孫坤秀，胡志剛，成玉梁，于航，謝云飛，姚衛(wèi)蓉，郭亞輝*，錢和

（1.江南大學食品學院，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214000；2．無錫市兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇無錫214000）

熒光分析是一種利用物質(zhì)受到光照射而發(fā)射熒光的特性對物質(zhì)進行定性或定量分析的方法。熒光測量可大體分為穩(wěn)態(tài)光譜測量和時間分辨光譜測量。穩(wěn)態(tài)光譜測量是采用時間尺度較長的連續(xù)光源激發(fā)樣品并連續(xù)收集樣品發(fā)射出的熒光信號；時間分辨熒光分析技術(shù)（time-resolved fluorescence analysis，TRFA）是用時間尺度很短的脈沖光照射并利用高速檢測設(shè)備反復收集樣品發(fā)出的單電子熒光信號，得到熒光衰減譜，因此穩(wěn)態(tài)光譜測量從概念上可以看作是時間分辨熒光在一定時間內(nèi)的疊加[1]。而且穩(wěn)態(tài)光譜由于熒光強度的衰減，激發(fā)光源需要持續(xù)照射熒光物質(zhì)，并且需要使用單色器來屏蔽激發(fā)光和雜散光等；而TRFA使用鑭系螯合物，利用這類熒光物質(zhì)的熒光壽命長及斯托克斯（Stokes）位移大的特點，通過波長和時間兩種分辨，有效排除了非特異性熒光信號的干擾，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、標準曲線線性范圍寬等優(yōu)點，目前TRFA是最有發(fā)展前途的超微量檢測分析技術(shù)[2]。

1 TRFA的原理及特點

1.1 TRFA技術(shù)原理

TRFA是一種以鑭系元素及其復合物（如摻雜無機材料、螯合物等）作為熒光標記物（代替熒光物質(zhì)、同位素或酶），建立的一種新型的非放射性微量熒光分析技術(shù)。該技術(shù)利用鑭系元素標記信號分子，用時間分辨技術(shù)同時對波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，以實現(xiàn)高靈敏分析測定[3]。鑭系稀土金屬離子螯合物有很長的熒光壽命（微秒級），有別于傳統(tǒng)熒光的短熒光壽命，使其能通過時間分辨方式區(qū)別背景熒光（鈉秒級），正是由于熒光衰變時間長，可以延緩測量時間，等待測樣品中短壽命的本底熒光衰變后再測稀土離子的特異熒光，因此可完全消除本底熒光的干擾，提高檢測的靈敏度[4]。

時間分辨熒光是一種特殊的熒光現(xiàn)象，也是一種基于分子吸收光能后以光輻射的形式去活化的過程。這個方法的原理如圖1所示。

圖1 鑭系元素復合物發(fā)光機理Fig.1 Luminescence mechanism of lanthanide complexes

依據(jù)弗蘭克-康登規(guī)則，分子中處于單線態(tài)基態(tài)電子能級S0的電子吸收一定波長的電子后，被激發(fā)至單線態(tài)激發(fā)態(tài)電子能級（一般是S1態(tài)）中的某一振動能級，這一過程約10-15s；在經(jīng)歷短暫的振動弛豫過程后（10-12s～10-10s），會有大量電子在 S1態(tài)的最低振動能態(tài)積累，處于該狀態(tài)的電子會有幾種釋放能量回到基態(tài)S0態(tài)的途徑，包括振動弛豫在內(nèi)的這些途徑被統(tǒng)稱為去活化的過程，若能量釋放的過程中伴隨著光子的放出，則稱為輻射躍遷去活；若只是通過碰撞等途徑釋放能量，而沒有光子放出，則稱為非輻射躍遷。非輻射躍遷過程有以下幾種途徑：（1）內(nèi)轉(zhuǎn)換，電子在具有相同多重度的電子能態(tài)間發(fā)生躍遷的過程，時間通常在10-11s～10-9s；（2）系間跨越是電子在不同多重度的能態(tài)間發(fā)生躍遷的過程，如單線態(tài)S1至三線態(tài)T1的躍遷，其時間通常在 10-10s～10-8s；（3）熒光淬滅是激發(fā)分子通過分子間的相互作用和能量轉(zhuǎn)換，從而釋放能量的過程，也稱作外轉(zhuǎn)換。

熒光發(fā)射即為一種常見的輻射躍遷過程，它通常是指電子發(fā)生自S1態(tài)至S0態(tài)的躍遷，同時放出光子的過程。該過程通常在10-10s～10-7s。時間分辨熒光則是在最后將能量轉(zhuǎn)移到鑭系元素復合物的中心離子，通過其4f-4f能量躍遷而發(fā)出特定的熒光，因此熒光壽命長，Stokes位移大，可以排除非特異性熒光信號的干擾。利用光學儀器檢測熒光發(fā)射的強度隨時間的變化，即可得到體系的熒光壽命信息。

時間分辨光譜是固定波長處熒光隨時間變化，是一種瞬時光譜，是激發(fā)光脈沖截止后相對于激發(fā)光脈沖的不同延遲時刻測得的熒光發(fā)射，反映了激發(fā)態(tài)電子的運動過程（即熒光動力學）。一般測量的是熒光衰減譜，即固定檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長，記錄熒光強度隨時間的變化。通常采用基于時域的脈沖法和基于頻域的相移法[5-6]。

1.2 TRFA的特點

TRFA是以鑭系元素及其復合物作為熒光標記物，有以下特點[7]。

熒光發(fā)射峰很窄，使熒光檢測具有很高的效率，進一步提高了信號檢測的特異性和靈敏性。激發(fā)光光譜比較寬，通常在300 nm～500 nm，可通過增加激發(fā)光能量來提高靈敏度。

熒光發(fā)射峰和激發(fā)峰之間有很寬的Stokes位移，使容易通過波長分辨方式進一步區(qū)別背景熒光，提高方法的穩(wěn)定性。鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時間比傳統(tǒng)熒光時間長很多，因此可以等其它物質(zhì)的熒光衰變后再測量，極大地降低了本底熒光，使敏感性提高。鑭系離子由激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時發(fā)射熒光，可多次激發(fā)鑭系離子，使標記比活性大大提高。

2 TRFA在食品污染物檢測中應(yīng)用進展

食品污染物是指凡不是有意加入食品中，而是在生產(chǎn)、制造、處理、加工、填充、包裝、運輸和貯藏等過程中加入食品的任何物質(zhì)，但不包括昆蟲碎體、動物毛發(fā)和其它不尋常的物質(zhì)。食品在從生產(chǎn)（包括農(nóng)作物種植、動物飼養(yǎng)和獸醫(yī)用藥）、加工、包裝、貯存、運輸、銷售，直至食用等過程中產(chǎn)生的或由環(huán)境污染帶入的、非有意加入的化學性危害物質(zhì)。食品污染分為生物污染、化學污染和物理污染，主要的食品污染物包括細菌、病毒、寄生蟲、真菌、生物毒素、殺蟲劑、抗生素、農(nóng)獸藥殘留和有毒重金屬等。隨著國內(nèi)外食品安全標準越來越嚴格，對檢測方法提出了更高的要求，尤其是在高通量高靈敏度方面，雖然常見的檢測方法高效液相色譜法、質(zhì)譜分析法、原子光譜法等也能實現(xiàn)高靈敏度的檢測，但是這些方法的前處理過程復雜、對設(shè)備要求較高且檢測時間長；而且一些食品污染物如重金屬、真菌毒素等還具有蓄積毒性，會導致疾病的發(fā)生，因此高靈敏度的檢測方法是檢測污染物濃度水平和開展膳食暴露評估的重要工具。由于時間分辨熒光分析技術(shù)的高靈敏度，結(jié)合免疫學等快速檢測技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于食品污染物的檢測。TRFA在食品污染物檢測中的應(yīng)用包括生物污染和化學污染，在生物污染方面，TRFA檢測的主要是微生物和真菌毒素，化學污染方面檢測的主要是農(nóng)獸藥和重金屬。

2.1 TRFA應(yīng)用于食品中微生物的檢測

微生物種類繁多，它們廣泛存在于自然界和人們的正常生產(chǎn)、生活中，但是食品中某些微生物的存在會使人的健康受到威脅，為了更好地保護人們的健康和控制食品產(chǎn)品的衛(wèi)生安全，食品中微生物的檢測是食品檢測工作的重點內(nèi)容[8-9]。

Yu等[10]建立了一種基于免疫磁分離和時間分辨熒光分析技術(shù)檢測蘋果酒中O157∶H7大腸桿菌的免疫分析方法，時間分辨熒光免疫分析法采用與免疫磁頭結(jié)合的多克隆抗體作為捕獲抗體，用銪標記的同一抗體作為檢測抗體。Jaakohuhta等[11]使用時間分辨熒光分析技術(shù)，以包含乳膠納米顆粒的銪（Ⅲ）螯合劑作為示蹤劑，增加夾層免疫分析的靈敏度，建立了檢測李斯特菌的納米免疫分析法。Kulpakko等[12]建立了一種檢測大腸桿菌的方法，使用特異噬菌體破裂大腸桿菌，在沒有大腸桿菌的情況下，不能形成發(fā)光的Eu3+螯合物，并監(jiān)測到低時間分辨的發(fā)光信號，在大腸桿菌存在的情況下，當細胞內(nèi)容物被過濾到周圍的培養(yǎng)基中時，可以觀察到發(fā)光信號的增加，且發(fā)光信號是樣品中細菌數(shù)量的函數(shù)。Bouchard等[13]建立了一種檢測肉表面細菌的時間分辨熒光分析技術(shù)，利用時間分辨熒光分析技術(shù)高靈敏度檢測肉表面細菌和副產(chǎn)物自發(fā)的熒光。

2.2 TRFA應(yīng)用于食品中真菌毒素的檢測

真菌毒素是一種由真菌產(chǎn)生的小分子有毒次級代謝產(chǎn)物，食品中的真菌毒素主要是由霉菌產(chǎn)生的，污染食品后引起的危害主要是真菌引起食物變質(zhì)和真菌產(chǎn)生的毒素引起中毒，造成經(jīng)濟損失和威脅身體健康[14]。糧食和飼料在生產(chǎn)、收獲、儲存及加工過程中容易受到霉菌的污染引發(fā)霉變，其中玉米、大米、花生、小麥被污染真菌毒素的種類最多[15]。對人類危害嚴重的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素 A（ochratoxin，OA）、展青霉素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、橘霉素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等。

TRFA應(yīng)用于真菌毒素的檢測主要基于不同的檢測原理，如免疫學檢測原理、適配體檢測原理。Wang等[16]使用時間分辨熒光免疫層析試紙對大豆醬油中的黃曲霉毒素B1進行檢測，是一種將時間分辨熒光和免疫層析結(jié)合起來的快速定量檢測毒素的方法，動態(tài)檢測范圍是 0.3 μg/kg～10.0 μg/kg，最低檢測限是0.1 μg/kg；Zhang等[17]也建立了一種時間分辨熒光免疫層析法定量檢測微囊藻毒素（microcystin，MC）。Niazi等[18]制作了一個適體傳感器利用時間分辨熒光同時檢測玉米中的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）和伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1），檢測原理是使用適配體與納米磁性粒子結(jié)合作為捕獲探針、cDNA與信號分子結(jié)合作為信號探針，沒有目標毒素的時候，通過DNA的雜交和磁分離發(fā)出熒光獲得信號，有目標毒素的時候，目標毒素與信號探針競爭結(jié)合捕獲探針，使得發(fā)出的熒光信號降低，F(xiàn)B1和OTA的檢出限分別為0.019 pg/mL和0.015 pg/mL，遠低于之前所述的同時識別FB1和OTA真菌毒素的方法；Wen等[19]建立了一種快速、靈敏的時間分辨熒光分析技術(shù)檢測志賀毒素2（shiga toxin2，Stx2），在夾心模式下，將抗Stx2的單克隆抗體包覆在微滴度板上作為捕獲抗體。使用銪（III）螯合物標記的Stx2示蹤抗體作為檢測器，然后使用時間分辨熒光進行熒光測量；Huang等[20]以多色鑭摻雜的時間分辨熒光納米粒子作為生物探針，建立了檢測牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素的方法。

2.3 TRFA應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留和獸藥殘留的檢測

農(nóng)獸藥本身是用來保護動植物的，但是一些不正確的操作可能導致動植物農(nóng)獸藥殘留含量的超標，從而危害人體的健康，所以需要采取一定的檢測措施監(jiān)測市場上動植物產(chǎn)品的農(nóng)獸藥含量是否符合國家標準[21-23]。

Tang等[24]開發(fā)了一種用于谷物食品中農(nóng)藥殘留和霉菌毒素同時檢測的定量紙傳感器，該原理是包被抗原和檢測的有害化學物質(zhì)競爭結(jié)合Eu（Ⅲ）標記的單克隆抗體，在陰性樣品中，單克隆抗體均與包被抗原結(jié)合，具有最大的熒光信號。在陽性樣品中，有害化學物質(zhì)與部分單克隆抗體結(jié)合，導致與包被抗原結(jié)合的單克隆抗體數(shù)量減少，熒光信號值降低，所以隨著有害化學物質(zhì)的濃度增加熒光信號降低；Zhang等[25]建立了檢測農(nóng)產(chǎn)品中卡巴呋喃殘留量的方法，卡巴呋喃是氨基甲酸酯類廣譜內(nèi)吸殺蟲殺螨殺線蟲劑，試驗是基于雙標免疫探針，一種是與銪微球偶聯(lián)的卡巴呋喃特異性抗體作為T信號，另一種是小鼠免疫球蛋白G與銪微球偶聯(lián)作為對照C信號，通過建立卡巴呋喃濃度與T/C之間的定量關(guān)系確定卡巴呋喃濃度；Peippo等[26]建立了一種用于家禽血漿中那拉霉素檢測的時間分辨免疫分析法，那拉霉素可以用于預防禽球蟲病，該方法的判斷限和檢測能力分別是1.2 ng/mL和1.5 ng/mL。Hagren等[27]建立了一種競爭性的時間分辨熒光免疫分析法，可用于雞蛋中莫能菌素殘留的定性和定量測量；Le等[28]采用雙標時間分辨熒光免疫分析法同時測定食用動物組織中金霉素和強力霉素的含量，使用銪和釤標記抗體。

2.4 TRFA應(yīng)用于食品中重金屬的檢測

重金屬是比重大于5的金屬，一些重金屬是維持人體生命活動所必需的，而一些重金屬的攝入超標則會嚴重損害人體器官，威脅到人們的生命安全[29]。所以需要在食品進入市場之前，對食品中的重金屬進行檢測，防止重金屬含量超標的食品進入市場。

Lin等[30]設(shè)計了一種基于蛋白/鑭系絡(luò)合物[牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）/Tb3+]的傳感器陣列，可以用于時間分辨熒光檢測鐵、銅、鉻等17種金屬離子，該方法的原理：由于BSA到Tb3+的能量轉(zhuǎn)移，BSA/Tb3+能增強射頻調(diào)諧（tuned radio-frequency,TRF），而BSA可以通過Asp和Glu的羧基與金屬離子結(jié)合，且BSA與金屬離子之間的高親和力會誘導BSA/Tb3+配合物的構(gòu)象變化從而對于每種金屬都有不同的TRF響應(yīng)，所以可以檢測不同的金屬離子。

3 展望

由于TRFA的高靈敏度、分析速度快，在醫(yī)學檢測中應(yīng)用十分廣泛；隨著食品污染物限量值降低，對高毒性污染物檢測方法靈敏度要求提高，TRFA技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。TRFA目前主要應(yīng)用于免疫分析領(lǐng)域，免疫學檢測方法主要取決于抗體的制備，但是由于某些小分子抗體制備較為困難，而更適用于小分子的適配體技術(shù)，因此抗體庫的完善以及適配體的快速篩選技術(shù)成為未來TRFA的重要發(fā)展方向。此外，在分子生物學檢測領(lǐng)域，由于鑭系復合物相比傳統(tǒng)染料的優(yōu)勢，TRFA在核酸檢測方向的應(yīng)用研究也非常具有潛力。