郭錦濤，郝縉，徐懷德，李梅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞屬的一種，果實(shí)稱枸杞子，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用材料[1]，含有多種活性物質(zhì)，如黃酮、類胡蘿卜素、多糖等[2]，具有增強(qiáng)人體各項(xiàng)機(jī)理的功效，如滋補(bǔ)虛弱、益精氣、去冷風(fēng)、壯陽道、止淚、健腰腳等[3]。目前常見的枸杞深加工產(chǎn)品主要有枸杞果干、枸杞果汁和枸杞果酒等[4-5]。

枸杞浸提酒是將枸杞與白酒基酒按一定比例進(jìn)行混合，在容器中浸泡一定時(shí)間，使枸杞內(nèi)的生物活性成分浸入基酒中，制得的成品酒。枸杞浸提酒中含有如枸杞黃酮、枸杞多糖[6]、甜菜堿等多種活性成分。黃酮具有抗氧化[7]、改善血液循環(huán)[8]、降低血糖[9]等有益于人體的功能，是人體內(nèi)不可或缺的一種功能性成分，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充黃酮將會(huì)對(duì)人們的身體大有裨益。枸杞多糖構(gòu)成成分有6種，分別為阿拉伯糖、葡萄糖、醋多糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖[10],在枸杞酒的功能中有著舉足輕重的地位[11]，具有醫(yī)治不孕不育[12]、抗氧化[13-14]、延緩衰老[15]、抗腫瘤[16]、抗輻射[17]、降血糖[18]等多種功效。甜菜堿具有抗腫瘤、降血壓、抗消化性潰瘍及胃腸功能障礙等功能，還可用于治療肝臟類疾病[19]。當(dāng)甜菜堿作為飼料添加劑使用時(shí)，可以提供甲基供體[20]。

枸杞的浸提時(shí)間不同，其功效成分溶出程度不同，枸杞浸提酒的品質(zhì)亦不同。因此枸杞在酒中的浸提時(shí)間是影響枸杞浸提酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素。本文比較了枸杞在不同酒度基酒浸提不同時(shí)間的品質(zhì)變化規(guī)律（包括色澤、黃酮、多糖、甜菜堿及香氣成分），以期獲得不同酒度品質(zhì)最佳的枸杞浸提酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮枸杞（含水量 80%）、基酒（酒度 67% vol）：青海興諾杞業(yè)有限公司；乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒽酮試劑、濃硫酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、3，5-二硝基水楊酸、甲醇溶液、氨化甲醇、乙腈溶液（均為分析級(jí)試劑）：國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設(shè)備

JM-A5002電子天平：諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；DGH-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀：島津儀器有限公司；GCMSQP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將鮮枸杞與基酒按一定比例混合，得到酒度為42% vol、45% vol、53% vol的枸杞浸提酒，密封瓶蓋。之后分別在枸杞浸泡 5、10、15、20、25 d 時(shí)進(jìn)行取樣，用于枸杞酒品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定，并對(duì)樣品按照酒度從低到高，浸提時(shí)間從短到長(zhǎng)的順序進(jìn)行編號(hào)，依次命名為1號(hào)至15號(hào)，待測(cè)。

1.3.2 色澤測(cè)定

將樣品按照酒度的不同分為3組，按照浸提時(shí)間從短到長(zhǎng)的順序依次對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。色差儀先用標(biāo)準(zhǔn)黑白板校正，待自動(dòng)校正完成之后，按下測(cè)試鍵，讀出標(biāo)準(zhǔn)樣的L*、a*、b*絕對(duì)值。用比色皿稱取適量樣品，放入色差儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。記錄該樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣的色差值：dL*、da*、db*等。其余樣品按照上述操作步驟重復(fù)操作[21]。

1.3.3 黃酮含量測(cè)定

蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[22]：稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇定容至50 mL，搖勻后制得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入0.3 mL質(zhì)量濃度為5%的亞硝酸鈉，搖勻之后靜置6 min，再加入0.3 mL質(zhì)量濃度為10%的硝酸鋁，搖勻之后同樣靜置6 min，最后加入4 mL質(zhì)量濃度4%的氫氧化鈉，以30%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，以不加蘆丁的溶液為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)為吸光度值、縱坐標(biāo)為蘆丁濃度（mg/mL），得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.095 9x-0.001 1，R2=0.988 2。

樣品含量測(cè)定：準(zhǔn)確量取3 mL樣品于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL質(zhì)量濃度為5%的亞硝酸鈉，后續(xù)操作見標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制所述，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮的含量，結(jié)果以mg/mL表示。

1.3.4 多糖含量測(cè)定

1.3.4.1 總糖含量測(cè)定

總糖含量使用蒽酮-硫酸法進(jìn)行測(cè)定[23]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取0.2 g蒽酮，將其倒入100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的硫酸中，制得蒽酮試劑[24]。準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的葡萄糖50 mg，取水補(bǔ)至50 mL，量取10 mL移至100 mL容量瓶，定容即得0.1 mg/mL葡萄糖溶液。 分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 至試管，在冰浴條件下加入4 mL蒽酮試劑，加水定容至5 mL。沸水浴中煮沸10 min，冷卻至25℃后在620 nm下測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)為吸光度值、縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度（mg/mL），得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.016 4x+0.000 2，R2=0.998 2。

樣品總糖含量測(cè)定：準(zhǔn)確量取1.0 mL樣品至試管，在冰浴條件下加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴中煮沸10 min，冷卻至25℃后在620 nm下測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總糖含量，結(jié)果以mg/mL表示。

1.3.4.2 還原糖含量測(cè)定

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[25]：準(zhǔn)確稱取1 g標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，將其加入到1 000 mL蒸餾水中，得到濃度為1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取7支25 mL刻度試管，按1號(hào)至7號(hào)編號(hào)，分別量取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液至其中， 再分別加入 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL蒸餾水，之后每個(gè)試管內(nèi)均加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻之后在沸水浴的條件下加熱5 min，取出之后立刻將其放入冷水中，待其冷卻至25℃之后，再用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。在540 nm波長(zhǎng)下，用1號(hào)管作為參比調(diào)零，測(cè)定溶液的吸光度值[26]。橫坐標(biāo)為吸光度值、縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度（mg/mL），得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0835x+0.0014，R2=0.9974。

樣品還原糖含量測(cè)定：取25 mL刻度試管，準(zhǔn)確量取2 mL稀釋了100倍的樣品和1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作。測(cè)定各管中溶液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖含量[27]。

1.3.4.3 多糖含量測(cè)定

1.3.5 甜菜堿含量測(cè)定

枸杞甜菜堿含量測(cè)定[28]：稱取10 mL樣品于50 mL離心管中，以4 000 r/min離心4 min，過濾。吸取濾液5 mL，將其加入到已活化的Waters Oasis MCX固相萃取小柱中，需要同時(shí)控制自然流速，等待樣液進(jìn)入萃取小柱的吸附層后，依次使用5 mL 80%甲醇溶液、5 mL甲醇對(duì)其進(jìn)行淋洗,最后用5 mL氨化甲醇進(jìn)行洗脫，并重復(fù)洗脫一次[29]。將收集的洗脫液氮吹濃縮，使其接近干的狀態(tài)，之后用2 mL乙腈溶液溶解定容，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制 0.000、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。以甜菜堿濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2×106x+336 433，R2=0.979 1。

樣品測(cè)定：色譜柱Atlantis HILIC（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 乙腈-水；流速 1.0 mL/min；柱溫 25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)195 nm；進(jìn)樣體積20 μL。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相配比Table 1 Gradient elution mobile phase ratio

1.3.6 香氣成分測(cè)定

頂空固相微萃取[30]：準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品至15 mL頂空瓶中，加入1.00 g NaCl和800 μL 0.4 mg/mL環(huán)己酮，加蓋密封。使用固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）萃取頭（50/30 μm DVB/PDMS）在 40 ℃頂空萃取30 min，將萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）儀進(jìn)樣口，解吸 5 min。

氣相色譜條件：DB-LMS石英毛細(xì)柱（60 m×0.25 mm×0.25 mm）；初始溫度為40℃，保持該溫度3 min，以4℃/min的速度上升到120℃，再以6℃/min的速度上升到240℃，保持該溫度9 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度250℃，分流進(jìn)樣，分流比為10。

質(zhì)譜條件：接口溫度230℃；電子能量70 eV；放射電流150 μA；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；質(zhì)子掃描范圍35 aum～500 aum[31]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒色澤的影響

浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒色澤的影響如圖1所示。

dL*值反映樣品的亮度變化，da*值反映樣品的紅/綠變化，db*值反映樣品的黃/藍(lán)變化。由圖1（A）可知隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3種酒度的浸提酒dL*值先急劇下降，后呈平穩(wěn)趨勢(shì)，說明浸提酒的亮度先減小，后基本不變。由圖1（B）、（C）可知隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，da*值在5 d內(nèi)迅速下降，10 d之后42% vol、45% vol酒da*值呈上升趨勢(shì)，53% vol酒da*值呈下降趨勢(shì)而db*值先快速上升后緩慢上升，說明浸提酒的顏色逐漸趨于紅黃色，但在5 d～25 d內(nèi)，浸提酒顏色變化不明顯。枸杞浸提酒色澤的變化是因?yàn)殡S著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，枸杞中的成分伴隨著細(xì)胞的破裂溶解到酒中。

圖1 不同酒度枸杞酒浸提不同時(shí)間的dL*、da*、db*值Fig.1 dL*，da*，db*value of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction

2.2 浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒黃酮含量的影響

浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒黃酮含量的影響如表2所示。

由表2可知，42% vol和45% vol酒在浸提到第5天時(shí)黃酮含量達(dá)到最高，分別為0.051、0.049 mg/mL，之后隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)含量基本不變，而53% vol酒在浸提到第15天時(shí)黃酮含量達(dá)到最高，最高含量為0.039 mg/mL。這是因?yàn)殡S著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的溶解量增加，最后含量基本保持不變。

表2 不同酒度枸杞酒浸提不同時(shí)間的黃酮含量Table 2 Flavonoids content of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

2.3 浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒多糖含量的影響

浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒多糖含量的影響如表3所示。

表3 不同酒度枸杞酒浸提不同時(shí)間的總糖、還原糖、多糖含量Table 3 The content of total sugar,reducing sugar and polysaccharide of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

由表3可以看出42% vol枸杞酒中的枸杞多糖隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加且增加量較為明顯，從第5天的8.75 mg/mL增加到第25天的21.99 mg/mL，這可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),加快了細(xì)胞的破裂,從而使多糖更好地溶解到水中，使枸杞多糖含量升高[32]。45% vol、53% vol枸杞酒中的枸杞多糖含量分別在第10天、第20天達(dá)到最大值7.89、5.83 mg/mL，而隨著浸提時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，多糖含量稍有降低，這可能是多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使多糖含量降低[32]。

2.4 浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒甜菜堿含量的影響

浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒甜菜堿含量的影響如表4所示。

由表4可知，42% vol酒中甜菜堿的含量隨著浸提時(shí)間的增加而不斷增大，在第25天有最大值1.904 mg/L，這可能是隨著浸提時(shí)間增加，甜菜堿的溶出量不斷升高，導(dǎo)致其含量逐漸升高。45% vol酒和53% vol酒中甜菜堿含量在第10天時(shí)分別達(dá)到最大值3.070、2.095mg/L，之后隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，甜菜堿含量逐漸下降。

表4 不同酒度枸杞酒浸提不同時(shí)間的甜菜堿含量Table 4 Betaine content of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

2.5 浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒香氣成分的影響

浸提時(shí)間對(duì)不同酒度枸杞浸提酒香氣成分的影響如表5所示。

表5 不同酒度枸杞酒浸提不同時(shí)間的香氣成分含量Table 5 The content of aroma components of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

由表5可知，42% vol浸提酒共檢測(cè)出28種香氣成分，包括1種醛類，4種醇類，19種酯類，4種酮類，其中典型香氣成分為辛酸乙酯，其含量在第10天時(shí)達(dá)到最大值即1.608 mg/mL；45% vol浸提酒共檢測(cè)出25種香氣成分，包括1種醛類，3種醇類，19種酯類，2種酮類，典型香氣成分也為辛酸乙酯，其含量在第15天時(shí)達(dá)到最大值即1.962 mg/mL；53% vol浸提酒共檢測(cè)出21種香氣成分，包括1種醛類，3種醇類，16種酯類，1種酮類，典型香氣成分同樣為辛酸乙酯，其含量在第20天時(shí)達(dá)到最大值即2.785 mg/mL。

3 結(jié)論

不同酒度枸杞浸提酒在5 d～25 d內(nèi)，色澤變化不是非常明顯，即在任意一個(gè)浸提時(shí)間，浸提酒的色澤都可以被接受。3種酒度枸杞浸提酒在25 d內(nèi)黃酮含量變化很小，42% vol和45% vol酒的黃酮含量在第5天達(dá)到最大值，53% vol酒的黃酮含量在15 d達(dá)到最大值。對(duì)于枸杞多糖的研究表明，42% vol酒中的枸杞多糖隨著浸提時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在第25天達(dá)到最大值，45% vol、53% vol酒的枸杞多糖含量分別在第10天、第15天達(dá)到最大值。對(duì)于甜菜堿含量來說，42% vol酒中甜菜堿的含量隨著浸提時(shí)間增長(zhǎng)不斷升高，在第25天有最大值，而45% vol酒和53% vol酒中甜菜堿含量在第10天時(shí)達(dá)到最大值。此外，對(duì)3種酒度枸杞浸提酒的香氣成分研究表明，典型香氣成分均為辛酸乙酯，且 42% vol、45% vol、53% vol酒中辛酸乙酯的含量分別在第10、15、20天達(dá)到最大值。綜合考慮得出42% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時(shí)間為10 d，45% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時(shí)間為10 d，53% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時(shí)間為20 d。本研究為不同酒度枸杞浸提酒的開發(fā)提供了一定的理論參考。