鄭凌歆 王金丹 何超翔 鄭蘭芝

特發(fā)性肺纖維化是一種以肺成纖維細胞增殖、細胞外基質過度聚集及肺泡上皮損傷為特征的間質性肺疾病[1-2]，發(fā)病機制未明，愈后差，缺乏有效的預防和治療方法。目前認為成纖維細胞向肌成纖維細胞分化在纖維化進程中起至關重要的作用，其分化的標志是α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的大量表達[3]。研究發(fā)現，轉化生長因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）可誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化[4]，并可通過Smads信號通路調控纖維化進程[5]。因此，藥物若能干預成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的進程，則可為特發(fā)性肺纖維化的治療提供新思路。麥冬具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。麥冬多糖（Ophiopogon japonicus polysaccharides，OJP）是其主要化學活性成分，主要藥理作用為免疫調節(jié)、抗炎及降血糖等[6]。研究表明，麥冬注射液可有效抑制腹膜間皮細胞TGF-β1 及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的過度表達，從而阻止或延緩腹膜纖維化的發(fā)生[7]，具有一定的抗纖維化作用。本研究觀察OJP 對TGF-β1誘導的人胚胎肺成纖維（HEL）細胞表型轉化的影響及初步機制進行探討，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細 胞 HEL 細胞購自中國科學院昆明細胞庫（KCB 86019）。

1.2 主要試劑及儀器 OJP（純度98%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），TGF-β1（購自艾美捷科技有限公司，4342-5），α-SMA（購自Abcam 公司，ab5694），膠原蛋白Ⅰ（COLⅠ）抗體（購自戴格公司，db517），Smad2、p-Smad2 抗體（購自Cell signaling technology 公司，5678S，3101S），胎牛血清（購自Gibco 公司，1903220），CCK-8（購自碧云天生物技術公司，C0037），CFX 96 Touch 實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂），TS-1000 脫色搖床（海門其林貝爾儀器公司），Bio-RadMINI-P 垂直電泳系統（美國伯樂），S-3000N 掃描電鏡（日本日立），AIR 激光共聚焦顯微鏡（浙江賽因）。

2 實驗方法

2.1 細胞分組及給藥方法 將對數生長期的HEL細胞分為對照組、模型組和OJP 干預組。模型組于TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h。OJP 干預組于TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后，再加入25、50、100μg/mL OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.2 細胞增殖實驗 將1×105/L 各處理組細胞懸液100μL 加置96 孔細胞培養(yǎng)板里，每組設5 個重復孔，同時設空白孔。每孔加入CCK-8 溶液培養(yǎng)2h后，用酶標儀于450nm 處測定吸光度值。

2.3 電鏡觀察 根據CCK-8 實驗結果收集各處理組細胞懸液和爬片，分別加入2.5%戊二醛前固定，再以1%四氧化鋨后固定2h，丙酮梯度脫水，618 環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機進行切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，采用掃描電鏡和透射電鏡進行觀察并拍照。

2.4 免疫熒光檢測α-SMA 蛋白 將各處理組細胞爬片用4%多聚甲醛固定15min，0.3% TritonX-100室溫通透15min，4%牛奶封閉2h，一抗4℃孵育過夜，FITC 綠色熒光二抗37℃避光孵育1h，滴加DAPI避光作用5min，50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中α-SMA 蛋白的分布定位。

2.5 實時熒光定量PCR 檢測 收集各處理組細胞提取總RNA，逆轉錄成cDNA，并以其為模板進行PCR 擴增。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成。引物序列為：α-SMA 正義5′-AGCGTGGCTATTCCTTCGTT-3′，反義5′-TCAGGCAACTCGTAACTCTTCT-3′；COLⅠ正義5′-TTCCTGCGCCTGATGTCC-3′，反義5′-GGTTCAGTTTGGGTTGCTTGT-3′。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s；60℃退火30s 后采集熒光信號，重復40 個循環(huán)。以GAPDH為內參，用所得Ct 值計算出相關蛋白的相對表達量。

2.6 Western blot 檢測 收集各處理組細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白并測定濃度，變性后進行SDSPAGE 電泳，300mA 電流轉膜80min，5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗孵育1h，Odyssey 近紅外雙色激光成像系統掃描、拍照成像，分析相關蛋白的表達情況。

2.7 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件分析，實驗數據用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，方差齊性則采用Bonferroni 法，方差不齊者用Dunnet's T3 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 不同濃度OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞增殖的影響 25、50、100μg/mL 的OJP 可抑制TGF-β1誘導的HEL 細胞增殖，且隨著OJP 濃度的增加而增強（P<0.05），呈劑量依賴趨勢。因此，后續(xù)實驗選取100μg/mL 的OJP 進行干預。見表1。

表1 不同OJP 濃度對TGF-β1 誘導的HEL 細胞增殖的影響（%，）

表1 不同OJP 濃度對TGF-β1 誘導的HEL 細胞增殖的影響（%，）

注：OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；與0μg/mL 比較，aP<0.05

3.2 OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞超微結構的影響 通過掃描電鏡（圖1A）和透射電鏡（圖1B）分別觀察TGF-β1 誘導的HEL 細胞超微結構發(fā)現，與模型組相比，100μg/mL OJP 干預組細胞表面微絨毛減少、微絲變短，胞漿內線粒體數目下降，粗面內質網減少。

圖1 OJP 對HEL 細胞表面微觀結構和細胞器的影響

3.3 OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞α-SMA 蛋白表達的影響 免疫熒光結果顯示，對照組α-SMA 多不表達或很少表達，模型組α-SMA 在細胞核與胞漿內均表達且表達量增加，而100μg/mL OJP 干預組α-SMA 蛋白表達量明顯降低，見圖2。

圖2 OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞中α-SMA 表達的影響（免疫熒光×200）

3.4 OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達的影響 模型組α-SMA 和COLⅠ mRNA 相對表達量較對照組均明顯增加（P<0.05），100μg/mL OJP 干 預 組α-SMA 和COL ⅠmRNA 相對表達量較模型組均明顯下降（P<0.05），見表2。

表2 各組細胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達比較（）

表2 各組細胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達比較（）

注：對照組為HEL 細胞未經處理；模型組為HEL 細胞經TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 干預組為HEL 細胞經TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后再加入100μg/mL 的OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；α-SMA 為α 平滑肌肌動蛋白；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.5 OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 表達的影響 模型組α-SMA、COLⅠ、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達較對照組均顯著增加（P＜0.01），而100μg/mL 的OJP 干預組α-SMA、COLⅠ、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達較模型組均顯著下降（P＜0.01），見表3，圖3。

圖3 Western blot 檢測OJP 對TGF-β1 誘導HEL 細胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達

表3 各組細胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達比較（）

表3 各組細胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達比較（）

注：對照組為HEL 細胞未經處理；模型組為HEL 細胞經TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 干預組為HEL 細胞經TGF-β1 6ng/mL處理2h 后再加入100μg/mL 的OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；α-SMA 為α 平滑肌肌動蛋白；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白；Smad2 為信號轉導蛋白；p-Smad2 為磷酸化信號轉導蛋白；與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

4 討論

肺纖維化病因目前尚未明確，HEL 的活化被認為是其發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。HEL 已被證實可造成細胞外基質大量沉積，促進上皮細胞損傷并誘導其凋亡，加重炎癥反應，降低肺的順應性[8]。肌成纖維細胞的遷移和分化可能是肺纖維化起始和進展中關鍵步驟之一[9]。TGF-β1 可通過Smads 蛋白通路使正常的成纖維細胞發(fā)生表型轉化為肌成纖維細胞，α-SMA 和膠原蛋白的表達增強且抑制降解，從而促進細胞外基質沉積[10]。若能抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化這一過程，則有望成為治療纖維化疾病的新靶點。

研究表明，OJP 對某些纖維化疾病、糖尿病、心血管疾病及增強機體免疫力上有一定防治作用[7]。OJP 可干預氧自由基的損傷，改善細胞外基質（ECM）代謝，從而對肺間質纖維化的治療起一定作用[7，11]。寧萌等[12]發(fā)現，OJP 能促進脂肪細胞對葡萄糖的轉運和利用，在治療2 型糖尿病大鼠過程中能降低其空腹血糖和改善胰島素抵抗作用。Fan 等[13]研究表明，經OJP 對異丙腎上腺素誘導的大鼠具有心臟保護作用，同時還能降低ET-1 的水平并增加NO 的水平，重建血管舒張和收縮的平衡。此外OJP 及其脂質體已被證實可以顯著改善巨噬細胞的吞噬活性，在機體免疫反應中發(fā)揮重要作用[14]。本實驗選用TGF-β1進行誘導造模，方便快速可控。結果表明，一定濃度的OJP 可抑制HEL 細胞向肌成纖維細胞的轉化。

TGF-β 主要通過Smads 信號通路實現調節(jié)功能，其與細胞膜上的TGF-β 受體（TβRⅡ）結合，誘發(fā)其磷酸化，繼而與Ⅰ型受體（TβRⅠ）結合形成三聚體，誘導Smad2/3 的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化形成p-Smad2/3，離開TβRⅠ受體后與Smad4 結合形成復合體，入核調控靶基因轉錄，導致正常的成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，產生大量細胞外基質蛋白成分α-SMA、COLⅠ等，從而加強TGF-β 的誘導效果[15]。本實驗結果顯示，HEL 細胞受TGF-β1 刺激后Smad2 和p-Smad2 蛋白表達量增加；不同濃度的OJP 干預后，Smad2 和p-Smad2 蛋白的表達量減少，提示OJP 可能是通過TGF-β/Smads 信號通路，下調HEL 細胞中Smad2 和p-Smad2 蛋白的表達，從而抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。

綜上所述，本實驗結果顯示，OJP 對TGF-β1 誘導的HEL 細胞向肌成纖維細胞轉化的進程有一定的抑制作用，并與TGF-β/Smads 信號通路相關。