李艷林，Shahid Iqbal，侍婷，宋娟，倪照君，高志紅

梅克隆及其在花發(fā)育中與內(nèi)源激素的調(diào)控模式

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南京 210014

【】分析梅的生物學(xué)功能，探究梅花發(fā)育進(jìn)程中其表達(dá)豐度與內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化的關(guān)系，為梅花發(fā)育的調(diào)控研究提供依據(jù)。以梅品種‘大嵌蒂’為試材，克隆，利用生物信息學(xué)軟件分析基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化及其與其他物種同源蛋白的差異；亞細(xì)胞定位確定PmARF17蛋白在細(xì)胞中作用的部位；以梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’不同發(fā)育階段的花芽、葉芽、花器官為試材，利用qRT-PCR檢測(cè)時(shí)空表達(dá)模式，通過UPLC法測(cè)定IAA、GA3、ABA、ZT含量的動(dòng)態(tài)變化，并與的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析；克隆啟動(dòng)子，分析啟動(dòng)子的順式作用元件，利用瞬時(shí)表達(dá)解析與GA3的調(diào)控模式。從梅品種‘大嵌蒂’中克隆得到，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明PmARF17蛋白與其他植物的ARF蛋白序列高度同源；亞細(xì)胞定位表明其作用于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上；qRT-PCR表達(dá)和內(nèi)源激素含量的相關(guān)性分析表明，的表達(dá)與IAA含量的變化趨勢(shì)沒有明顯的相關(guān)性。在雌蕊完好花芽中的表達(dá)水平相對(duì)不完全花芽顯著上調(diào)，而GA3含量與的表達(dá)趨勢(shì)一致。ABA和ZT含量總體上與的表達(dá)呈相反的趨勢(shì)，表明兩者可能抑制的表達(dá)。啟動(dòng)子含有GA順式元件，且具有啟動(dòng)活性和組織表達(dá)特異性，在花瓣、雄蕊及根部特異表達(dá)。可能是梅花發(fā)育的正調(diào)控基因，促進(jìn)梅雌蕊的正常發(fā)育。的表達(dá)可能受到GA3的正調(diào)控，其可能通過作用于雄蕊和花瓣，進(jìn)而影響梅的雌蕊發(fā)育進(jìn)程。

梅；生長(zhǎng)素響應(yīng)因子；雌蕊發(fā)育；基因表達(dá)；內(nèi)源激素；瞬時(shí)表達(dá)

0 引言

【研究意義】梅（Sieb. et Zucc）原產(chǎn)于中國(guó)，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的加工價(jià)值和保健功能。然而梅雌蕊敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，并且嚴(yán)重影響果梅產(chǎn)量，限制了果梅的增產(chǎn)、創(chuàng)收[1]。研究表明，雌蕊敗育現(xiàn)象和自身的調(diào)控基因有重要的關(guān)系[2]，植物生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）在雌蕊等花器官生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用[3-4]?；ǖ陌l(fā)育與植物激素之間存在一定的關(guān)系[5-8]。ARF與植物激素在梅花雌蕊發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制尚未明確，本研究可為果梅生產(chǎn)難題的克服及雌蕊敗育作用機(jī)理的探明提供重要參考。【前人研究進(jìn)展】植物ARF屬于一種可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子家族[9]。功能多樣，一些可以作為生長(zhǎng)素信號(hào)通路中的生長(zhǎng)素受體調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[10-11]。Song等[12]在梅ARF家族進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，與擬南芥聚為一類，為直系同源基因，具有相似的保守功能。而不僅可以在生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過程中獨(dú)立起作用，還可能與、、等相互作用，從而影響雌蕊原基的形態(tài)建成，進(jìn)而影響雌蕊發(fā)育[13-16]。研究表明，影響梅花發(fā)育的主要因素是營(yíng)養(yǎng)素、植物激素和鈣調(diào)蛋白[17]，ARF可能會(huì)在植物生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中影響某些植物激素，如ARF與赤霉素（GA）影響番茄果實(shí)的萌發(fā)和發(fā)育[18-19]。研究表明，生長(zhǎng)素在生物合成水平上或通過促進(jìn)DELLA的降解與GA正向相互作用[20-23]；ABA和CTK都與GA拮抗，參與多種發(fā)育過程的調(diào)節(jié)[24]。目前，在許多物種中已經(jīng)進(jìn)行了花發(fā)育與植物激素之間相互作用模式的研究，如玉米[25]、小麥[26]、榨菜[27]、油菜[28]、荔枝[29-30]、白樺[31]、羅漢果[32]等。植物啟動(dòng)子起著決定基因活性的“開關(guān)”作用，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來間接控制基因的活性。啟動(dòng)子含有多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而使植物能夠抵抗外部環(huán)境脅迫。因此，對(duì)植物啟動(dòng)子的功能研究有助于闡明植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制[33]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組前期在梅ARF家族進(jìn)化分析研究中推測(cè)在梅雌蕊發(fā)育中可能起到重要的調(diào)控作用，而ARF與植物激素在梅花雌蕊發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制尚未明確，是否參與了梅雌蕊敗育及其調(diào)控方式有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究的結(jié)構(gòu)特征及其在梅花不同時(shí)期花芽、花器官中的時(shí)空表達(dá)模式；與IAA、GA3、ABA、ZT內(nèi)源激素在梅雌蕊發(fā)育中的調(diào)控模式及對(duì)雌蕊發(fā)育的影響；分析啟動(dòng)子的順式元件及組織特異性表達(dá)部位，探究與GA3存在的調(diào)控模式。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)材料為梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’，均處于盛果期。盛花期梅品種‘大嵌蒂’的不完全花比例高達(dá)76.3%，雌蕊敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，是研究梅雌蕊敗育機(jī)制的重要材料；‘龍眼’雌蕊發(fā)育良好，敗育率低，是研究梅雌蕊敗育機(jī)制的重要對(duì)照材料[34]。采集‘大嵌蒂’和‘龍眼’2017年9月20日、10月20日、11月20日、12月20日、2018年1月20日的花芽和葉芽（花芽與葉芽區(qū)分方法：花芽飽滿、較大，位于中間；葉芽較小，位于兩側(cè)）；于2018年2月3日采集‘大嵌蒂’雌蕊完好、雌蕊缺失、雌蕊褐色、雌蕊畸形4種類型花芽；于2018年3月13日采集‘大嵌蒂’成熟花器官，主要有完全花的雌蕊、雄蕊、花瓣、萼片，不完全花的雄蕊、花瓣、萼片，共計(jì)7種成熟花器官（此處不完全花為雌蕊缺失的花）。在體視顯微鏡下觀察雌蕊發(fā)育完整與否，進(jìn)而分離獲得4種類型花芽及7種成熟花器官。

本氏煙草（）用于基因亞細(xì)胞定位；剛開花的擬南芥苗（）用于啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。

1.2 PmARF17及其啟動(dòng)子的克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)梅基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列Pm031349及真核生物啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件UCSC: http://genome. ucsc.edu/確定啟動(dòng)子的分布區(qū)域?yàn)镃DS編碼區(qū)上游，在其預(yù)測(cè)所得CDS編碼區(qū)上游序列選取約2 000 bp。引物分別設(shè)計(jì)為gene-F、gene-R及promoter-F、promoter-R（表1），以梅品種‘大嵌蒂’11月份花芽cDNA和總DNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL：5×PrimerSTAR GXL Buffer （5 μL）、dNTP Mixture（2 μL）、PrimerSTAR GXL DNA Polymerase（0.5 μL）（Takara）、ddH2O（14 μL）、上下游引物各0.5 μL、cDNA/稀釋DNA模板2.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 5 min；98℃ 10 s，56℃ 15 s，68℃ 150 s，35個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min；4℃保存。膠回收后與pClone007 Blunt Simple Vector（TSINGKE）連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。

使用GSDS（http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/）在線工具對(duì)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，并繪制基因結(jié)構(gòu)圖；通過ProtParam和ExPASy軟件分析PmARF17蛋白的基本理化特性；使用DNAMAN 9.0和ClustalX 2.1軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和同源性分析；保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通過在線軟件Pfam和PROSTIE分析；通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建PmARF17蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；使用在線軟件TSSP及PlantCARE分析克隆所得的啟動(dòng)子順式元件。

表1 引物序列及用途

下劃線部分為酶切位點(diǎn) The underlined base sequences in the primers represent corresponding restriction enzyme site

1.3 PmARF17蛋白的亞細(xì)胞定位

將的CDS序列插入pCAMBIA1302載體，選擇在該載體CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子與mGFP5序列標(biāo)簽之間插入。采用II單酶切體系，載體構(gòu)建如圖3-A。引物設(shè)計(jì)為PmARF17 GFP-F、PmARF17 GFP-R（表1）。用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序及體系與1.2一致。測(cè)序正確后進(jìn)行II單酶切驗(yàn)證，從而獲得正確的植物融合表達(dá)載體pCAMBIA1302--GFP。將pCAMBIA1302（空載體）和pCAMBIA1302--GFP分別轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，分別注入煙草葉片下表皮細(xì)胞。采用激光掃描共聚焦（Zeiss，德國(guó)）顯微鏡觀察PmARF17蛋白在細(xì)胞中的定位。

1.4 PmARF17在花發(fā)育中的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）測(cè)定在‘大嵌蒂’和‘龍眼’花芽、葉芽、成熟花器官中的表達(dá)水平，其中設(shè)置葉芽是為了與同時(shí)期花芽中的表達(dá)形成對(duì)照，從側(cè)面表現(xiàn)出在花芽中的表達(dá)特點(diǎn)（下文中葉芽中激素水平測(cè)定與此同理）。的qRT-PCR引物設(shè)計(jì)為：qPCR-F，qPCR-R（表1）。以梅為內(nèi)參基因，引物設(shè)計(jì)為：-F、-R（表1）[35]。熒光定量PCR儀（ABI 7500）產(chǎn)自美國(guó)，實(shí)時(shí)熒光定量體系參照SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa Ⅱ，日本）試劑盒說明書，各樣品cDNA濃度均嚴(yán)格控制在200 ng?μL-1，20 μL反應(yīng)體系為：95℃4 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)。每處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)，數(shù)據(jù)分析采用ABI7500 system軟件2-ΔΔCt方法（?Ct=Ct-Ct）進(jìn)行分析計(jì)算。

1.5 梅花發(fā)育過程中內(nèi)源激素的提取及測(cè)定

采用ACQUITY H-Class UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters公司）測(cè)定梅不同時(shí)期不同類型花芽、葉芽、不同成熟花器官中IAA、GA3、ABA、ZT內(nèi)源激素的含量[36-38]。植物激素IAA（純度>98%）、GA3（純度>98%）、ABA（純度>98%）、ZT（純度>98%）均購(gòu)自于上海源葉生物科技有限公司，色譜甲醇、乙睛（色譜純）、磷酸和乙酸乙酯（分析純）均為Sigma公司產(chǎn)品，超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

參照前人研究方法[39-40]提取和測(cè)定梅花芽、葉芽及不同花器官中的激素。將IAA、GA3、ABA、ZT激素分別配制濃度為0.01、0.02、0.05、0.1和0.2 mg?L-1的標(biāo)樣，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用ACQUITY H-Class UPLC超高效液相色譜測(cè)定標(biāo)樣和樣品激素含量。

1.6 PmARF17啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及功能分析

用啟動(dòng)子定向替換載體pBI121上能夠啟動(dòng)進(jìn)行表達(dá)的CaMV 35S序列，與融合，構(gòu)建pBI121-promoter-GUS融合表達(dá)載體。分別選擇I、I作為上、下游酶切位點(diǎn)，克隆引物設(shè)計(jì)為Promoter-I-F，Promoter-I-R（表1），PCR擴(kuò)增程序及體系同上。分別將測(cè)序和酶切正確的pBI121-promoter- GUS重組質(zhì)粒、pBI121空載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化成功的EHA105菌液重懸，分別侵染擬南芥植株，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)和GUS組織化學(xué)染色，根據(jù)順式元件分析及GUS染色結(jié)果研究該啟動(dòng)子的功能。

該瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)及GUS染色過程為：①選擇盛花期擬南芥苗；②將待侵染的擬南芥苗根部清洗干凈；③使用懸浮液侵染；④25℃、60 r/min下震蕩培養(yǎng)48 h，當(dāng)OD600=1時(shí)，更換新的菌液和懸浮液；⑤加入GUS染液進(jìn)行組織化學(xué)染色；⑥GUS染色過夜（約10 h）及脫色處理。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003軟件統(tǒng)計(jì)熒光定量表達(dá)及激素測(cè)定數(shù)據(jù)，并繪制相應(yīng)圖表。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行樣本間差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 PmARF17及其啟動(dòng)子的克隆和分析

測(cè)序表明，獲得的cDNA片段大小為2 342 bp，CDS區(qū)最大開放閱讀框ORF全長(zhǎng)為2 160 bp，編碼719個(gè)氨基酸。測(cè)序所得基因全長(zhǎng)為4 546 bp（圖1-A）。結(jié)構(gòu)繪制如圖1-C，包含11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子。

Pfam及PROSTIE分析表明，PmARF17的N端在第143—244位氨基酸處具有高等植物轉(zhuǎn)錄因子特有的B3-DNA binding domain結(jié)合域，在第270—350位具有Auxin response factor元件，未發(fā)現(xiàn)Aux-IAA結(jié)構(gòu)域。與擬南芥為直系同源基因，具有相似的保守功能[12]，而不僅可以在生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過程中獨(dú)立起作用，還可能與、、等相互作用，從而影響雌蕊原基的形態(tài)建成[15]。約1/4的梅PmARF蛋白缺少C末端Aux-IAA結(jié)構(gòu)域[12]，水稻[41]和番茄[42]中同樣有類似的報(bào)道，表明可能與擬南芥類似，具有獨(dú)立于生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PmARF17蛋白與其他植物的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子蛋白序列相似度很高。其中與山杏和桃的相似度最高，達(dá)98%，與甜櫻桃和豆櫻相似度達(dá)97%，與蘋果、白梨相似度達(dá)84%（圖1-B）。PmARF17 N端及C端蛋白序列較為保守，與其他植物ARF蛋白相似度高，具有ARF家族的保守結(jié)構(gòu)域（圖1-D）。為梅生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因，屬于生長(zhǎng)素響應(yīng)因子超家族。

A：PmARF17的cDNA和推導(dǎo)的氨基酸序列（下劃線標(biāo)出最大ORF，陰影為保守區(qū)）；B：PmARF17蛋白與其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；C：PmARF17的基因結(jié)構(gòu)；D：PmARF17蛋白與其他植物的同源性比較[藍(lán)色框?yàn)锽3 DNA binding domain，紅色框?yàn)锳uxin response factor元件。1.Seq：梅；2.Seq：山杏；3.Seq：桃；4.Seq：甜櫻桃；5.Seq：蘋果；6.Seq：白梨；7.Seq：葡萄；8.Seq：野草莓；9.Seq：楊樹；10.Seq：擬南芥；11.Seq：煙草；12.Seq：番茄]

啟動(dòng)子含有多種順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，對(duì)植物啟動(dòng)子的功能研究有助于闡明植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制。PlantCARE軟件分析表明啟動(dòng)子含有赤霉素GA作用元件GARE基序，如圖2所示。

2.2 PmARF17蛋白的亞細(xì)胞定位

融合表達(dá)載體pCAMBIA1302--GFP構(gòu)建如圖3-A所示。pCAMBIA1302空載在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有分布，而PmARF17蛋白僅在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上表達(dá)（圖3-B、C），表明PmARF17蛋白是細(xì)胞核和細(xì)胞膜兼有的功能蛋白。

2.3 PmARF17在梅花發(fā)育中的表達(dá)分析

2.3.1在‘大嵌蒂’和‘龍眼’不同時(shí)期的花芽和葉芽中的表達(dá) 通過敗育現(xiàn)象嚴(yán)重的梅品種‘大嵌蒂’和發(fā)育完好的‘龍眼’花芽和葉芽中的表達(dá)量對(duì)比發(fā)現(xiàn)（圖4-A、B），在‘大嵌蒂’和‘龍眼’11月花芽中的表達(dá)顯著上調(diào)，在12月、1月花芽中表達(dá)均顯著下調(diào)。而該基因在‘大嵌蒂’11月、12月、1月花芽中的表達(dá)水平高于‘龍眼’。在雌蕊發(fā)育良好的‘龍眼’中，在其不同時(shí)期的花芽和葉芽中的表達(dá)水平變化基本一致；而敗育嚴(yán)重的‘大嵌蒂’不同時(shí)期的花芽和葉芽，表達(dá)水平變化不一致。表明在‘大嵌蒂’11月、12月、1月花發(fā)育中可能起到重要的調(diào)控作用。

2.3.2在‘大嵌蒂’不同雌蕊形態(tài)花芽中的表達(dá) 為探明在梅花發(fā)育進(jìn)程中所發(fā)揮的功能，選取敗育現(xiàn)象嚴(yán)重、不完全花比例高達(dá)76%的梅品種‘大嵌蒂’為試材進(jìn)行研究。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在雌蕊完好花芽中表達(dá)顯著高于雌蕊缺失、褐色、畸形的花芽（圖4-C），表明可能會(huì)促進(jìn)‘大嵌蒂’的雌蕊發(fā)育，一定程度減輕梅雌蕊敗育現(xiàn)象，可能是梅雌蕊發(fā)育的正調(diào)控基因。

2.3.3在‘大嵌蒂’不同成熟花器官中的表達(dá) 為進(jìn)一步研究在梅花敗育中的調(diào)控模式，選取‘大嵌蒂’不同成熟花器官進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)檢測(cè)（圖4-D）（不完全花為雌蕊缺失的花芽）。結(jié)果表明，相較于完全花雌蕊，除不完全花雄蕊外，其余花器官（完全花雄蕊、花瓣、萼片；不完全花花瓣、萼片）表達(dá)均處于顯著的下調(diào)模式。由此說明可能在完全花雌蕊發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。在不完全雄蕊中的表達(dá)極顯著高于完全花雌蕊和雄蕊，表明對(duì)于梅雄蕊的發(fā)育可能也起到重要的調(diào)控作用，可能通過調(diào)控雄蕊的生長(zhǎng)影響梅的花發(fā)育及雌蕊發(fā)育進(jìn)程。此外，與完全花相比，在不完全花瓣中表達(dá)較高，在不完全花萼中表達(dá)較低，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探明。

A：PmARF17啟動(dòng)子的植物激素作用元件；B：PmARF17啟動(dòng)子的順式作用元件

A：pCAMBIA1302-PmARF17-GFP重組載體的結(jié)構(gòu)；B：pCAMBIA1302-GFP空載；C：pCAMBIA1302-PmARF17-GFP融合表達(dá)載體。左圖為熒光，中間為明場(chǎng)，右圖為合并圖像（標(biāo)尺長(zhǎng)度=20 000 nm）

2.4 PmARF17在梅花發(fā)育中的表達(dá)與內(nèi)源激素含量變化的相關(guān)性分析

2.4.1‘大嵌蒂’和‘龍眼’花芽、葉芽中內(nèi)源激素含量與表達(dá)分析 檢測(cè)兩品種不同時(shí)期花芽和葉芽中的IAA、GA3、ABA、ZT激素含量變化，并與的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。如圖5-A、B所示，‘大嵌蒂’和‘龍眼’在9月至次年1月花芽、葉芽中IAA含量變化與的表達(dá)沒有明顯的規(guī)律，花芽中IAA含量及的表達(dá)總體高于葉芽，說明IAA和在花芽中起到重要作用?！笄兜佟?1月、12月、1月花芽中GA3含量均高于‘龍眼’11月、12月、1月花芽，且11月差別最大。在‘大嵌蒂’11月花芽中的表達(dá)顯著上調(diào)，而此時(shí)GA3含量也相對(duì)較高，但12月的表達(dá)和GA3含量均下降。的表達(dá)水平與GA3含量的變化趨勢(shì)總體一致?！笄兜佟?1月花芽中ABA含量有所降低，而在此時(shí)期表達(dá)顯著上調(diào)，且花芽ABA含量總體高于葉芽。對(duì)于‘龍眼’，僅在其12月、1月花芽中檢測(cè)到較高含量的ABA，其余花芽、葉芽各時(shí)期ABA含量均較低。在‘大嵌蒂’和‘龍眼’12月、1月花芽中表達(dá)顯著下調(diào)，而此時(shí)ABA顯著增加?？芍诿返幕òl(fā)育中，ABA含量的變化與表達(dá)總體呈現(xiàn)相反趨勢(shì)?！笄兜佟汀堁邸~芽中ZT含量及趨勢(shì)一致，差異較小，而花芽中含量有較大差異。在11月的‘大嵌蒂’花芽中表達(dá)顯著上調(diào)并達(dá)到峰值，而同時(shí)，ZT含量處于最低水平；在‘大嵌蒂’和‘龍眼’11月、12月花芽中表達(dá)顯著下調(diào)，此時(shí)ZT含量均升高?？芍?，和ZT在梅花生長(zhǎng)發(fā)育過程中呈現(xiàn)相反的作用趨勢(shì)。

A：PmARF17在‘大嵌蒂’9月至1月花芽和葉芽中的表達(dá)；B：PmARF17在‘龍眼’9月至1月花芽和葉芽中的表達(dá)；C：PmARF17在‘大嵌蒂’不同雌蕊形態(tài)花芽中的表達(dá)；D：PmARF17在‘大嵌蒂’不同成熟花器官中的表達(dá)

2.4.2‘大嵌蒂’不同雌蕊形態(tài)花芽中內(nèi)源激素含量與表達(dá)分析 在雌蕊缺失的花芽中，IAA、GA3、ABA和ZT的含量均最低，而在其他雌蕊形態(tài)的花芽中含量相近，說明雌蕊是這些激素的重要作用部位。在完好、缺失、褐色、畸形4種雌蕊形態(tài)花芽中，IAA、ABA和ZT的含量變化趨勢(shì)非常相似，與的表達(dá)無顯著關(guān)系。而該4種雌蕊形態(tài)的花芽中GA3含量普遍較低，與的表達(dá)趨勢(shì)基本一致（圖6-A）。由此可見，與GA3之間可能存在著正調(diào)控關(guān)系。

2.4.3‘大嵌蒂’不同成熟花器官中內(nèi)源激素含量與表達(dá)分析 如圖6-B，IAA含量在雌蕊完好花芽中最低，在完全花雄蕊中達(dá)到最高。完全花雄蕊和花瓣中IAA含量均顯著高于不完全花雄蕊和花瓣，說明IAA可能在‘大嵌蒂’雄蕊和花瓣的生長(zhǎng)中起重要作用。然而，在完全花雄蕊和花瓣中的表達(dá)均低于不完全花的雄蕊和花瓣，表明和IAA在此時(shí)有相反的作用趨勢(shì)。GA3在完全花雌蕊中含量最高，并且在完全花和不完全花的花瓣、雄蕊中相對(duì)較高，在花萼中最低。表明GA3可能在‘大嵌蒂’雌蕊、花瓣、雄蕊的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。此外，在完全花雌蕊中高表達(dá)，而完全花雌蕊中GA3含量最高；完全花雄蕊中的表達(dá)低于不完全花雄蕊，GA3含量在這些情況下也有相同的趨勢(shì)。但對(duì)于完全花和不完全花的花瓣，GA3含量與的表達(dá)不一致，可能受到其他基因或物質(zhì)的影響?？芍诿烦墒旎ㄆ鞴僦械谋磉_(dá)與GA3含量變化趨勢(shì)總體一致?！笄兜佟?種成熟花器官中ABA含量均處于較低水平，ABA含量的變化趨勢(shì)與的表達(dá)沒有明顯的相關(guān)性。完全花雌蕊中ZT含量最高，其次是花萼，花瓣含量較低，而完全花和不完全花的雄蕊最低。同時(shí)，在不完全花的雄蕊中表達(dá)量最高，在雄蕊、花瓣、花萼等成熟器官中表達(dá)量與ZT含量呈相反的趨勢(shì)；對(duì)于完全花的雄蕊和花瓣，的表達(dá)和ZT含量也呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。但在完全花的雌蕊和花萼中，和ZT則表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)，這可能是由其他原因引起。由此可知，在梅成熟花器官的表達(dá)，總體上與ZT含量變化呈相反趨勢(shì)。

A：‘大嵌蒂’不同時(shí)期花芽和葉芽中IAA、GA3、ABA、ZT的含量與的表達(dá)；B：‘龍眼’不同時(shí)期花芽和葉芽中IAA、GA3、ABA、ZT的含量與的表達(dá)。*表示<0.05，**表示<0.01。下同

A: IAA, GA3, ABA, ZT contents and theexpression of flower buds and leaf buds at different periods of the aborted Daqiandi; B: IAA, GA3, ABA, ZT contents and theexpression of flower buds and leaf buds at different periods of well-developed Longyan. * indicatesignificant difference (<0.05), and ** indicate extremely significant difference(<0.01). The same as below

圖5‘大嵌蒂’和‘龍眼’不同時(shí)期花芽和葉芽中激素與表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析

Fig. 5 Correlation analysis between hormones andexpression of flower buds and leaf buds at different periods of Daqiandi and Longyan

A：‘大嵌蒂’不同雌蕊形態(tài)花芽中IAA、GA3、ABA、ZT含量與PmARF17的表達(dá)分析；B：‘大嵌蒂’不同成熟花器官中IAA、GA3、ABA、ZT含量與PmARF17的表達(dá)分析

2.5 PmARF17啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)及功能分析

將啟動(dòng)子構(gòu)建到pBI121載體中，如圖7-A所示，分別用pBI121-promoter-GUS融合表達(dá)載體和pBI121空載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，并將兩種EHA105農(nóng)桿菌重懸液侵染擬南芥植株。

啟動(dòng)子具備啟動(dòng)活性，可以誘導(dǎo)其下游表達(dá)，從而使擬南芥植株一些特定部位在GUS組織化學(xué)染色中呈現(xiàn)出藍(lán)色。由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pBI121空載體轉(zhuǎn)化EHA105菌液瞬時(shí)侵染擬南芥苗，整株（各花器官、葉片、莖段、根部等）都表現(xiàn)出藍(lán)色，如圖7-D（或圖7-K、L）所示。由圖7-F、G可知，由啟動(dòng)子侵染的先盛開的花瓣較為明顯地被GUS染成藍(lán)色；圖7-H表明，由啟動(dòng)子侵染的尚未盛開的花蕾中某一部位被GUS染成藍(lán)色，該部位含有較多的藍(lán)色斑點(diǎn)狀物質(zhì)。由于花蕾較小，在48 h的震蕩培養(yǎng)中花器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭受損壞，不易觀察，推測(cè)為雄蕊。為了進(jìn)一步驗(yàn)證為雄蕊，將該部位分離并在高倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該部位（圖7-I）具有和圖7-J中雄蕊一樣的組成結(jié)構(gòu)，則斷定該部位為雄蕊，即雄蕊被GUS染成了藍(lán)色。圖7-E表明由啟動(dòng)子侵染的根部被GUS染成了藍(lán)色。未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的2株擬南芥苗（陰性對(duì)照）GUS染色各部位均未呈現(xiàn)藍(lán)色（圖7-C，圖7-J）。

A：pBI121-PmARF17 promoter-GUS融合載體結(jié)構(gòu)圖；B：pBI121-PmARF17 promoter-GUS侵染的擬南芥苗GUS染色結(jié)果；C：陰性對(duì)照GUS染色結(jié)果（未經(jīng)菌液侵染）；D：陽(yáng)性對(duì)照GUS染色結(jié)果（pBI121空載侵染）；E：B中根部的放大圖；F、G：pBI121-PmARF17 promoter-GUS在花瓣中GUS染色結(jié)果；H：pBI121-PmARF17 promoter-GUS在雄蕊中GUS染色結(jié)果；I：從H中分離出的藍(lán)色區(qū)域高倍鏡圖；J：陰性對(duì)照中花器官GUS染色結(jié)果，其雄蕊與H中的雄蕊具有相同組分；K、L：陽(yáng)性對(duì)照中不同根部、花器官、葉片的GUS染色結(jié)果

3 討論

近些年來，國(guó)內(nèi)外研究表明ARF作為生長(zhǎng)素受體調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，在花發(fā)育的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用[11]。生長(zhǎng)素幾乎參與了植物生長(zhǎng)和發(fā)育的所有過程，并且大多數(shù)過程都受基因表達(dá)的調(diào)控[43]。然而，植物激素和之間的作用機(jī)制鮮有報(bào)道[44]。為確定梅花發(fā)育和雌蕊敗育的作用機(jī)理，并為植物與內(nèi)源激素之間的調(diào)節(jié)關(guān)系提供重要支持，克隆并研究了其結(jié)構(gòu)和功能。

可能在11月、12月、1月的梅花發(fā)育過程中起重要作用，可能是雌蕊發(fā)育的正調(diào)控基因，促進(jìn)雌蕊正常發(fā)育，這與的同源基因在擬南芥花發(fā)育中可以促進(jìn)雌蕊發(fā)育相一致[12,14]。與IAA沒有明顯的作用關(guān)系，這可能與PmARF17蛋白缺少Aux-IAA結(jié)構(gòu)域有關(guān)，在梅花發(fā)育過程中可能不依賴于生長(zhǎng)素而獨(dú)立起作用。‘大嵌蒂’花芽中ABA和ZT含量變化總體上與的表達(dá)呈相反的趨勢(shì)，可能會(huì)抑制的表達(dá)，但該作用關(guān)系不顯著。而GA3的含量變化和的表達(dá)，在梅花發(fā)育上總體表現(xiàn)出明顯的一致趨勢(shì)。前人研究表明GA調(diào)節(jié)花分生組織識(shí)別基因（）的轉(zhuǎn)錄活性[45]，進(jìn)而調(diào)節(jié)花同源異型基因[46]、[47]、[48]及[49]。YU等[50]指出，-1突變體花器官發(fā)生后，、和的轉(zhuǎn)錄受到GA的正調(diào)控。ZHANG等[51]研究指出，在GA誘導(dǎo)的葡萄單性結(jié)實(shí)過程中，GA促進(jìn)的表達(dá)。據(jù)此，推測(cè)可能受到GA3的正調(diào)控作用，二者共同促進(jìn)梅雌蕊發(fā)育，減輕雌蕊敗育。梅發(fā)育過程中，ABA或ZT含量的變化與GA3的相互作用可能為拮抗，這與WEISS和ORI[25]的研究一致。

因啟動(dòng)子包含GA順式調(diào)控元件，結(jié)合上述的表達(dá)與GA3含量變化的相關(guān)性分析，推斷GA3可能在啟動(dòng)子的影響下正調(diào)控的表達(dá)，從而影響梅的花發(fā)育過程。值得注意的是，啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，啟動(dòng)子作用部位并不在擬南芥的雌蕊上，而作用于其雄蕊和花瓣。在不完全花（雌蕊缺失）雄蕊中的表達(dá)顯著高于完全花雌蕊、完全花雄蕊以及其余5種花器官中的表達(dá)；對(duì)于完全花和不完全花，在花瓣中也有較高表達(dá)，而GA3在其雄蕊和花瓣中均有較高含量（圖6-B）。這與啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)中啟動(dòng)子作用部位在雄蕊和花瓣上一致。

因此，推測(cè)在敗育率較高的‘大嵌蒂’花芽中，可能受到GA3的正調(diào)控，共同作用于雄蕊和花瓣，進(jìn)而影響雌蕊和花的發(fā)育。此外，推測(cè)可能存在與啟動(dòng)子結(jié)合的特定GA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)的表達(dá)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

可能在11月、12月、1月的梅花發(fā)育過程中起重要作用，可能是梅花發(fā)育的正調(diào)控基因，促進(jìn)雌蕊的正常發(fā)育。與IAA沒有明顯的作用關(guān)系，這可能與PmARF17蛋白缺少Aux-IAA結(jié)構(gòu)域有關(guān)，在梅花發(fā)育過程中可能不依賴于生長(zhǎng)素而獨(dú)立起作用。啟動(dòng)子含有GA順式調(diào)控元件，具有啟動(dòng)活性和組織表達(dá)特異性，在擬南芥花瓣、雄蕊及根部特異表達(dá)。可能受到GA3的正調(diào)控作用，共同促進(jìn)梅的雌蕊發(fā)育。在雌蕊敗育嚴(yán)重的‘大嵌蒂’花發(fā)育過程中，和GA3可能通過作用于雄蕊和花瓣，進(jìn)而影響梅的雌蕊發(fā)育進(jìn)程。

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Isolation ofand Its Regulation Pattern of Endogenous Hormones During Flower Development in

1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【】The purposes of this study were to analyze the biological functions ofgene and to explore the regulation pattern between the expression ofand plant endogenous hormones, which could provide the basis for studying the regulatory mechanism of pistil abortion in. 【】gene was isolated from the cultivar Daqiandi of, and the gene structure, phylogeny and homology with other species were analyzed by bioinformatics software. Subcellular localization determined the position of PmARF17 protein in the cell. qRT-PCR was used to detect the spatiotemporal expression pattern ofvarieties Daqiandi and Longyan. The contents of IAA, GA3, ABA and ZT in flower buds, leaf buds, pistil morphology flower buds and different mature flower organs of Daqiandi and Longyan were determined by UPLC method, and the correlation analysis was conducted with the qRT-PCR expression ofCloning, element analysis and transient expression ofpromoter were performed to study the regulation pattern betweenand GA3. 【】Phylogenetic tree analysis showed PmARF17 protein sequence was highly conserved with ARF protein of other plants. Subcellular localization experiment showed PmARF17 protein was located on the nucleus and cell membrane. The correlation analysis between qRT-PCR expression and endogenous hormone content showed the expression ofhad no obvious similarity with the change trend of IAA content in different flower samples. The expression ofPmARF17 in complete pistil was significantly up-regulated compared to incomplete pistil, and GA content was consistent with the expression trend of PmARF17. The content of ABA and ZT in different flower samples and the expression ofshowed an overall opposite trend, indicating that they might inhibit the expression of. Thepromoter contained GA-element and had promoter activity and tissue expression specificity, specifically expressed in petals, stamens and roots. 【】might be a positive regulation gene of flower development, and it might promote pistil development of.The expression ofmight be positively regulated by GA3, which affected the pistil development ofby acting on stamens and petals.

; auxin response factor; pistil development; gene expression; endogenous hormones; transient expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.013

2020-08-27；

2020-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31971703，31772282）、中國(guó)博士后基金（2018M640497）、江蘇省博士后基金（2018K216C）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SYSB201805）

李艷林，E-mail：lisaltp@qq.com。通信作者高志紅，E-mail：gaozhihong@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）