譚照國，李艷梅，白建芳，郭昊宇，栗婷婷，段文靜，劉子涵，苑少華，張?zhí)毂?，張風(fēng)廷，陳兆波，趙福永，趙昌平，張立平

小麥的克隆及其在花藥開裂中的潛在功能

譚照國1,2，李艷梅2，白建芳2，郭昊宇2，栗婷婷2，段文靜2，劉子涵2，苑少華2，張?zhí)毂?，張風(fēng)廷2，陳兆波2，趙福永1，趙昌平2，張立平1,2

1長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2北京市農(nóng)林科學(xué)院北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心/雜交小麥分子遺傳北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

【】-葡萄糖苷酶（4--D-glueosidase，BG）是一種水解酶，可以從糖聚合物或寡聚糖中水解糖苷鍵釋放出非還原性糖基，對(duì)控制花藥開裂具有重要作用。小麥光溫敏雄性不育系BS366在不育環(huán)境下花藥不開裂，在可育環(huán)境下花藥開裂或不完全開裂。從BS366中克隆，分析其在花藥開裂中的潛在功能，為進(jìn)一步解析小麥光溫敏雄性不育系花藥開裂異常的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。以不育系BS366花藥的cDNA為模板，克??；利用生物信息學(xué)軟件對(duì)及其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、預(yù)測(cè)互作蛋白并對(duì)進(jìn)行上游啟動(dòng)子元件以及互作miRNA預(yù)測(cè)；構(gòu)建-16318hGFP載體，觀察其在小麥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法測(cè)定在不育環(huán)境、可育環(huán)境下不同發(fā)育時(shí)期花藥中的表達(dá)量，以及MeJA處理下及與其互作的在花藥和穎殼中的表達(dá)模式。屬于糖基水解酶超家族基因，全長為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，蛋白理論等電點(diǎn)為8.12，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。通過miRNA互作預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)可能受、等抗逆性相關(guān)的miRNA調(diào)控。通過蛋白互作預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)TaBG可能與氧化還原酶（glucose-methanol-choline oxidoreductase，GMC）、內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）等蛋白互作。TaBG定位于小麥原生質(zhì)體的液泡中。qPCR結(jié)果表明，在花藥發(fā)育雙室期（stage13)、花藥開裂時(shí)期（stage14）和衰退期（stage15）中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在花藥開裂時(shí)期表達(dá)量最高，并且在不開裂花藥中的表達(dá)量是正常開裂花藥的2.8倍。經(jīng)MeJA處理后，花藥和穎殼中的均呈下調(diào)表達(dá)，表達(dá)模式與其相反?？赡苁堋⒌瓤鼓嫦嚓P(guān)miRNA的調(diào)控，參與花藥開裂調(diào)控。由于表達(dá)量的升高，增加了不育環(huán)境下花藥中可溶性糖的含量，進(jìn)而增加花藥中的滲透勢(shì)，從而減緩花藥開裂時(shí)的脫水活動(dòng)，導(dǎo)致花藥不開裂。

小麥；-葡萄糖苷酶；miRNA；花藥開裂

0 引言

【研究意義】小麥光溫敏核雄性不育系是二系雜交小麥技術(shù)的核心與基礎(chǔ)，其中，不育系BS366在不育環(huán)境條件下花藥不開裂，在可育環(huán)境條件下花藥開裂或不完全開裂；而在雜交種子生產(chǎn)過程中花藥開裂程度的大小直接影響散粉情況，進(jìn)而影響植株受精的優(yōu)劣。因此，明確小麥花藥開裂調(diào)控因素對(duì)提高二系雜交小麥制種繁種效率、促進(jìn)二系雜交小麥的發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花藥是由最初的雄蕊原基形成，然后雄蕊原基角隅處的孢原細(xì)胞經(jīng)過平周分裂形成造孢細(xì)胞和初生壁細(xì)胞，造孢細(xì)胞經(jīng)過一系列的有絲分裂和減數(shù)分裂形成小孢子，即后來的花粉。而初生壁細(xì)胞則經(jīng)過平周分裂形成了藥室內(nèi)壁（纖維層）、中間層和絨氈層。當(dāng)花藥成熟時(shí)，藥室內(nèi)壁細(xì)胞壁的內(nèi)切向壁和橫向壁發(fā)生帶狀加厚，從而有助于花藥的開裂和花粉的散放[1]。Browne等[2]把雄蕊原基發(fā)生到花藥開裂脫落的整個(gè)過程分為15個(gè)時(shí)期，其中，花藥開裂階段分為雙室時(shí)期（bilocular stage，stage13）、花藥開裂時(shí)期（dehiscence，stage14）、衰退期（senescence，stage15）。研究表明，在花藥開裂階段，藥室內(nèi)壁和表皮細(xì)胞內(nèi)水有規(guī)律的轉(zhuǎn)運(yùn)，引起花藥表皮細(xì)胞脫水，進(jìn)而使藥室向外彎曲，最終導(dǎo)致花藥開裂[1]。影響花藥脫水的因素有很多，研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥花藥藥隔周圍存在H+蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（sucrose-H+symporter 1，AtSUC1），表達(dá)量的提高會(huì)增加藥隔的滲透勢(shì)從而導(dǎo)致花藥周圍組織脫水[3]。-葡萄糖苷酶（4--D-glueosidase，BG）是一種水解酶，可以從糖聚合物或寡聚糖中水解糖苷鍵釋放出非還原性糖基[4]。該酶在微生物、植物、高等動(dòng)物中都有存在，它們具有不同的蛋白序列，在生物體內(nèi)發(fā)揮不同的生物活性功能。在擬南芥中，BG2能夠水解脫落酸葡萄糖酯（abscisic acid-glueosidase，ABA-GE）從而增加體內(nèi)ABA水平，在對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能。擬南芥中，超量表達(dá)能夠恢復(fù)突變體幼苗葉片發(fā)黃的現(xiàn)象，且的等位T-DNA插入突變體對(duì)干旱和高鹽都敏感，說明-葡萄糖苷酶在植物提高體內(nèi)ABA水平來響應(yīng)外界脅迫的過程中發(fā)揮重要功能[5]。在大麥中，-葡萄糖苷酶BGQ60可以特異性水解-（1,3）和（1,4）糖苷鍵連接的低聚糖，參與細(xì)胞壁水解[6]。擬南芥中許多與BG同源的多聚半乳糖苷酶（polygalacturonase，PGs）能夠降解花藥細(xì)胞之間的膠質(zhì)和細(xì)胞壁從而調(diào)節(jié)花藥開裂[7]。其中，擬南芥花藥開裂區(qū)域多聚半乳糖醛酸酶ADPG1（DEHISCENCE ZONE POLYGALACTURONASE1）、ADPG2（DEHISCENCE ZONE POLYGALACTURONASE2）和QRT2（QUARTET2）均受茉莉酸的調(diào)節(jié)，其中ADPG2受乙烯調(diào)節(jié)，QRT2則受乙烯和脫落酸共同調(diào)節(jié)[8]；另外，前期研究表明，在離體環(huán)境下，外源茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）能夠誘導(dǎo)并提高小麥光溫敏不育系BS366的花藥開裂率，進(jìn)而提高散粉能力，獲得較高的結(jié)實(shí)率[9]。【本研究切入點(diǎn)】從開裂花藥和不開裂花藥轉(zhuǎn)錄組分析中篩選獲得在不開裂花藥中高表達(dá)基因（），且TaBG作為水解酶參與小麥光溫敏不育系花藥開裂調(diào)控的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以小麥光溫敏雄性不育系BS366為試驗(yàn)材料，并從其花藥中克隆獲得，通過基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、miRNA互作分析以及蛋白互作預(yù)測(cè)等，推測(cè)小麥在不同組織、不同花藥發(fā)育時(shí)期以及對(duì)花藥開裂前后的表達(dá)模式及調(diào)控方式，為進(jìn)一步解析小麥光溫敏雄性不育系花藥開裂異常的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心提供的小麥（L.）光溫敏核雄性不育系BS366為研究材料。

1.2 試驗(yàn)材料處理及采集

于2018年10月20日前后將光溫敏核雄性不育系BS366分別播種在北京市農(nóng)林科學(xué)院院內(nèi)（可育環(huán)境）和國家雜交小麥鄧州（河南）基地（不育環(huán)境）。2019年4-5月在小麥開花期間觀察、統(tǒng)計(jì)花藥開裂情況。收集2種環(huán)境下，stage13、stage14、stage15時(shí)期的花藥，并取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)（共18個(gè)樣）用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，剩余樣品于-80℃保存?zhèn)溆肹2]。

在花藥開裂時(shí)期（河南鄧州不育環(huán)境）分別取BS366的根、莖、葉、穎殼、雌蕊和雄蕊等6種組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

茉莉酸甲酯、水楊酸試驗(yàn)處理：在四葉期結(jié)束后，將長勢(shì)良好的BS366植株移入人工氣候培養(yǎng)箱（20℃，相對(duì)濕度75%，12 h白天/12 h黑夜）中，生長至2周齡，即抽穗期，共分2組處理：第一組每天噴施茉莉酸甲酯（MeJA），濃度分別為0、0.5、2和4 mmol·L-1；第二組每天先噴施茉莉酸甲酯（MeJA），濃度分別為0、0.5、2和4 mmol·L-1，6 h后加噴施10 mmol·L-1的SA。連續(xù)5 d后采集花藥組織[10]，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TaBG的克隆

通過分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中花藥開裂和不開裂的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），篩選出與花藥開裂相關(guān)且差異表達(dá)的候選基因（）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，在花藥開裂的3個(gè)時(shí)期（stage13、stage14和stage15），可育環(huán)境中的表達(dá)量與不育環(huán)境中的表達(dá)量比值取Log2后分別為1.97、2.84和0.37。利用Ensembl plants網(wǎng)站（http://plants.ensembl.org/）查找（）序列，Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)分別與7A、7B、7D染色體上的、和有1 507 bp片段的相似度為98%、1 473 bp片段的相似度為97.1%、1 223 bp片段的相似度為98.4%。根據(jù)網(wǎng)上序列，使用Oligo7軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物-F/R和TaBG蛋白編碼區(qū)擴(kuò)增引物-CF/CR（表1）。使用Trizol法提取1.2中采集樣品的總RNA經(jīng)濃度測(cè)量、質(zhì)檢合格后于-80℃保存。使用PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。以不育環(huán)境下發(fā)育時(shí)期為stage14的BS366花藥的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×Phanta Max Master Mix 10 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、模板cDNA 2 μL（100 ng·μL-1）和ddH2O 6 μL，擴(kuò)增程序參照2×Phanta Max Master Mix說明書，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收目的條帶，再與TA載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（DH5α），篩選陽性克隆測(cè)序（華大基因）。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用DNAman軟件將1.3中測(cè)序獲得的序列翻譯成TaBG的氨基酸序列，利用ExPaSy（https:// web.expasy.org）、Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr）、SWISSMODEL（https://web.expasy.org/）在線軟件，分別進(jìn)行一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，使用NCBI conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、SignalP Server（https://www.dtu.dk/）、ProtScale（https://www.expasy. org/）和Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/）分別進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、疏水性和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb. ugent.be/）[11]對(duì)編碼序列上游2 000 bp的DNA序列進(jìn)行順式作用元件分析。使用DNAMAN（ver.9.0）對(duì)TaBG氨基酸序列與其他植物BG的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA6.0對(duì)TaBG和其他植物的BG構(gòu)建進(jìn)化樹。利用MEME（http://meme-suite.org/）對(duì)TaBG進(jìn)行motif（基序）預(yù)測(cè)。使用STRING（https:// www.string-db.org/）和plantgrn（http://plantgrn.noble. org/）分別進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)和miRNA互作預(yù)測(cè)。

1.5 BG蛋白的亞細(xì)胞定位

利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物-DF和-DR（表1）。將與載體16318hGFP連接，構(gòu)建-GFP融合表達(dá)載體。將融合載體轉(zhuǎn)化到小麥原生質(zhì)體[12]，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8，德國）進(jìn)行觀察。

表1 引物序列及用途

1.6 TaBG的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用測(cè)序得到的序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)定量引物-QF/-QR（表1），以小麥作為內(nèi)參基因。cDNA模板混合后稀釋成不同倍數(shù)（1﹕3、1﹕9、1﹕27、1﹕81、1﹕243）制作引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算引物擴(kuò)增效率。參照TB Green? Premix Ex Taq?（TaKaRa，Japan）試劑盒說明書配制定量反應(yīng)體系（10 μl）：cDNA稀釋10倍后的工作液1 μl、正反向引物（10 μmol L-1）各0.5 μl、ddH2O 3 μl及TB Green Premix Ex Taq 5 μl。以檢測(cè)目的基因在小麥不同組織和不同處理樣品中的相對(duì)表達(dá)量。qPCR程序?yàn)?5℃15 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；增加熔解曲線，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)，陰性對(duì)照以無菌水為模板，采用Pfaffl法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[13]。使用Original 8.0軟件作圖。

1.7 miRNA的qPCR驗(yàn)證

利用miRNA提取試劑盒（康為世紀(jì)，CW0627S）提取miRNA，使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀(jì)，CW2141）進(jìn)行cDNA合成。使用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（康為世紀(jì)，CW2142）進(jìn)行miRNA qPCR分析。反應(yīng)程序同1.6。3次生物學(xué)重復(fù)，以為內(nèi)參，利用Pfaffl法進(jìn)行表達(dá)定量分析[13]。

2 結(jié)果

2.1 花藥開裂形態(tài)觀察

以小麥光溫敏雄性不育系BS366為試驗(yàn)材料，在花藥發(fā)育衰退期（stage 15）觀察花藥形態(tài)（圖1），結(jié)果顯示，北京環(huán)境下（可育環(huán)境）分為花藥完全開裂（圖1-A）和部分開裂（圖1-B）2種類型、河南鄧州（不育環(huán)境）花藥不開裂（圖1-C）。

2.2 TaBG的克隆及生物信息學(xué)分析

以不育環(huán)境下發(fā)育時(shí)期為stage14的BS366花藥cDNA為模板，根據(jù)獲得的序列，克隆其cds序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條長1 500 bp左右的片段（圖2-A）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和ORF Finder在線分析，的全長CDS為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸（圖2-B）。

利用ExPaSy對(duì)TaBG一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C2603H3849N685O713S15，相對(duì)分子量為56.63 kD，疏水性平均值為-0.316，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為74.82，等電點(diǎn)為8.12，表明該蛋白為不穩(wěn)定堿性蛋白。通過SignalP Server和NCBI conserved domains對(duì)TaBG結(jié)構(gòu)域及基序進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果表明，該蛋白在第1—18個(gè)氨基酸是信號(hào)肽（圖3-A），為分泌蛋白，并且無跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于糖基水解酶超家族1（cl23725）。

A：完全開裂（北京）；B：不完全開裂（北京）；C：不開裂（河南鄧州）

A：TaBG的克隆，M：DL 2000 maker；1：TaBG擴(kuò)增產(chǎn)物；B：TaBG的序列分析

TaBG的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基數(shù)分別為189、85和216個(gè)，占比分別為38.57%、17.35%和44.08%。

為進(jìn)一步了解的功能，通過PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的2 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，上游序列含多個(gè)順式作用元件（表2），包括與抗逆性相關(guān)的脫落酸作用元件（ABRE）、茉莉酸甲酯作用元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、水楊酸作用元件（TCA-element）、光響應(yīng)元件（G-box、TCT-motif）和分生組織表達(dá)相關(guān)元件（CAT-box）。

表2 啟動(dòng)子元件分析

根據(jù)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TaBG三維結(jié)構(gòu)中有糖基結(jié)合位點(diǎn)，并且擁有完整的糖基水解酶功能。根據(jù)WoLFPSORT對(duì)TaBG氨基酸序列進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能定位于液泡中。

2.3 小麥TaBG的保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化

對(duì)比小麥與其他植物BG氨基酸序列（圖4），發(fā)現(xiàn)小麥（L）與大麥（L）、二穗短柄草（L.）、水稻（L）、黍（）、玉米（L）、高粱（L.）的TaBG氨基酸序列相似度分別是95.5%、88.66%、79.22%、79.24%、78.8%和75.1%，這7種植物的BG序列中均含有糖基水解酶的底物結(jié)合位點(diǎn)。

EMS63424.1：小麥Triticum aestivum L.；KAE8767126.1：大麥Hordeum vulgare L.；XP_010237292.1：二穗短柄草Hordeum vulgare L.；XP_015620634.1：水稻Oryza sativa L.；XP_025809448.1：黍Panicum；XP_020393252.1：玉米Zea mays L.；XP_021304604.1：高粱Sorghum bicolor L.

通過對(duì)小麥TaBG和23個(gè)其他物種BG氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果顯示，小麥TaBG與節(jié)節(jié)麥BG聚為一個(gè)分支，表明親緣關(guān)系較近。MEME軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TaBG和其他物種BG蛋白一樣具有10個(gè)motif（圖5，表3）。推測(cè)TaBG可能與其他植物BG具有相似的糖基水解酶功能。

2.4 TaBG與miRNA互作的預(yù)測(cè)分析及互作蛋白的預(yù)測(cè)分析

前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)花藥發(fā)育具有一定的調(diào)控功能，通過預(yù)測(cè)與互作的miRNA，發(fā)現(xiàn)在不同物種中有540個(gè)miRNA與互作，其中和等，分別以翻譯抑制和剪切抑制的方式作用于（圖6-A）。小麥中，具有典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖6-B），在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中通常作為負(fù)調(diào)控因子，通過降解靶基因來調(diào)控基因表達(dá)。

圖中進(jìn)化樹中不同顏色部分表示不同分組。XP_020155850.1：節(jié)節(jié)麥；XP_020155849.1：節(jié)節(jié)麥；XP_020166122.1：節(jié)節(jié)麥；VAI78197.1：硬粒小麥；EMS63424.1：小麥；VAI90324.1：硬粒小麥；KAE8767126.1：大麥；XP_010237292.1：二穗短柄草；XP_006664007.1：野生稻；KAF0922613.1：野生稻；EEC69164.1：野生稻亞型；XP_015620634.1：梗稻；KAB8117340.1：水稻亞種；TVU50559.1：彎葉畫眉草；PWZ23263.1：玉米；XP_020393252.1：玉米；XP_021304604.1：高粱；RLN3116：糜子；RLM98073.1：糜子；PUZ66950.1：糜子；XP_025809448.1：糜子；RLN31163.1：糜子；TVU50559.1：彎葉畫眉草；RLM98073.1：糜子；XP_021304604.1：高粱；PWZ23263.1：玉米；XP_004963948.1：小米；XP_020393252.1：玉米；XP_006490742.1：橙子

表3 基序序列

為進(jìn)一步了解TaBG與其他蛋白間的作用關(guān)系，利用STRING對(duì)TaBG潛在的蛋白互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，TaBG可能和氧化還原酶（glucose- methanol-choline oxidoreductase，GMC）、降解纖維素的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）等蛋白互作（圖6-C）。

2.5 TaBG亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的TaBG-16318hGFP融合表達(dá)載體和16318hGFP空載體用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化到小麥原生質(zhì)體中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白。結(jié)果顯示，TaBG定位在液泡中（圖7）。

2.6 不同育性環(huán)境花藥發(fā)育時(shí)期下TaBG的表達(dá)模式分析

由圖8-A可知，在不同育性環(huán)境下，在花藥發(fā)育雙室期（stage13）、花藥開裂時(shí)期（stage14）和衰退期（stage15）的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中可育環(huán)境中的表達(dá)量與不育環(huán)境中的表達(dá)量比值取Log2后分別為1.97、2.84和0.37基本一致。在不同育性環(huán)境下的這三個(gè)時(shí)期中，花藥開裂時(shí)期（stage14）表達(dá)量均最高，且在不育環(huán)境的表達(dá)量是可育環(huán)境的2.8倍。

A：TaBG與miRNA互作圖；B：tae-miR395a的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；C：TaBG蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 TaBG-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

為進(jìn)一步了解在小麥花藥開裂期不同組織中的表達(dá)模式，分析了在根、莖、葉、穎殼、雌蕊、雄蕊中的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各組織中均有表達(dá)，在花藥中表達(dá)量最高，在雌蕊中表達(dá)量最低（圖8-B）。

圖8 TaBG在小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期及組織中的表達(dá)模式

2.7 TaBG及tae-miR395a在MeJA、SA處理下的表達(dá)模式分析

通過分析啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)包含有響應(yīng)茉莉酸甲酯、水楊酸的元件。為確定該基因是否受茉莉酸甲酯和水楊酸調(diào)控，以及對(duì)該基因的調(diào)控方式，利用茉莉酸甲酯、水楊酸對(duì)開花前的花藥進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度MeJA處理時(shí)，在花藥中的表達(dá)總體下調(diào)，在0.5 mmol·L-1濃度處理下表達(dá)量最低（圖9-A）。不同濃度的MeJA處理后再噴施SA（10 mmol·L-1），發(fā)現(xiàn)花藥中的表達(dá)量比噴施SA前高。不同濃度MeJA處理時(shí)，與在花藥中表達(dá)模式相反，花藥中的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在2 mmol·L-1MeJA濃度處理下，花藥中表達(dá)量最高（圖9-A）。不同濃度MeJA處理后再噴施SA（10 mmol·L-1），花藥中的表達(dá)趨勢(shì)與不同濃度MeJA處理時(shí)相似，但整體表達(dá)量較只進(jìn)行不同濃度MeJA處理時(shí)要低（圖9-A和圖9-B）。

為研究在穎殼中是否也受MeJA及SA的調(diào)控，同時(shí)考察了MeJA及SA處理下穎殼中及互作的的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度MeJA處理時(shí)，在穎殼中的表達(dá)低于花藥，不同濃度MeJA處理后表達(dá)下調(diào)（圖9-C）。不同濃度MeJA處理后再噴施SA，穎殼中表達(dá)下調(diào)。MeJA處理下，穎殼中的表達(dá)量隨著處理濃度的增加而升高，在2 mmol·L-1MeJA處理時(shí)達(dá)最大值（圖9-C）。不同濃度MeJA處理后再統(tǒng)一噴施SA（10 mmol·L-1），穎殼中的表達(dá)量整體上比只進(jìn)行MeJA處理時(shí)要低（圖9-D）。

在MeJA（0、0.5、2和4 mmol·L-1）和SA（10 mmol·L-1）處理后，花藥（A和B）和穎殼（C和D）中TaBG與tae-miR395a的相對(duì)表達(dá)量。MeJA：用不同濃度MeJA（0、0.5、2和4 mmol·L-1）處理麥穗。MeJA+SA：用不同濃度MeJA（0、0.5、2和4 mmol·L-1）處理麥穗后再噴施SA（10 mmol·L-1）

3 討論

-葡萄糖苷酶在植物中參與很多代謝過程，包括防御[14]、釋放活性激素、細(xì)胞壁的分解代謝、植物體內(nèi)生物和非生物脅迫應(yīng)答等[15]。當(dāng)植物受到侵害致使植物細(xì)胞破碎時(shí)，-葡萄糖苷酶便能催化水解糖苷鍵釋放防御化合物來抵御蟲菌的侵害[16]。在植物中還發(fā)現(xiàn)許多以非活性形式存在的植物激素苷，他們很容易被特定-葡萄糖苷酶激活，從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的激素水平。在擬南芥中，AtBG1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上，能水解ABA-GE產(chǎn)生ABA，對(duì)干旱脅迫作出響應(yīng)[17]。植物的細(xì)胞壁是最大的碳水化合物儲(chǔ)存庫，果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分，細(xì)胞壁中果膠網(wǎng)絡(luò)會(huì)隨著植物細(xì)胞形狀改變而分解，而多聚半乳糖醛酸酶能夠催化果膠水解和分解，所以PGs對(duì)于植物發(fā)育也具有非常重要的作用[18]。在小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中，通過群體定位得到的最有可能的候選基因是，該基因編碼果膠酯酶，參與果膠代謝途徑[19]。

研究表明-葡萄糖苷酶是纖維素水解的最后一步，能水解結(jié)合于末端非還原性的-D-葡萄糖鍵，同時(shí)釋放出-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[20]。在植物不同組織中也有分布，如主要在水稻的花和胚芽鞘中表達(dá)[21]。因此，推測(cè)在花藥中的高表達(dá)也可增加花藥中可溶性糖的含量，進(jìn)而提高花藥中特定區(qū)域細(xì)胞的滲透勢(shì)以減緩花藥的脫水活動(dòng)。本研究中不開裂花藥中的表達(dá)量比開裂花藥的要高（圖8-A），進(jìn)一步證明了該推論。

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能與其在細(xì)胞中的定位密切相關(guān)。TaBG小麥原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示此蛋白定位在液泡中，與擬南芥中的AtBG2定位在液泡中一致[17]。但是TaBG在花藥中具體部位中的分布與花藥內(nèi)部不同區(qū)域水轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

通過miRNA互作分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在不同物種中存在540個(gè)miRNA與互作，其中主要的是和，分別以翻譯抑制和剪切抑制的方式作用于（圖6-A）。為植物中一個(gè)保守的miRNA家族，目前已經(jīng)在多種植物中鑒定出來，在植物生長和發(fā)育過程中能夠響應(yīng)各種生物及非生物脅迫[22]。在水稻中，和在干旱脅迫下通過ABA途徑下調(diào)表達(dá)[23]。在植物中不僅能以翻譯抑制的方式作用于，它的靶基因還編碼一類核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor YA，NF-YA）。在擬南芥中，miR169/NF-YA模型會(huì)參與對(duì)干旱和氮脅迫的響應(yīng)，還會(huì)參與對(duì)糖代謝以及細(xì)胞伸長等生理過程的調(diào)控[24]。是一類與植物營養(yǎng)缺陷脅迫有關(guān)的miRNA。缺硫條件能誘導(dǎo)表達(dá)。硫作為植物的必要營養(yǎng)元素，在植物生長發(fā)育及代謝中起重要作用，其中，硫參與糖代謝并對(duì)淀粉的合成具有一定的影響。家族還參與多種植物對(duì)病害、冷害、硫營養(yǎng)等脅迫的響應(yīng)過程[25]。MeJA處理下，花藥表達(dá)上調(diào)（圖9-A），由此推測(cè)miRNA可能通過調(diào)控從而增加花藥中硫酸根的積累，進(jìn)而促進(jìn)淀粉形成，減少花藥中可溶性糖的含量，以增加花藥的脫水活動(dòng)，促進(jìn)花藥開裂。

GMC氧化還原酶家族在生物體內(nèi)葡萄糖、膽堿和甾醇等物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮重要作用。內(nèi)切葡聚糖酶主要將纖維素水解為葡萄糖[26]。蛋白互作預(yù)測(cè)研究表明，與糖基水解酶、GMC氧化還原酶（glucose-methanol-choline oxidoreductase）、內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）等酶共同表達(dá)（圖6-C）。它們共同作用于花藥特定區(qū)域，使得花藥中還原性糖含量增加，進(jìn)而增加滲透勢(shì)，減緩花藥的脫水活動(dòng)[27]。

前期研究表明，MeJA是重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，涉及不同發(fā)育進(jìn)程，例如開花、果實(shí)成熟和衰老[9]。在水稻中裂穎突變體（split husk 1，)是的等位突變體，編碼JA生物合成途徑中關(guān)鍵的丙二烯氧化合酶（allene oxide synthase，AOS）。的穎花形態(tài)與野生型基本一致，能正常開花但不能正常閉穎，突變體花藥中茉莉酸含量降低[28]。對(duì)擬南芥茉莉酸突變體（花藥不開裂，花絲短）的研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸能促進(jìn)茉莉酸突變體花藥開裂、加速花絲伸長和增加花粉活力。在小麥中也有研究表明花藥開裂與MeJA密切相關(guān)，噴施MeJA能提高小麥花藥開裂率。啟動(dòng)子響應(yīng)元件分析發(fā)現(xiàn)，上游啟動(dòng)子區(qū)存在茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸等順式響應(yīng)元件（表2）。為了進(jìn)一步確定對(duì)小麥花藥開裂的影響以及與的調(diào)控關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)MeJA處理能降低花藥中的表達(dá)（圖9-A和圖9-C），與前人研究中MeJA能促進(jìn)花藥開裂的結(jié)果一致[10]。另外發(fā)現(xiàn)，與互作的在花藥和穎殼中表達(dá)下調(diào)。在噴施SA處理后表達(dá)整體上升，表明不同濃度MeJA處理后再噴施SA能促進(jìn)的表達(dá)，從而使其互作的靶基因的表達(dá)受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)花藥開裂。

4 結(jié)論

從小麥光溫敏核雄性不育系BS366花藥中克隆到，該基因長1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，含有糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域，在植物中高度保守，屬于糖基水解酶超家族1（cl23725）；不開裂花藥中，的表達(dá)量要高于開裂花藥；花藥在外源激素MeJA溶液處理下，能抑制的表達(dá)。

[1] WILSON Z A, SONG J, TAYLOR B, YANG C. The final split: the regulation of anther dehiscence. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(5): 1633-1649.

[2] BROWNE R G, IACUONE S, LI S F, DOLFERUS R, PARISH R W. Anther morphological development and stage determination in. Front Plant Science, 2018, 9(2): 228.

[3] SANDERS P M, BUI A Q, WETERINGS K, MCINTIRE K N, HSU Y C, LEE P Y. Anther developmental defects inmale-sterile mutants. Sex Plant Reprod,1999, 11: 297-322.

[4] REUVENI M, SAGI Z, EVNOR D, HETZRONI A.-Glucosidase activity is involved in scent production in Narcissus flowers. Plant Science, 1991, 147(1): 19-24.

[5] XUE L J, ZHANG J J, XUE H W. Genome-wide analysis of the complex transcriptional networks of rice developing seeds. PLoS One, 2012, 7(2): e31081.

[6] LEAH R, KIGEL J, MUNDY J. Biochemical and molecular characterization of a barley seed -glucosidase. Biological Chemistry, 1995, 270: 15789-15797.

[7] RHEE S Y, OSBORNE E, POINDEXTER P D, SOMERVILLE C R. Microspore separation in the quartet 3 mutants of Arabidopsis is impaired by a defect in a developmentally regulated polygalacturonase required for pollen mother cell wall degradation. Plant Physiology, 2003, 133(3): 1170-1180.

[8] OGAWA M, KAY P, WILSON S, SWAIN S M. ARABIDOPSIS DEHISCENCE ZONE POLYGALACTURONASE1 (ADPG1), ADPG2, and QUARTET2 are polygalacturonases required for cell separation during reproductive development in. The Plant Cell, 2009, 21: 216-233.

[9] CHEONG J J, CHOI Y D. Methyl jasmonate as a vital substance in plants. Trends in Genetics, 2003, 19(7): 409-413.

[10] BAI J F, WANG Y K, WANG P, YUAN S H, GAO J G, DUAN W J, WANG N, ZHANG F T, ZHANG W J, QIN M Y, ZHAO C P, ZHANG L P. Genome-wide identification and analysis of thegene family in wheat (L.). BMC Genomics, 2018, 19(1): 754.

[11] LESCOT M, DéHAIS P, THIJS G, MARCHAL K, MOREAU Y, PEER Y V D, ROUZé P, ROMBAUTS S. PlantCARE, a database of plant-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Research, 2002, 30: 325-327.

[12] 孫鶴, 郎志宏, 朱莉, 黃大昉. 玉米、小麥、水稻原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(2): 224-234.

Sun H, Lang Z H, Zhu L, Huang D F. Optimized condition for protoplast isolation from maize, wheat and rice leaves.Chinese Journal of Biotechnology, 2013, 29(2): 224-234. (in Chinese)

[13] PFAFFL M W . A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, 29: 2003-2007.

[14] SUZUKI H, TAKAHASHI S, WATANABE R, FUKUSHIMA Y, FUJITA N, NOGUCHI A, YOKOYAMA R, NISHITANI K, NISHINO T, NAKAYAMA T. An isoflavone conjugate-hydrolyzing beta-glucosidase from the roots of soybean () seedlings: purification, gene cloning, phylogenetics, and cellular localization. Biological Chemistry, 2006, 281(40): 30251-30259.

[15] BRZOBOHATY B, MOORE L, KRISTOFFERSEN P, BAKO L, CAMPOS N, SCHELL J, PALME K. Release of active cytokinin by a beta-glucosidase localized to the maize root meristem. Science, 1993, 262(5136): 1051-1054.

[16] JONES P, VOGT T. Glycosyltransferases in secondary plant metabolism: tranquilizers and stimulant controllers. Planta, 2014, 213(2): 164-174.

[17] LEE K H, PIAO H L, KIM H Y, CHOI S M, JIANG F, HARTUNG W, HWANG I, KWAK J M, LEE I J, HWANG I. Activation of glucosidase via stress-induced polymerization rapidly increases active pools of abscisic acid. Cell, 2006, 126(6): 1109-1120.

[18] KE X, WANG H, LI Y, ZHU B, ZANG Y, HE Y, CAO J, ZHU Z, YU Y. Genome-wide identification and analysis of polygalacturonase genes in. InternationalJournal of Molecular Sciences, 2018, 19(8): 145156-145156.

[19] CHEN Y, JIA Y, NIU F, WU Y, YE J, YANG X, ZHANG L, SONG X. Identification and validation of genetic locusfor wheat fertility restoration in the presence ofcytoplasm. Theoretical and Applied Genetics, 2020: 1-11.

[20] DAVIES H G J C O I S B. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. 1997, 7(5): 637-644.

[21] CHUENCHOR W, PENGTHAISONG S, ROBINSON R C, YUVANIYAMA J, OONANANT W, BEVAN D R, ESEN A, CHEN C J, OPASSIRI R, SVASTI J, CAIRNS J R. Structural insights into rice BGlu1 beta-glucosidase oligosaccharide hydrolysis and transglycosylation. Journal of Molecular Biology, 2008, 377(4): 1200-1215.

[22] ZHAO M, DING H, ZHU J K, ZHANG F, LI W X. Involvement of miR169 in the nitrogen-starvation responses in. New Phytologist, 2011, 190(4): 906-915.

[23] ZHAO B, LIANG R, GE L, LI W, XIAO H, LIN H, RUAN K, JIN Y. Identification of drought-induced microRNAs in rice. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 354(2): 585-590.

[24] LEYVA-GONZALEZ M A, IBARRA-LACLETTE E, CRUZ-RAMIREZ A, HERRERA-ESTRELLA L. Functional and transcriptome analysis reveals an acclimatization strategy for abiotic stress tolerance mediated byNF-YA family members. PLoS One, 2012, 7(10): e48138.

[25] LIU W, CHENG C, CHEN F, NI S, LIN Y, LAI Z. High-throughput sequencing of small RNAs revealed the diversified cold-responsive pathways during cold stress in the wild banana (). BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 308.

[26] TRUDEAU D L, LEE T M, ARNOLD F H. Engineered thermostable fungal cellulases exhibit efficient synergistic cellulose hydrolysis at elevated temperatures. Biotechnology and Bioengineering, 2014, 111(12): 2390-2397.

[27] BONNER L J, DICKINSON H G. Anther dehiscence in Lycopersicon esculentum Mill: I. Structural aspects. New Phytologist, 1989, 113(1): 97-115.

[28] 潘孝武, 劉文強(qiáng), 黎用朝, 熊海波, 盛新年, 段永紅, 余亞瑩, 趙文錦, 魏秀彩, 李小湘. 水稻裂穎突變體的鑒定及基因定位. 中國水稻科學(xué), 2019, 33(4): 323-330.

PAN X W, LIU W Q, LI Y C, XIONG H B, SHENG X N, DUAN Y H, YU Y Y, ZHAO W J, WEI X C, LI X X.Identification and genetic analysis. of split husk mutantin rice.Chinese Journal Of Rice Science, 2019, 33(4): 323-330. (in Chinese)

[29] 向群, 張立平, 趙昌平, 唐忠輝, 徐小芹, 苑少華. 外源茉莉酮酸甲酯通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)光溫敏雄性不育小麥BS366離體花藥開裂. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2010, 26(11): 1028-1035.

Xiang Q, Zhang L P, Zhao C P, Tang Z H, Xu X Q, Yuan S H. Methyl jasmonic acid in vitro induces anther dehiscence of photothermo-sensitive male sterile wheat line BS366 through regulating related gene expression. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 26(11): 1028-1035.(in Chinese)

Cloning ofand analysis of its function in anther dehiscence in wheat

TAN ZhaoGuo1,2, LI YanMei2, BAI JianFang2, GUO HaoYu2, LI TingTing2, DUAN WenJing2, LIU ZiHan2, YUAN ShaoHua2, ZHANG TianBao2, ZHANG FengTing2, CHEN ZhaoBo2, ZHAO FuYong1, ZHAO ChangPing2, ZHANG LiPing1,2

1College of life sciences, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/The Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat, Beijing 100097

【】-glucosidase (BG, 4--D-glueosidase) is a kind of hydrolase which hydrolyzes glycosidic bond from glycopolymer or oligosaccharide to release non reducing sugar group, which plays an important role in controlling anther dehiscence. The anthers of the photoperiod-temperature sensitive genic male sterile (PTGMS) wheat line BS366 did not dehiscence in sterile environment, but completely or partially cracked in fertile environment. In order to study the regulatory function ofgene on anther dehiscence in wheat, thewas cloned from BS366 and its potential function in anther dehiscence was analyzed, which provided theoretical basis for further analysis of molecular mechanism of abnormal anther dehiscence in photoperiod thermo sensitive male sterile line of wheat.【】was cloned from the anther of PTGMS line BS366, and the primary structure, secondary structure, tertiary structure of TaBG proteinwere predicted. In addition, the cis-acting elements in promoter region prediction, phylogenetic tree construction with other species, interaction between miRNA and TaBG were performed using bioinformatics software. The expression levels ofand the interactedin anthers and glumes under MeJA and SA treatment were determined. 【】 The total length ofis 1 473 bp, which encoded 490 amino acids, andthe theoreticalis 8.12, belonging to the glycosylhydrolase superfamily. The results showed thatmay be regulated by stress resistance-related miRNAs, such asand. Based on the prediction of protein interaction, it was found thatmight interact with glucose-methanol-choline oxidoreductase (GMC) and endoglucanase (EG). TaBG is located in the liquid bubble of the wheat proton. The qPCR results showed that the expression ofin Bilocular stage (stage 13), Dehiscence (stage14) and Senescence (stage15) showed an upward and then downward trend.was the highest expression in Dehiscence, and the expression ofin no dehiscence of anther was 2.8 times higher than that of complete dehiscence of anther. After treatment of MeJA, the expression ofin anther and glume showed downward. Theexpression pattern was the opposite.【】might be involved in anther dehiscence with stress tolerance related miRNA such asand. High expression ofcould increase the content of soluble sugar in the anther under the sterile environment, and then increase the osmotic potential in the anther, so as to slow down the dehydration of anther dehiscence. This study will lay a foundation for elucidating the biological function ofin regulating anther dehiscence.

wheat; 4--D-glueosidase; miRNA; anther dehiscence

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.002

2020-11-25；

2021-02-05

國家自然科學(xué)基金（31872881）、國家自然科學(xué)青年基金（31901490）、北京市農(nóng)林科學(xué)院杰出科學(xué)家項(xiàng)目（JKZX201907）

譚照國，Tel：18977388904；E-mail：tanzhaoguo@foxmail.com。李艷梅，E-mail：lymei1013@163.com。譚照國和李艷梅為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者趙福永，E-mail：fyzhao@yangtzeu.edu.cn。通信作者趙昌平，E-mail：cp_zhao@vip.sohu.com。通信作者張立平，Tel：13681046953；E-mail：lpzhang8@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）