李宇，汪芳，翁澤斌，宋海昭，沈新春

酶法制備大豆蛋白成骨活性肽

1南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023；2南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，南京 210000

【】探究從大豆分離蛋白雙酶分步酶解產(chǎn)物中分離促成骨細(xì)胞增殖肽的工藝，為大豆產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。以促成骨細(xì)胞增殖活性作為測(cè)定指標(biāo)，選用木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白（SPI），采用MTT法檢測(cè)不同濃度的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性。采用pH-Stat法檢測(cè)水解時(shí)間為1、2、3、4、5和6 h的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度，并檢測(cè)相應(yīng)水解時(shí)間的酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性。然后分別采用截留分子量為30 kD和10 kD兩種超濾膜對(duì)活性較高的酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾，并測(cè)定各超濾組分對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性。再將具有較高促成骨細(xì)胞增殖活性的超濾組分分別在0.5、1、1.5、2和2.5 h進(jìn)行堿性蛋白酶酶解，并檢測(cè)相應(yīng)水解時(shí)間的酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性。然后選用交聯(lián)葡聚糖（Sephadex G-15）對(duì)具有較高促成骨細(xì)胞增殖活性的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，并檢測(cè)各分離組分對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性。最后，對(duì)各分離組分進(jìn)行氨基酸分析，并采用質(zhì)譜（ESI-TOF MS/MS）對(duì)最高促成骨細(xì)胞增殖活性的分離組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并篩選出具有較強(qiáng)促成骨細(xì)胞增殖的大豆活性肽。在濃度為200μg·mL-1時(shí)，木瓜蛋白酶酶解物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活性隨著酶解時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，當(dāng)酶解時(shí)間為5 h時(shí)達(dá)到最高促增殖活性（（118.24±2.73）%）。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離、堿性蛋白酶酶解和凝膠過濾色譜分離后，對(duì)各分離組分進(jìn)行氨基酸分析并篩選得到對(duì)成骨細(xì)胞具有最強(qiáng)增殖活性的組分F3，該組分的成骨細(xì)胞增殖率為（125.80±2.94）%，且F3中丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸和必需氨基酸的含量明顯高于其他組分。進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定出F3主要由10個(gè)肽段組成。其中，DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK、KDWYDIK的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸占比較高。對(duì)上述4個(gè)肽段進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)GQTPLFPR的促成骨細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，其成骨細(xì)胞增殖率為（129.11±3.12）%。采用雙酶分步酶解結(jié)合超濾和凝膠過濾色譜等蛋白分離純化技術(shù)，從大豆分離蛋白中分離純化出了具有較強(qiáng)促成骨細(xì)胞增殖活性的多肽，為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的制備和應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

大豆分離蛋白；成骨細(xì)胞增殖；雙酶分步酶解；分離純化；活性肽

0 引言

【研究意義】骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨組織退化及微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨強(qiáng)度和韌度降低為特征的一種代謝性疾病，其發(fā)病率較高，尤其是隨著老齡化時(shí)代的到來，骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥如骨折等日益成為一項(xiàng)危害大眾身體健康的社會(huì)問題。目前，治療骨質(zhì)疏松的藥物以作用于破骨細(xì)胞的骨吸收為主，而靶向于成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)骨形成的藥物較少，且目前市場(chǎng)上抗骨質(zhì)疏松藥物如雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和降鈣素等[1]普遍存在嚴(yán)重的副作用。因此，開發(fā)高效、安全、副作用小的抗骨質(zhì)疏松的天然產(chǎn)物成分日益受到關(guān)注。大豆作為中國四大糧食作物之一，其蛋白資源豐富且價(jià)格低廉，不少研究表明大豆蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松有良好的預(yù)防和治療作用[2]。和大豆蛋白相比，大豆活性肽因其具有較低的過敏原、較高的溶解性和持水性以及可以直接被人體吸收利用等特性越來越受到人們青睞?；诖吮尘?，尋找具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性的大豆肽對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥具有深遠(yuǎn)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨質(zhì)疏松是一種慢性全身代謝性疾病，其特征是骨微結(jié)構(gòu)改變，骨量和強(qiáng)度減少，從而導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)升高[3-4]。有研究表明，大豆能顯著提高卵巢切除大鼠和小鼠的骨密度，可見大豆在預(yù)防卵巢激素缺乏引起的骨丟失方面是有效的[5-6]，且大豆提取物對(duì)骨組織具有良好的保護(hù)作用，可在雌激素缺乏的情況下防止骨質(zhì)流失[7-9]。此外，大豆異黃酮可減輕絕經(jīng)期婦女的腰椎骨質(zhì)流失[10]。有研究表明，在絕經(jīng)后最初幾年的婦女中，大豆蛋白的攝入量與臀部骨密度和全身骨密度有顯著的相關(guān)性[11]。大豆蛋白可以間接地增加骨強(qiáng)度[12-13]，有效降低絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)[14]。生理學(xué)研究表明，在成年人骨骼中，骨骼不斷地形成和吸收，骨重塑過程是由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的精確協(xié)調(diào)完成的[15]。大部分骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)骨形成降低，在骨形成過程中，成熟的成骨細(xì)胞到達(dá)骨表面，成骨細(xì)胞群在自己合成的骨基質(zhì)內(nèi)，發(fā)生羥磷灰石結(jié)晶的生長和礦化[16]。因此，研究大豆蛋白對(duì)成骨細(xì)胞的生物活性具有重要的科學(xué)意義。有研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的酶解產(chǎn)物能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并初步進(jìn)行了氨基酸分析，但是并未對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與鑒定[17]。【本研究切入點(diǎn)】大量研究證明大豆蛋白具有預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用，也有部分研究表明大豆蛋白酶解產(chǎn)物可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的功能，但是大豆促成骨活性肽的分離制備及其結(jié)構(gòu)的鑒定尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以大豆分離蛋白為原料，通過木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶分步酶解結(jié)合超濾和凝膠過濾色譜分離純化技術(shù)，從大豆分離蛋白中分離篩選出具有促成骨細(xì)胞增殖功能的高活性肽，為大豆活性肽的分離純化及其作為抗骨質(zhì)疏松功能成分的開發(fā)與應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院及江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

大豆分離蛋白，上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma公司；噻唑藍(lán)（MTT）、木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；MC3T3-E1細(xì)胞株，上海中科院細(xì)胞庫；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、MEM-α培養(yǎng)基、EDTA-胰酶（0.05%）、Penicillin-Streptomycin（100×）、PBS磷酸鹽緩沖液，美國Gibco公司；堿性磷酸酶Alcalase 2.4 L，丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司；Sephadex G-15，GE（中國）醫(yī)療集團(tuán)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2e酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；蛋白純化系統(tǒng)，上海滬西分析儀器有限公司；8400型超濾杯，美國Millipore公司；HY-1漩渦混合儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微型垂直電泳系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；JY92-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎儀，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白 稱取一定量大豆分離蛋白溶于超純水中，配置成濃度為4.5%（W/V）的蛋白溶液，加入NaOH，調(diào)節(jié)pH為7.0。加入木瓜蛋白酶3 000 U·g-1。將容器置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，55℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，升溫至85℃，滅酶20 min，冷卻后在3 000×條件下離心15 min，取上清液，透析除鹽，冷凍干燥后，于-20℃條件下保存。

1.3.2 水解度的測(cè)定 蛋白質(zhì)的酶解過程伴隨著羧基或羥基的釋放，這兩種基團(tuán)數(shù)量的變化會(huì)使溶液體系的pH改變。依據(jù)pH-Stat法[18]，蛋白水解度可由水解過程中NaOH的消耗量來計(jì)算。計(jì)算公式如下：

式中，B：水解過程中消耗NaOH體積（mL）；Nb：NaOH濃度（mol·L-1）；α：氨基酸的解離常數(shù)；MP：底物蛋白質(zhì)的總量（g）；htot：每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵毫摩爾數(shù)。反應(yīng)過程中用pH計(jì)測(cè)溶液的pH，通過滴加0.5 mol?L-1NaOH溶液維持pH恒定。記錄一定時(shí)間間隔內(nèi)NaOH的消耗量，帶入公式中計(jì)算水解度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)繪制水解曲線。

1.3.3 木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物超濾分離 將木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物溶于去離子水中，配置成10 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm的纖維素膜過濾，除去其中的不溶物。將濾液先后通過10 kD和30 kD的超濾膜，調(diào)節(jié)超濾壓力為0.2 MPa，在4℃下進(jìn)行超濾，收集各組分多肽溶液后冷凍干燥。

1.3.4 堿性蛋白酶酶解制備成骨活性肽 木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物經(jīng)過超濾分離后，取促成骨細(xì)胞增殖活性較高組分用堿性蛋白酶酶解。樣品溶于超純水中配置成5%（W/V）的蛋白溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，堿性蛋白酶加酶量為3 000 U·g-1，水解溫度為55℃，水解時(shí)間為0.5、1、1.5、2和2.5 h，比較不同時(shí)間酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響，選出最佳水解時(shí)間。

1.3.5 凝膠過濾色譜分離（Sephadex G-15） 堿性蛋白酶酶解后的分子量較小，因此選用交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-15對(duì)其進(jìn)行分離。首先將Sephadex G-15干粉溶脹之后裝入15 mm×600 mm層析柱中，再將堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物溶于超純水配成2%的溶液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾除去顆粒物，上樣量為柱體積的3%，且分離過程在4℃條件下進(jìn)行。用超純水以0.6mL·min-1流速洗脫，220 nm處檢測(cè)吸光值，自動(dòng)收集器每5 min收集1管（約2 mL），記錄儀記錄紫外檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)記錄曲線，收集每個(gè)洗脫峰下的洗脫液，冷凍干燥。

1.3.6 成骨細(xì)胞的增殖活性測(cè)定 將成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）消化收集后配置成每毫升含5×104個(gè)細(xì)胞的懸浮液，96孔板每孔加100 μL細(xì)胞液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)液，除對(duì)照組外，每孔加入含酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)平行。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，MTT濃度為5 mg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將MTT溶液及培養(yǎng)液吸出并加入50 μL DMSO。37℃恒溫振蕩器內(nèi)振蕩20 min后使用酶標(biāo)儀在570 nm單波長下測(cè)吸光值。成骨細(xì)胞增殖活力=（OD加樣組-OD空白組）/（OD對(duì)照組- OD空白組）×100%。

1.3.7 氨基酸測(cè)定 對(duì)葡聚糖凝膠柱分離后的組分進(jìn)行氨基酸分析，氨基酸含量參照GB 5009.124—2016進(jìn)行測(cè)定。利用全自動(dòng)氨基酸分析儀，使用磺酸型陽離子樹脂柱，適量樣品中加入10 mL鹽酸（6 mol·L-1）后封管，于110℃烘箱水解24 h，測(cè)定樣品中氨基酸含量。

1.3.8 成骨活性肽的結(jié)構(gòu)分析及其化學(xué)合成 委托上海博苑生物科技有限公司完成成骨活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定。采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（ESI-TOF MS/MS）對(duì)分離得到的促成骨細(xì)胞增殖最高的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。流動(dòng)相A：2%乙腈，0.1%甲酸；流動(dòng)相B：98%乙腈，0.1%甲酸。質(zhì)譜采用TripleTOF 5600系統(tǒng)（AB SCIEX）結(jié)合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.5 kV，霧化氣壓為5 PSI，氣簾氣壓為30 PSI，加熱器溫度為150℃。

采用化學(xué)法固相合成成骨活性肽（純度95%以上），該試驗(yàn)委托江蘇金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，使用Origin 2018軟件作圖，采用Excel 2015和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 木瓜蛋白酶酶解物濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

用MTT法檢測(cè)木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖活力的影響。如圖1所示，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的加樣濃度為100 μg·mL-1和150 μg·mL-1時(shí)，成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖活力相比對(duì)照組顯著增強(qiáng)（<0.05），當(dāng)加樣濃度為200和250μg·mL-1時(shí)，與對(duì)照組相比具有極顯著差異（<0.01），但這兩種劑量之間無顯著性差異（>0.05）。因此，選取200μg·mL-1作為后續(xù)試驗(yàn)中木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的濃度。

*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）

2.2 不同酶解時(shí)間的水解度及木瓜蛋白酶酶解物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

在木瓜蛋白酶酶解過程中，當(dāng)?shù)孜锖兔噶看_定時(shí)，水解度依賴不同酶解時(shí)間而變化，而不同酶解時(shí)間的酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力也有一定的影響。如圖2所示，隨著酶解時(shí)間增加，大豆分離蛋白的水解度也逐漸增加，至5 h時(shí)，增長趨勢(shì)逐漸變緩。木瓜蛋白酶酶解物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力隨著酶解時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，在酶解時(shí)間為5 h時(shí)達(dá)到最高促增殖活力。此時(shí)，水解度和成骨細(xì)胞增殖活力分別為（11.08±0.31）%和（118.24±2.73）%，兩者在一定程度上趨勢(shì)一致。

2.3 超濾產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

采用30 kD和10 kD兩種超濾膜將酶解時(shí)間為5 h的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物截留為3個(gè)組分，分別為分子量>30 kD組分、10—30 kD組分及<10 kD組分，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液溶解，加樣濃度為200 μg·mL-1，培養(yǎng)24 h，測(cè)定3個(gè)組分對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組（Control）相比，其中酶解產(chǎn)物>30 kD組分對(duì)成骨細(xì)胞無顯著促增殖作用，10—30 kD組分和<10 kD組分均有顯著的促增殖作用，其中<10 kD組分具有較高的促增殖活力，細(xì)胞增殖率達(dá)到（120.45±2.28）%，與其他各組之間具有顯著性差異（<0.05）。由此可知，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量越小，其促成骨細(xì)胞增殖活性越高。因此，選擇分子量<10 kD的組分進(jìn)行后續(xù)酶解試驗(yàn)。

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

圖3 超濾產(chǎn)物各組分對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

2.4 不同酶解時(shí)間的堿性蛋白酶酶解物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

堿性蛋白酶酶解0.5 h時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活力較高，細(xì)胞增殖率達(dá)到（123.02±2.69）%。因此，確定堿性蛋白酶最佳酶解時(shí)間為0.5 h（圖4）。

圖4 不同酶解時(shí)間的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力影響

2.5 Sephadex G-15分離產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

選用交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-15對(duì)酶解時(shí)間為0.5 h的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離。如圖5-A所示，經(jīng)Sephadex G-15分離后，得到4個(gè)洗脫峰，出峰時(shí)間分別為45、78、100和120 min，按出峰時(shí)間的先后分別命名為F1、F2、F3和F4。細(xì)胞刺激濃度為200μg·mL-1，培養(yǎng)24 h，測(cè)定4個(gè)分峰產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果如圖5-B所示。與對(duì)照組相比，4個(gè)洗脫峰組分對(duì)成骨細(xì)胞均有促增殖活性（<0.05），其中F3對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖活力最高，達(dá)到（125.80± 2.94）%。

2.6 氨基酸含量分析和肽的結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

對(duì)凝膠過濾色譜（Sephadex G-15）分離組分進(jìn)行氨基酸分析（表1），F(xiàn)3中的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸含量分別為（54.44±1.06）%、（26.63±45）%和（39.60±1.78）%，顯著高于其他分離組分（<0.05）；對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力影響最低的F4組分中疏水氨基酸含量只有（26.08±0.59）%，芳香族氨基酸僅為（7.38±0.31）%。經(jīng)ESI-TOF MS/MS鑒定（表2），F(xiàn)3組分的大多數(shù)肽段中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸含量較高，其中最具代表性的肽段序列為：DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK，且活性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其活性較高，因此測(cè)定肽DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響。結(jié)果如圖6所示，隨著大豆活性肽濃度增加，成骨細(xì)胞的增殖活力也逐漸增加，當(dāng)濃度為25 μmol?L-1時(shí)，4條肽段均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖（<0.05）。當(dāng)濃度為50μmol?L-1時(shí)，GQTPLFPR對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力相比于25 μmol?L-1具有顯著性差異（<0.05）；ADFYNPK、DAMDGWFRL、KDWYDIK對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力相比于25 μmol?L-1無顯著性差異（>0.05）。當(dāng)濃度為100 μmol?L-1時(shí)，大豆活性肽GQTPLFPR對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力最高，達(dá)到（129.11±3.12）%。

圖5 Sephadex G-15分離色譜圖（A）及各峰洗脫組分的促成骨細(xì)胞增殖活性（B）

表1 各峰的氨基酸含量

同行不同字母表示Tukey檢測(cè)有顯著性差異（＜0.05）

Different letters in the same line represent significant difference based on Tukey’s post-test (＜0.05)

表2 F3中含量最多的肽

3 討論

大豆活性肽在各前體蛋白中的活性較低，目前主要通過化學(xué)法、微生物發(fā)酵法以及酶解法3種途徑，并采用進(jìn)一步分離純化來提高其生物活性[19]。

本研究采用pH-Stat法檢測(cè)木瓜蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的水解度，在酶解時(shí)間為5 h時(shí)，水解度達(dá)到（11.08±0.31）%，這與木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的水解度基本一致[20-21]。此外，有研究表明11S和7S大豆球蛋白在酶解時(shí)間為5 h時(shí)，水解度約為80%[22]，與本研究結(jié)果存在較大差異，主要原因在于在酶解前，酶解體系中已存在一定量的酸溶蛋白，采用TCA指數(shù)法的測(cè)定結(jié)果偏高。本研究采用pH-Stat法的可重復(fù)性高，在中性和堿性水解條件下都可以測(cè)定[23]。本研究中水解體系pH為7，采用pH-Stat法測(cè)定的結(jié)果誤差較小，與TCA方法相比具有一定的優(yōu)越性。陳思遠(yuǎn)等[24]通過二步酶解結(jié)合超濾等3種分離技術(shù)從麥胚清蛋白中分離得到單一的高活性抗氧化肽。AMIN等[25]通過LC-MS/MS分析豆豉水解產(chǎn)物鑒定出新的鮮味肽。本研究利用雙酶分步酶解結(jié)合超濾膜和凝膠過濾色譜等蛋白分離純化技術(shù)，從大豆蛋白中分離具有較高促成骨細(xì)胞增殖活性的多肽，最終得到的大豆活性肽對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活性達(dá)到（129.11±3.12）%，而潘曉文[17]研究發(fā)現(xiàn)的大豆蛋白酶解產(chǎn)物促成骨細(xì)胞增殖活性最高達(dá)到123%，說明本研究的提取純化工藝具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖6 大豆活性肽DAMDGWFRL(A)、GQTPLFPR（B）、ADFYNPK(C)和KDWYDIK(D)對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

大量研究表明肽的活性與其氨基酸序列密切相關(guān)，例如，ZHANG等[26]從水葫蘆葉蛋白中分離得到FFE和LF兩種抗氧化肽，認(rèn)為肽段序列中疏水性氨基酸與必需氨基酸Phe、Leu以及Phe等芳香族氨基酸可以提高水葫蘆葉中水解蛋白的抗氧化活性。ZHANG等[27]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白中的肽LPYPR和WGAPSL可以降低極低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯。此外，鐘芳等[28]研究具有最高ACE抑制活性的大豆肽3種可能的結(jié)構(gòu)為：VISTGAEP、VLSTGAEP和ANSAGTVGP。除上述的幾種功效外，也有不少研究闡明大豆肽對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化活性以及對(duì)逆轉(zhuǎn)骨丟失具有一定的功效，比如：XU等[29]從貽貝中發(fā)現(xiàn)肽YPRKDETGAERT可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。MIN等[30]研究發(fā)現(xiàn)序列為RVYFFKGKQYWE的肽既可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化活性，又能夠抑制破骨細(xì)胞的吸收功能，還可以逆轉(zhuǎn)由卵巢切除引起的骨丟失。此外，潘曉文[17]對(duì)具有促成骨細(xì)胞增殖作用的大豆蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，脯氨酸可能是骨骼中膠原蛋白的重要原料，且含硫氨基酸，包括蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸等不利于骨骼的形成。本研究從大豆分離蛋白中分離篩選出具有促成骨細(xì)胞增殖的高活性肽，可初步判斷大豆肽促成骨細(xì)胞增殖的活性與其序列中具有較高含量的疏水性氨基酸、必需氨基酸和芳香族氨基酸有關(guān)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，后續(xù)將會(huì)進(jìn)一步驗(yàn)證大豆活性肽對(duì)于動(dòng)物骨質(zhì)疏松的影響以及在動(dòng)物體內(nèi)的吸收利用情況。

4 結(jié)論

本研究利用雙酶分步酶解結(jié)合超濾膜和凝膠過濾色譜等蛋白分離純化技術(shù)，從大豆蛋白中分離出具有較高促成骨細(xì)胞增殖活性的多肽組分F3，其促成骨細(xì)胞的增殖活性為（126.60±3.28）%，經(jīng)氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)F3組分含有較高比例的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和必需氨基酸，并經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)F3由活性較高的肽DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK組成，且肽GQTPLFPR對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活力最高，促成骨細(xì)胞增殖活性為（129.11±3.12）%。研究結(jié)果為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的制備和應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

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Preparation of Soybean Protein-Derived Pro-osteogenic Peptides via Enzymatic Hydrolysis

1College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023;2College of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000

【】 The aim of this study was to develop an effective method and to identify the active peptides and to provide reference for the development of soybean products, so as to promote the proliferation of osteoblasts from soybean protein isolated with the two-step enzymatic hydrolysis. 【】The proliferative activity of osteoblast was served as an indicator. Soybean protein isolate (SPI) was hydrolyzed by papain, and the effect of papain hydrolysates on osteoblast proliferation was detected by a MTT assay. The degree of hydrolysis of the papain hydrolysates was determined by the pH-Stat method after 1, 2, 3, 4, 5 and 6 h treatment, respectively. The effects of papain hydrolysates on pro-liferation of osteoblast were determined. Two kinds of ultrafiltration membrane with 30 kDa and 10 kDa cut-off were used to separate the fractions of papain hydrolysates, and their proliferation activities on osteoblast were determined. The enzymatic hydrolysates with the highest pro-proliferative activity of osteoblast were further hydrolyzed with alkaline. The effect of alkaline enzymatic hydrolysate on the proliferation of osteoblast was examined after 0.5, 1, 1.5, 2 and 2.5 h treatment, respectively. The Sephadex G-15 was used to isolate the enzymatic hydrolysates with high pro-proliferative activity of osteoblasts, and the proliferation activity of each component on osteoblasts was determined. Furthermore, the amino acids of the separated fractions were analyzed. The structure of the most active fraction was identified by ESI-TOF MS/MS, and the soybean protein derived from peptides with strong activity to promote osteoblast proliferation was identified. 【】 The proliferative rate of osteoblasts was (118.24±2.73)% by the treatment withenzymatic hydrolysis products of papain for 5 h at the concentration of 200 μg/ml. After the enzymatic hydrolysates were separated by ultrafiltration membrane, the active fraction was further hydrolyzed with alkaline protease. The final hydrolysates were separated with gel filtration chromatography (Sephadex G-15). A fraction of component with the strongest pro-proliferative activity on osteoblasts, F3, was identified, and the proliferative rate of osteoblasts treated with this faction was (125.80±2.94)%. Amino acid analysis showed that the contents of hydrophobic amino acids, such as alanine, valine, isoleucine, leucine, and phenylalanine, aromatic amino acids and essential amino acids in F3, were significantly higher than other fractions. In addition, mass spectrometry (ESI-TOF MS/MS) revolved that F3 was mainly composed of 10 small peptides, among which, DAMDGWFRL, GQTPLFPR, ADFYNPK and KDWYDIK had high contents of hydrophobic amino acids, aromatic amino acids and essential amino acids. Moreover, 100 μmol?L-1of GQTPLFPR had the strongest pro-proliferative activity on osteoblasts, with a proliferative rate of (129.11±3.12)%.【】 Two-step enzymatic hydrolysis combined with ultrafiltration membrane and gel filtration chromatography could identify the most active pro-proliferative peptides from SPI, which provided a technical reference for the preparation of peptides with the bio-activity to stimulate the proliferation of osteoblasts.

soybean protein isolate; osteoblast proliferation; two-step enzymatic hydrolysis; separation and purification; active peptide

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.016

2020-10-29；

2021-02-08

國家自然科學(xué)基金（21476103，31800280）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20181415）、江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)基金（18KJB550006）、江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX19_1403）

李宇，Tel：18795845118；E-mail：18795845118@163.com。通信作者宋海昭，Tel：18806508653；E-mail：songhaizhaothu@nufe.edu.cn。通信作者沈新春，Tel：13675121836；E-mail：shenxinchun@nufe.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）