中扮演多種角色［50］。miR-200c通過靶向SOX2抑制結(jié)直腸癌細胞CD133和CD44的表達、體內(nèi)的致瘤和轉(zhuǎn)移［51］。miR-371-5p和miR-450b-5p也通過下調(diào)SOX2抑制CCSCs的干性［52-53］。細胞周期蛋白D2（cyclin D2）被認為是人類胚胎干細胞自我更新的重要調(diào)節(jié)因子［54］。miR-141通過靶向參與細胞周期調(diào)控的cyclin D2來抑制大腸癌細胞的增殖，提高了化療的敏感性，并促進CSCs的分化［55］。miR-451通過靶向ATP結(jié)合盒B亞家族成員1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）降低CCSCs對伊立替康的抗性［23］。ATP結(jié)合盒跨膜轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）作為一種外源性轉(zhuǎn)運蛋白，可能在多藥耐藥中發(fā)揮重要作用；基質(zhì)金屬蛋白酶16（MMP16）可以降解Ⅲ型膠原、明膠、纖維連接蛋白和層粘連蛋白-1［56］。miR-328過表達通過直接靶向ABCG2和MMP16，降低了結(jié)直腸癌細胞中SP細胞的比例，以及耐藥和侵襲能力［57］。ALDH1是一種解毒酶，保護CSCs免受各種有害醛和活性氧的傷害，也是腫瘤干細胞的生物標志物［58］。miR-125a/b可抑制ALDH1A3的表達，進而增加結(jié)直腸腫瘤干細胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥細胞系對紫杉醇的耐受，抑制其致瘤能力［59］。表1列出了miRNAs通過抑制其他與腫瘤干細胞生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達來調(diào)控CCSCs的干性，在此不作贅述。

圖2 miRNAs調(diào)控干性

表1 miRNAs調(diào)控干性

四、miRNAs在結(jié)直腸癌診治中的應(yīng)用前景

miRNAs可以作為結(jié)直腸癌患者診斷、判斷預(yù)后和治療反應(yīng)的生物標志物。結(jié)直腸癌的早期診斷可以增加早期干預(yù)的機會，提高總體生存率。腫瘤細胞將胞內(nèi)miRNAs釋放到血液中，稱為循環(huán)miRNAs。這些分子可以通過與特定的蛋白復(fù)合物和囊泡結(jié)合來保護其免受不利理化因素的影響。通過血液檢測循環(huán)中miRNA可用于結(jié)直腸癌的早期篩查［71］。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)一些miRNAs與結(jié)直腸癌的化療耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［72-73］。因此，可以將miRNAs作為預(yù)測治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)的生物標志物。針對miRNAs調(diào)控CSCs的干性這一特點，將miRNAs或miRNAs抑制劑導(dǎo)入CSCs內(nèi)靶向殺滅CSCs可干擾腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和耐藥，改善轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者治療效果。但局限的是一些CSCs標志物，如CD44和CD133，也在正常的干細胞和祖細胞中表達［74］。開發(fā)針對CCSCs上特定抗原的抗體，將抗體連接到攜帶各種治療分子（miRNAs或miRNAs抑制劑）的脂質(zhì)體上，可能是靶向CCSCs的一種潛在手段［75］，這樣可以避免對正常干細胞的誤傷。納米顆粒與特異性抗體的組合可能會成為一種新的靶向治療方式。

綜上所述，miRNAs在CCSCs的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNAs通過調(diào)控各個信號通路的相關(guān)分子、多能干細胞因子或其他與CCSCs生物學(xué)特性和行為相關(guān)的基因的表達，來影響CCSCs的自我更新、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和對放化療的抗性等生物學(xué)行為。miRNAs擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景，不僅可以作為結(jié)直腸癌患者診斷、判斷預(yù)后和治療反應(yīng)以及復(fù)發(fā)的生物標志物，還可能成為腫瘤精準治療的靶點，為靶向殺滅CSCs提供了新的可能。進一部挖掘與CCSCs特性相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs及其調(diào)控機制，將為未來腫瘤的靶向治療提供更多的借鑒和參考。