李兆偉，零東蘭，孫聰穎，曾慧玲，劉凱基，藍(lán)穎珊，范凱，林文雄

利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯水稻

李兆偉1，零東蘭1，孫聰穎1，曾慧玲1，劉凱基1，藍(lán)穎珊1，范凱2，林文雄1

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福州 350002

【】參與的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑在水稻生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境因子響應(yīng)中起重要作用，并影響水稻生育后期的產(chǎn)量形成過(guò)程。利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)對(duì)粳稻中花11（ZH11）的序列進(jìn)行編輯，獲得突變植株，通過(guò)對(duì)突變植株的農(nóng)藝性狀指標(biāo)開(kāi)展田間調(diào)查分析，以期探索突變對(duì)水稻產(chǎn)量構(gòu)成因子的影響。依據(jù)CRISPR/Cas9編輯原理，在第1和第2外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2個(gè)20 bp的編輯靶點(diǎn)，并在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析靶點(diǎn)序列，排除非特異性編輯，將2個(gè)靶點(diǎn)核苷酸片段分別與pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b載體連接，通過(guò)2次PCR擴(kuò)增，得到含特異性連接接頭的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表達(dá)盒，再將2個(gè)表達(dá)盒連接到pYLCRISPR/Cas9-MT載體上，獲得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重組表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化ZH11愈傷組織，再生培養(yǎng)得到T0代轉(zhuǎn)基因幼苗，通過(guò)PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因獲得陽(yáng)性株系。對(duì)T2代植株的靶點(diǎn)區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，鑒定突變類型，并考察突變植株的田間農(nóng)藝性狀。pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化ZH11水稻愈傷組織，并獲得25株轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)潮霉素鑒定得到20株陽(yáng)性株系，從陽(yáng)性植株的T2后代中鑒定出17種在2個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域都發(fā)生編輯的純合突變類型植株，除、、和在第1個(gè)靶點(diǎn)、以及在第2個(gè)靶點(diǎn)是單堿基插入突變外，其他突變植株在第1個(gè)靶點(diǎn)為小片段缺失突變，在第2個(gè)靶點(diǎn)多為單堿基缺失突變。對(duì)17種不同基因型突變體的農(nóng)藝性狀調(diào)查表明，與野生型水稻相比，突變體水稻的株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、收獲指數(shù)以及谷草比等性狀未發(fā)生明顯變化，而分蘗成穗率則顯著降低，表明無(wú)效分蘗增多。采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)序列進(jìn)行編輯，得到17種不同基因型的突變體水稻，其分蘗成穗率顯著降低，無(wú)效分蘗變多，表明參與了生長(zhǎng)素對(duì)分蘗芽發(fā)生的調(diào)節(jié)代謝。

水稻；基因編輯；；CRISPR/Cas9技術(shù)；突變體

0 引言

【研究意義】生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，包括胚胎分化發(fā)育、側(cè)根形成、頂端優(yōu)勢(shì)維持、側(cè)枝和花的分化、向性運(yùn)動(dòng)感應(yīng)等[1]。在生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中，Aux/IAA基因家族成員通過(guò)與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）互作，調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào)途徑下游響應(yīng)基因的應(yīng)激表達(dá)，在起始生長(zhǎng)素信號(hào)途徑代謝中發(fā)揮重要作用，并最終影響作物產(chǎn)量形成因子變化。利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)對(duì)Aux/IAA基因家族成員進(jìn)行編輯突變，調(diào)查突變植株的農(nóng)藝性狀特征，對(duì)探究生長(zhǎng)素早期響應(yīng)機(jī)制，豐富和完善生長(zhǎng)素信號(hào)途徑調(diào)控水稻農(nóng)藝特性及產(chǎn)量形成等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】基因編輯是以核酸酶作為剪切工具，對(duì)基因組中的目標(biāo)基因進(jìn)行剪切修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因特定位置DNA片段的刪除或插入突變，達(dá)到對(duì)目標(biāo)性狀的分子遺傳改良[2]。較早的基因編輯手段是以鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）為代表的第一代編輯技術(shù)，以及類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）為代表的第二代編輯技術(shù)，其中，ZFNs技術(shù)存在靶向載體構(gòu)建復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯等局限性，TALENs技術(shù)則存在靶向串聯(lián)基序較長(zhǎng)、重復(fù)序列較多等缺陷，編輯成本較高，嚴(yán)重制約了其在分子設(shè)計(jì)育種與生物遺傳改良中的應(yīng)用[3-4]。近年來(lái)出現(xiàn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated nucleases，CRISPR/Cas）作為第三代基因編輯技術(shù)，具有編輯更加簡(jiǎn)單、高效、精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)，尤其是CRISPR/Cas9編輯技術(shù)通過(guò)導(dǎo)向RNA（guide RNA，gRNA）互補(bǔ)識(shí)別目標(biāo)基因的特異靶序列，核酸酶Cas9切割與gRNA互補(bǔ)的基因組DNA區(qū)域，引起目標(biāo)基因DNA雙鏈斷裂，生物體在修復(fù)斷裂DNA的過(guò)程中引入堿基突變[5]。CRISPR/Cas9技術(shù)已成功地在擬南芥、水稻、小麥、玉米、番茄、煙草、大豆等農(nóng)作物中實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的編輯突變[2,6-8]。Aux/IAA家族基因編碼半衰期極短的蛋白，典型的Aux/IAA蛋白含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：DomainⅠ、DomainⅡ、DomainⅢ和DomainⅣ，其中DomainⅠ和DomainⅡ位于氨基酸序列N端，DomainⅢ和DomainⅣ位于氨基酸序列C端，DomainⅠ能夠與阻遏物結(jié)合，是轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域；DomainⅡ區(qū)域含有5個(gè)保守氨基酸的泛素化降解靶點(diǎn)，該保守氨基酸的編碼堿基突變會(huì)引起Aux/IAA蛋白不能被泛素化降解，增加Aux/IAA蛋白的穩(wěn)定性，使ARF轉(zhuǎn)錄因子長(zhǎng)時(shí)間被Aux/IAA蛋白結(jié)合阻遏，不能激活生長(zhǎng)素下游響應(yīng)基因的表達(dá)[9-10]；DomainⅢ和DomainⅣ則負(fù)責(zé)與ARF蛋白C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成異源二聚體，抑制ARF對(duì)下游基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄，阻斷生長(zhǎng)素信號(hào)途徑[11-12]。水稻基因組中共鑒定出31個(gè)Aux/IAA基因，分布在12條染色體上，在水稻生長(zhǎng)發(fā)育不同階段的多個(gè)組織、器官中呈現(xiàn)出多樣化的表達(dá)模式，并受外源水楊酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素、生長(zhǎng)素、茉莉酸等激素影響[13-14]，參與水稻多個(gè)組織器官的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的生理表型。前人研究報(bào)道，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的株高變矮，植株分蘗角增大，株型變得松散，而主根變長(zhǎng)，根系數(shù)目增加，并對(duì)外源生長(zhǎng)素處理不敏感[15]；的DomainⅡ區(qū)域點(diǎn)突變的過(guò)表達(dá)水稻變得對(duì)外源生長(zhǎng)素和重力刺激不敏感，側(cè)根和不定根變短，冠狀根減少，葉片變短，維管組織發(fā)育受到影響[16]；的表達(dá)則受干旱脅迫誘導(dǎo)，并在水稻莖基部的分裂組織中特異性表達(dá)，調(diào)節(jié)水稻對(duì)干旱的響應(yīng)和分蘗芽的發(fā)生[17]；參與的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑調(diào)控水稻側(cè)根發(fā)育起始基因表達(dá)，缺失突變的水稻植株側(cè)根數(shù)減少，根系對(duì)重力響應(yīng)缺失，側(cè)根發(fā)育起始基因表達(dá)模式發(fā)生改變[18]；則在水稻病毒感染過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，在矮縮病毒感染水稻時(shí)，矮縮病毒P2蛋白與水稻OsIAA10蛋白直接互作，抑制OsIAA10蛋白通過(guò)26S蛋白酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程，使得感病水稻的OsIAA10蛋白積累顯著高于健康植株，阻礙生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，增強(qiáng)了矮縮病毒的復(fù)制侵染能力，而敲除突變植株則對(duì)水稻矮縮病毒的抗性顯著增強(qiáng)[19]；介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)在水稻根尖靜止中心功能維持中起重要作用，水稻突變體根尖的靜止中心缺失，側(cè)根和不定根數(shù)目減少且發(fā)育不良，植株生長(zhǎng)遲緩，花粉育性變差，結(jié)實(shí)率降低，根對(duì)重力反應(yīng)消失[20]；而目前被報(bào)道參與調(diào)控水稻側(cè)根起始，點(diǎn)突變嚴(yán)重阻礙植株側(cè)根原基的發(fā)生，導(dǎo)致無(wú)側(cè)根表型[21]。以上這些研究表明，水稻Aux/IAA基因家族介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑參與了水稻側(cè)根分化、分蘗發(fā)生、株型構(gòu)建等組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，以及干旱抗性、病毒侵染等環(huán)境因子響應(yīng)，然而，水稻仍有大多數(shù)Aux/IAA基因的生物學(xué)功能有待被進(jìn)一步揭示?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已被報(bào)道參與水稻側(cè)根發(fā)育起始過(guò)程，然而筆者前期通過(guò)灌漿期葉片早衰突變體水稻材料研究發(fā)現(xiàn)，在水稻產(chǎn)量形成階段，的表達(dá)豐度顯著異于野生型，早衰突變體的株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、收獲指數(shù)等農(nóng)藝指標(biāo)均顯著低于野生型，豐度與產(chǎn)量形成因子間呈現(xiàn)一定的相互關(guān)系[22]，而對(duì)介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)與產(chǎn)量形成之間的調(diào)控機(jī)制仍不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)粳稻中花11（ZH11）的進(jìn)行編輯突變，并通過(guò)測(cè)序分析鑒定編輯植株的基因突變類型，田間試驗(yàn)調(diào)查突變體的農(nóng)藝性狀指標(biāo)，以期探究突變對(duì)農(nóng)藝特性和產(chǎn)量構(gòu)成因子的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以粳稻中花11（ZH11）作為重組載體轉(zhuǎn)化的受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行重組pYLCRISPR/ Cas9-IAA11-T12表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因水稻材料種植于福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)轉(zhuǎn)基因管理區(qū)，采用適合當(dāng)?shù)販毓鈼l件的常規(guī)田間管理措施。

pYLgRNA-U6a、pYLgRNA-U6b、以及pYLCRISPR/ Cas9-MT載體由福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院朱強(qiáng)教授惠贈(zèng)，最初來(lái)源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)用的編輯靶點(diǎn)序列和引物序列（表1）、以及核酸測(cè)序服務(wù)均由生工生物工程（上海）股份有限公司實(shí)施完成，Ⅰ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、KOD-Plus-Neo高保真酶則分別從NEB（北京）有限公司、寶生物工程（大連）有限公司、東洋紡（上海）生物科技有限公司購(gòu)買。

1.2 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和CRISPR/Cas9編輯載體構(gòu)建

根據(jù)水稻（LOC_Os03g43400）序列特征，利用CCTop - CRISPR/Cas9 target online predictor在線軟件分別在第1和第2外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)編輯靶點(diǎn)（圖1-A），并將2個(gè)靶點(diǎn)序列在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，以消除非特異性靶點(diǎn)干擾。在靶點(diǎn)1序列的2條單鏈5′端添加gccg和aaac酶切序列，使其與pYL-U6a-gRNA載體經(jīng)Ⅰ（NBE）酶切后形成黏性末端接頭，在靶點(diǎn)2序列的2條單鏈5′端添加gttg和aaac序列（表1），使其與pYL-U6b-gRNA載體經(jīng)Ⅰ酶切后形成互補(bǔ)黏性末端。

參照MA等[23]方法構(gòu)建雙靶點(diǎn)pYLCRISPR/ Cas9-IAA11-T12表達(dá)載體，首先將含接頭的2個(gè)靶點(diǎn)分別與pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA載體連接，利用引物U-F：5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′和gRNA-R：5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含靶點(diǎn)序列的U6a-IAA11-T1和U6b- IAA11-T2表達(dá)盒；通過(guò)接頭引物Uctcg-B1′/gRctga-B2（上游：5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAA TCGGCAGCAAAGG-3′，下游：5′-AGCGTGGGTCTC GTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′）和Uctga-B2′/ gRcggt-BL（上游：5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACT GGAATCGGCAGCAAAGG-3′，下游：5′-AGCGTGG GTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′）分別經(jīng)PCR擴(kuò)增為U6a-IAA11-T1和U6b-IAA-T2表達(dá)盒加入特異性接頭，依照?qǐng)D1-B所示，使用Ⅰ內(nèi)切酶、T4 NDA連接酶將U6a-IAA11-T1和U6b- IAA11-T2表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9-MT載體連接，構(gòu)建好的重組載體經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板培養(yǎng)后，挑取單菌落用于測(cè)序，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，并侵染轉(zhuǎn)化粳稻ZH11愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR擴(kuò)增潮霉素基因篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。

表1 所用的引物序列

序列中的小寫字母為Ⅰ內(nèi)切酶的黏性末端接頭 The lowercase letters stand for sticky end joints ofⅠ restriction endonuclease

1.3 基因編輯株系的靶點(diǎn)分析與鑒定

為檢測(cè)的靶點(diǎn)突變情況，在2個(gè)靶點(diǎn)序列兩側(cè)分別設(shè)計(jì)引物OsIAA11-T1-F/OsIAA11-T1-R和OsIAA11-T2-F/OsIAA11-T2-R（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為443和469 bp，通過(guò)CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增片段送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與野生型DNA的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定突變植株的基因變異類型。

1.4 突變體植株的農(nóng)藝性狀調(diào)查

突變體水稻種子在浸種、催芽后，于2020年4月5日點(diǎn)播在育秧田中，待長(zhǎng)出新葉后，對(duì)正常成苗的植株進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)，每株剪取約2 cm長(zhǎng)度葉片提取DNA，用以進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)，鑒定出的純合突變植株于4月30日移栽，各突變體經(jīng)測(cè)序檢測(cè)得到的純合突變植株，分別于試驗(yàn)小區(qū)種植6行，每行栽種8株，單本插秧，株行距為25 cm×25 cm，不同突變體之間種植3行野生型ZH11作間隔，試驗(yàn)田邊界種植3行ZH11隔離行，每個(gè)突變體材料設(shè)置2個(gè)重復(fù)試驗(yàn)小區(qū)，進(jìn)行常規(guī)田間栽培管理和病蟲(chóng)草害防除。在6月上旬水稻孕穗期前2周時(shí)的分蘗高峰期，挑選長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的植株統(tǒng)計(jì)總分蘗數(shù)，待7月下旬水稻成熟時(shí)，考察突變體水稻的株高、有效穗、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、種子結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量、生物產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀指標(biāo)，并計(jì)算成穗率、收獲指數(shù)和谷草比。利用SPSS13.0軟件計(jì)算農(nóng)藝性狀指標(biāo)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，使用單因素方差分析法比較數(shù)據(jù)的種間差異，以≤0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 OsIAA11靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12載體構(gòu)建

位于水稻第3染色體，DNA序列編碼區(qū)全長(zhǎng)為3 373 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，以第1和第2外顯子作為突變區(qū)域設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，選取第1外顯子的反義鏈+270到+272 bp處的GGG為PAM（protospacer-adjacent motif）序列，+273到+292 bp之間的20 bp堿基作為靶點(diǎn)1序列，以第2外顯子+1 944到+1 946 bp處的TGG堿基為PAM序列， +1 924到+1 943 bp區(qū)間的20 bp堿基作為靶點(diǎn)2的編輯序列（圖1-A）。由圖1-B的氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明，OsIAA11氨基酸序列具備典型的Aux/IAA蛋白結(jié)構(gòu)，共包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中，結(jié)構(gòu)域Ι具有2個(gè)與乙烯響應(yīng)因子相關(guān)的反應(yīng)抑制EAR基序，以及位于2個(gè)EAR基序間的一個(gè)核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）；結(jié)構(gòu)域Ⅱ含有保守的TIR1/AFB識(shí)別序列“GWPPV”的降解決定子，以及一個(gè)NLS，編輯靶點(diǎn)1位于結(jié)構(gòu)域Ⅱ核心序列“GWPPV”上游的PDKPRA氨基酸區(qū)域；結(jié)構(gòu)域Ⅲ為βαα-折疊域，在Aux/IAA與ARF蛋白互作中起作用，編輯靶點(diǎn)2位于該結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域Ⅳ含有一個(gè)與蛋白質(zhì)靜電作用相關(guān)的保守“GDVP”基序，以及一個(gè)SV40型NLS片段。

A：OsIAA11的2個(gè)gRNA靶點(diǎn)位置；B：OsIAA11氨基酸序列結(jié)構(gòu)；C：2個(gè)靶位點(diǎn)gRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9-MT組裝成的表達(dá)載體。LB：左邊界；RB：右邊界

為使重組CRISPR/Cas9載體中的2個(gè)靶點(diǎn)序列分別由OsU6a和OsU6b啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，通過(guò)酶切、連接將雙鏈靶點(diǎn)序列1與pYL-U6a-gRNA載體連接，靶點(diǎn)序列2與pYL-U6b-gRNA載體連接，再經(jīng)2次PCR擴(kuò)增獲得含特異性酶切位點(diǎn)和連接接頭的啟動(dòng)子-gRNA1表達(dá)盒和啟動(dòng)子-gRNA2表達(dá)盒，依據(jù)圖1-C連接方式將2個(gè)表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9-MT載體連接，獲得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重組表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序分析表明，重組載體中的2個(gè)靶點(diǎn)序列（圖2）與設(shè)計(jì)序列一致（表1），靶點(diǎn)準(zhǔn)確連接到pYLCRISPR/Cas9載體上，重組載體pYLCRISPR/ Cas9-IAA11-T12適合轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。

圖2 pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重組載體中2個(gè)靶點(diǎn)序列測(cè)序結(jié)果

2.2 獲得T0代陽(yáng)性植株

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pYLCRISPR/Cas9-IAA-T12重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化ZH11愈傷組織，經(jīng)培養(yǎng)再生得到25株轉(zhuǎn)化株系，提取每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA，采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)潮霉素標(biāo)記基因，由圖3結(jié)果可見(jiàn)，共有20株轉(zhuǎn)基因植株可以擴(kuò)增出280 bp長(zhǎng)度的條帶，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，有5株植株的DNA擴(kuò)增不出潮霉素標(biāo)記基因，為陰性植株，陽(yáng)性率約達(dá)80%。

-：陰性對(duì)照；+：陽(yáng)性對(duì)照；M：2000 bp的DNA marker -: negative contro; +: positive control; M: 2000 bp DNA marker

2.3 鑒定osiaa11突變體植株的基因突變類型

為了從轉(zhuǎn)基因株系中篩選出純合突變植株，對(duì)T2代植株的目標(biāo)基因靶點(diǎn)及其上、下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析（圖4）。以T2代突變體水稻DNA為模板的PCR反應(yīng)中，2個(gè)靶點(diǎn)位置均能擴(kuò)增出特異性條帶，靶點(diǎn)1的PCR產(chǎn)物大小為443 bp，靶點(diǎn)2的PCR產(chǎn)物大小為469 bp。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析表明，共有17種在2個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域都發(fā)生突變的純合突變類型水稻植株，除、、和在第1個(gè)靶點(diǎn)、以及在第2個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生單堿基插入突變外，其他突變植株的靶點(diǎn)處均表現(xiàn)為堿基缺失突變。和在第1個(gè)靶點(diǎn)缺失24個(gè)堿基，在第2個(gè)靶點(diǎn)處為單堿基缺失，但2個(gè)突變體植株缺失的堿基類別有差異，易引起表達(dá)產(chǎn)物中氨基酸殘基丟失和移碼翻譯；突變體則在2個(gè)靶點(diǎn)都缺失24個(gè)堿基，共形成外顯子區(qū)域丟失48個(gè)堿基，會(huì)造成翻譯產(chǎn)物缺失16個(gè)氨基酸；和突變體在第1靶點(diǎn)缺失含22個(gè)差異堿基的小片段，在第2個(gè)靶點(diǎn)則分別丟失單個(gè)G和T堿基；、、和突變體在第1個(gè)靶點(diǎn)分別缺失6、7、3和10個(gè)堿基，而在第2個(gè)靶點(diǎn)則缺失單個(gè)G堿基；、和突變體分別在第1個(gè)靶點(diǎn)丟失3、1和6個(gè)堿基，在第2個(gè)靶點(diǎn)則缺失2、9和2個(gè)堿基，會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列移碼變異。測(cè)序鑒定結(jié)果表明，采用雙靶點(diǎn)編輯明顯增加了突變類型的多樣性，獲得了較多堿基片段變異多樣化的突變體種質(zhì)材料。

為檢驗(yàn)17種純合突變體植株中是否含潮霉素篩選基因，利用潮霉素基因特異引物通過(guò)PCR擴(kuò)增突變體基因組DNA（圖5），突變體DNA能擴(kuò)增出1 002 bp的潮霉素基因PCR產(chǎn)物，突變體DNA有較弱的潮霉素?cái)U(kuò)增產(chǎn)物條帶，表明和突變體中有潮霉素基因殘留，體內(nèi)含有轉(zhuǎn)基因載體DNA片段，其他突變體植株DNA均未檢測(cè)出潮霉素基因殘留，植株體內(nèi)不含轉(zhuǎn)基因載體DNA成分。

A：T2代部分轉(zhuǎn)基因水稻植株OsIAA11編輯靶點(diǎn)附近DNA片段的PCR檢測(cè)，靶點(diǎn)1的擴(kuò)增長(zhǎng)度為443 bp，靶點(diǎn)2的擴(kuò)增長(zhǎng)度為469 bp，野生型（WT）為ZH11；B：轉(zhuǎn)化植株編輯靶點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測(cè)序序列與野生型（WT）序列的比對(duì)結(jié)果，藍(lán)色字母為靶點(diǎn)序列，紅色大寫字母表示PAM序列，刪除線表示缺失堿基，紅色小寫字母表示插入堿基，-：缺失，+：插入，WT：野生型

2.4 osiaa11突變體農(nóng)藝性狀

對(duì)T2代突變體純合植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，在獲得的17種不同基因型突變水稻材料中，突變體植株的株高為（60.5±1.50）cm，顯著低于野生型（69.6±0.8）cm，其余16種基因型突變水稻的株高與野生型無(wú)顯著差異；突變體的有效穗數(shù)為（12.00±2.00）個(gè)，較野生型水稻顯著增加，其他突變體的有效穗數(shù)與野生型無(wú)顯著差異。野生型ZH11的分蘗成穗率為89.78%，而突變水稻植株的分蘗成穗率僅為26%—57%，顯著低于野生型，表明突變植株的無(wú)效分蘗變多，降低了分蘗成穗率，而有效穗數(shù)基本維持不變，總分蘗數(shù)有所增多。此外，突變植株的穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、以及收獲指數(shù)和谷草比等產(chǎn)量指標(biāo)與野生型植株間的差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平；在單株產(chǎn)量方面，、、和突變體植株的產(chǎn)量為18.3—22.45 g，比野生型提高70%以上，而其他突變植株的單株產(chǎn)量與野生型無(wú)顯著差異。

-：陰性對(duì)照；+：陽(yáng)性對(duì)照；M：2000 bp DNA marker -: negative control; +: positive control; M: 2000 bp DNA marker

3 討論

稻米作為全球主要的糧食作物之一，養(yǎng)育著世界上半數(shù)以上人口，尤其是進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，伴隨著全球人口持續(xù)增長(zhǎng)、耕地面積和水肥資源逐步減少、極端自然災(zāi)害頻發(fā)、生態(tài)環(huán)境逐步惡化，糧食短缺問(wèn)題變得日益嚴(yán)峻[24]。解決當(dāng)前糧食困境的有效措施主要有兩方面：一方面是開(kāi)發(fā)拓展可用耕地面積，例如當(dāng)前隨著中國(guó)“一帶一路”和中非合作的持續(xù)開(kāi)展，由中資企業(yè)提供資金和技術(shù)，在非洲地區(qū)開(kāi)墾閑散農(nóng)田，建立以大米種植為主、多種糧食及經(jīng)濟(jì)作物為輔，集農(nóng)田開(kāi)發(fā)、糧食生產(chǎn)、倉(cāng)儲(chǔ)、加工、銷售為一體的綜合農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園取得了較好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、以及社會(huì)效益，有效緩解了地區(qū)性糧食需求和社會(huì)就業(yè)，促進(jìn)區(qū)域性經(jīng)濟(jì)發(fā)展[25]；另一方面是在現(xiàn)有耕地面積基礎(chǔ)上，突破傳統(tǒng)育種手段和栽培措施的技術(shù)瓶頸，借助當(dāng)前生物科技水平，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、高效的分子設(shè)計(jì)育種和精確定量化栽培，努力提高單位耕地的稻米產(chǎn)量[24,26]。

傳統(tǒng)育種技術(shù)需要經(jīng)歷多代回交篩選，育種工作量較大，目標(biāo)性狀篩選繁瑣，育種周期較長(zhǎng)，效率低下，且容易受連鎖基因干擾。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)能精確、高效地編輯目標(biāo)基因，快速獲得目標(biāo)性狀改善并能穩(wěn)定遺傳的純合突變植株，極大縮短優(yōu)良性狀的遺傳改良周期。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)雙靶點(diǎn)編輯方式，對(duì)進(jìn)行定點(diǎn)突變，相對(duì)于許多研究中單靶點(diǎn)編輯得到較多單一堿基突變的編輯方式[27-28]，極大地提高了對(duì)的編輯效率，本研究從T2代植株中篩選出了較多短片段缺失基因型突變植株（圖4-B），突變種類較為豐富，極大地提高了變異的多樣性。此外，鑒于CRISPR/ Cas9編輯植株的T0代轉(zhuǎn)基因株系會(huì)產(chǎn)生純合突變、雜合突變、雙等位突變、以及未發(fā)生突變等4種基因型植株，純合突變株系比例相對(duì)較少[29]，若想獲得較多的變異類型，必須對(duì)雜合突變植株、雙等位突變等轉(zhuǎn)基因植株的后代分離情況進(jìn)行分析與鑒定，工作量相對(duì)較為繁瑣，本研究直接對(duì)T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的T2后代植株編輯靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，從T2后代中篩選獲得了較為豐富的純合突變植株，如和、和、和、和、和、和、和等突變植株分別是T0代植株、、、、、、以及的T2后代分離產(chǎn)生的純合植株，而、和突變植株的T0代株系為純合突變型，在從T0代到T2代的遺傳過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生基因分離，T2后代植株中未產(chǎn)生其他的突變類型。另外，和突變植株在靶點(diǎn)1區(qū)域?yàn)閱螇A基插入突變，在靶點(diǎn)2區(qū)域?yàn)閱螇A基缺失突變，堿基突變方式相對(duì)簡(jiǎn)單，而堿基以成片段的缺失突變則多出現(xiàn)在T0代中的雜合突變或雙等位突變植株中，從其T2后代中能分離鑒定到純合的片段堿基缺失突變植株。此外，對(duì)從T2代獲得的17種純合突變體植株內(nèi)的潮霉素抗性基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅有2個(gè)突變體內(nèi)有潮霉素基因殘留，表明其含有轉(zhuǎn)基因載體的DNA片段（圖5），其余15個(gè)純合突變體則均無(wú)載體DNA殘留，可以進(jìn)一步用于與其他常規(guī)品種間的雜交育種或生物功能分析。

生長(zhǎng)素在水稻生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境因子響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，并最終引起稻米產(chǎn)量形成因子改變，本研究對(duì)17個(gè)純合突變植株的產(chǎn)量形成指標(biāo)進(jìn)行了初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)突變體植株的分蘗成穗率顯著降低，有效穗數(shù)與野生型差異不顯著，而穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率、收獲指數(shù)、谷草比等指標(biāo)變化不明顯（表2），表明突變引起了無(wú)效分蘗數(shù)增多，Zhu等[21]研究點(diǎn)突變的水稻根系時(shí)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變能抑制植株側(cè)根原基形成，引起無(wú)側(cè)根表型，本研究表明，可能在生長(zhǎng)素控制水稻分蘗芽形成和促進(jìn)側(cè)根發(fā)育過(guò)程中起作用，突變會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)素對(duì)側(cè)芽發(fā)育的調(diào)控作用削弱，并抑制對(duì)側(cè)根促進(jìn)作用，而具體的分子生態(tài)調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入探索。在水稻栽培實(shí)踐中，生育前期適當(dāng)促進(jìn)分蘗芽多發(fā)早發(fā)，配合相應(yīng)的高產(chǎn)栽培措施，可使無(wú)效分蘗轉(zhuǎn)化為有效分蘗，提高分蘗成穗率；在分蘗后期，合理減少水肥使用，削弱遲發(fā)分蘗的形成，能有效促使葉、莖、蘗等部位的同化物質(zhì)向稻穗籽粒中轉(zhuǎn)移，有利于提高稻谷的結(jié)實(shí)率和千粒重，進(jìn)而達(dá)到較高的收獲指數(shù)和谷草比，因此，本研究獲得的突變體和觀察到的突變體分蘗芽增多現(xiàn)象，對(duì)水稻合理株型的稻作群體構(gòu)建，有效利用環(huán)境溫光因子等農(nóng)業(yè)生態(tài)調(diào)控具有一定的實(shí)踐意義，也對(duì)探索參與的生長(zhǎng)素調(diào)控分蘗芽發(fā)生的分子生態(tài)機(jī)理研究具有積極的理論意義。

表2 不同類型osiaa11突變體植株及其野生型水稻（WT）的田間農(nóng)藝性狀

表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著

Data listed in the table are presented as average values ± standard deviation; values followed by the different letter within the same column are significantly different at the 0.05 probability level

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，獲得17種不同基因型純合突變植株。突變體植株的株高、有效穗、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、收獲指數(shù)、以及谷草比等農(nóng)藝指標(biāo)與野生型植株無(wú)顯著差異，但分蘗成穗率顯著降低。

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CRISPR/Cas9 Targeted Editing of

LI ZhaoWei1, LING DongLan1, SUN CongYing1, ZENG HuiLing1, LIU KaiJi1, LAN YingShan1, FAN Kai2, LIN WenXiong1

1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;2College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

【】Auxin signaling pathway regulated byplays an important role in the plant growth and response to various environment stresses, impacting on the final grain yield during the late stage. To explore the effect ofmutation on the yield, themutant plant was obtained using CRISPR/Cas9 system, and the agronomic characters of mutant plants were investigated in the field. 【】According to the principle of CRISPR/Cas9 technology, two 20 bp targeted sequences were designed in the first exon and second exon of thegenome sequence. The gene shuffling of non-specific target sites was eliminated using the blast analysis. The oligonucleotides of two target sites were inserted into the pYLgRNA-U6a and pYLgRNA-U6b plasmid vector, and then were amplified twice by PCR technology to construct U6a-IAA11-T1 and U6b-IAA11-T2 expression-boxes. The recombinant pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12 vector was obtained by linking two expression-boxes to pYLCRISPR/Cas9-MT vector. The pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12 vector was transformed into the callus ofrice ZH11 through-mediated method. The T0generation of transgenic plants was obtained by tissue culture, and the positive transgenic plants were selected through PCR method. The target sites of each T2generation from T0positive plants were determined via PCR and sequencing method, and finally the mutated genotypes were identified. Meanwhile, agronomic traits of the T2generation were investigated in the field. 【】The pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12 expression vector was successfully transformed into the callus of ZH11. 25 transgenic lines were obtained, and 20 transgenic lines were identified as the positive plants. After analysis of T2transgenic plants via PCR and sequencing the target locus, 17 different homozygous mutations were identified in the two target sites of thegenomic sequence. Except for the single base insertion mutation of,,, andmutants did not present a significant difference in plant height, panicle length, grain number per panicle, seed setting rate, 1000-grain weight, harvest index, and grain-straw ratio in comparison with the wild type. However, thedisplayed a significant decrease in effective spike rate, suggesting a more ineffective tiller phenotype. 【】CRISPR/Cas9 technology successfully editedand 17 different homozygous mutations genotypes were obtained. The mutant showed the reduced effective spike rate and increased ineffective tillers, indicating thatwas related to the tiller bud appearance dominated by auxin.

rice; gene editing;; CRISPR/Cas9 technology;mutant

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.001

2020-12-03；

2021-01-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31701329）、中國(guó)博士后科學(xué)基金（2015M580560）

李兆偉，E-mail：lizw197@163.com。通信作者林文雄，E-mail：wenxiong181@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）