張捷，暢曉暉，柳明，李小林，萬曉楠，槐碩，趙琢*

（1.中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京100026;2.出入境食品安全檢測北京市重點實驗室，北京100026；3.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計，全球每年大約有10億人發(fā)生食源性疾病，其中由食源性致病菌引起的食品安全事件，造成全球每年約349億美元的經(jīng)濟(jì)損失。沙門氏菌病是歐盟繼彎曲桿菌病之后第二種常見的食源性疾病，是食源性疾病暴發(fā)的重要原因[1-2]。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測分型，多采用血清學(xué)分型，而定量檢測無法準(zhǔn)確分析其主要基因型及變化情況，難以滿足實際的預(yù)防檢測要求。全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）是一種新興的分子流行病學(xué)工具[3-4]。最近的研究表明，致病菌分型可以使用WGS積累的大量DNA序列數(shù)據(jù)區(qū)分非常密切相關(guān)的分離株，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型（multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）[3]。 此外，WGS可以識別分離株組之間特定分子的差異，從而可以鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹上的特征，以顯示菌群之間的進(jìn)化關(guān)系。本研究采用快速的全基因組測序分型和多位點序列測定分型（multilocus sequence typing，MLST）方法。該方法可直接進(jìn)行沙門氏菌主要基因型的檢測，縮短了沙門氏菌基因型的排查時間。經(jīng)過軟件分析可對其親緣關(guān)系進(jìn)行分析鑒定，是一種適用性較強(qiáng)的檢測方法。本研究對前期分離鑒定的36株沙門氏菌進(jìn)行全基因組測序、MLST分型及毒力基因篩查，比較不同來源沙門氏菌的基因型及毒力基因分布情況，從而為食源性致病菌沙門氏菌的風(fēng)險識別和溯源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

36株不同來源的沙門氏菌由中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心分離、鑒定保存；參考菌株：腸炎沙門氏菌ATCC9184、傷寒沙門氏菌ATCC50071（美國ATCC菌種保藏中心）均由中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心保存。

1.2 試劑

亞硒酸鹽胱氨酸（selenite cystine broth，SC）增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂：賽默飛世爾科技公司；顯色培養(yǎng)基：上海欣中生物工程有限公司；DNA提取試劑盒：寶生物工程有限公司。

1.3 DNA完整性檢測

把38個提取好的DNA樣品放在冰上融化后，吹打混勻離心待檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%、電壓150 V、電泳時間40 min）檢測樣品的完整性，用于構(gòu)建DNA文庫。

1.4 全基因組測序

細(xì)菌基因組de novo測序。采用illumina平臺對36株沙門氏菌進(jìn)行測序。用檢測合格的樣品構(gòu)建文庫，最后用合格的文庫進(jìn)行集群cluster制備和測序。

1.5 MLST分型

根據(jù)全基因組測序結(jié)果分析7個管家基因（aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、suc A、thrA），每株菌的 7 個位點組合獲得一個ST型。然后通過Eburst（http：//eburst.mlst.net）對沙門氏菌分離株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

1.6 沙門氏菌毒力基因篩查

采用毒力因子數(shù)據(jù)庫（virulence factors database，VFDB）對毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括 sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR等基因及侵襲基因invA/invF、細(xì)胞致死膨脹素基因cdtB、毒力基因spvB等進(jìn)行分析。

1.7 沙門氏菌聚類分析及數(shù)據(jù)處理

基于全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)發(fā)生樹（phylogenetic tree）是表明被認(rèn)為具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹。它用來表示系統(tǒng)發(fā)生研究的結(jié)果，用它描述物種之間的進(jìn)化關(guān)系?；赟NP結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化分析并構(gòu)建最大似然法進(jìn)化樹。采用MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整性檢測

樣品前處理：將提取好的36個菌株的DNA樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進(jìn)行檢測。檢測參數(shù)：膠濃度1%；電泳150 V；電泳時間40 min。圖1為電泳檢測圖譜（以1號～16號菌株DNA樣品為例）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖譜檢測DNAFig.1 Detection of DNA by agarose gel electrophoresis

采用DNA Marker作對照，確定樣品的相對分子量。DNA如果降解或者混有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、RNA，則可以通過電泳檢測。36個DNA樣品的完整性使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，所有檢測條帶均位于同一位置23 130 bp。因此，所有DNA樣品均合格，并可用于構(gòu)建DNA文庫。

2.2 沙門氏菌MLST分型結(jié)果

36株沙門氏菌MLST分型結(jié)果見表1。

由表1可知，共獲得11個ST型，其中獲得優(yōu)勢的ST型為ST11，有17株占47.2%，其次為ST19，有8株占22.2%。其中ST11與ST78標(biāo)準(zhǔn)菌株的7個管家基因中，5個基因完全相同，親緣關(guān)系較近，均為腸炎沙門氏菌；ST19與ST34的7個管家基因中，5個基因完全相同，親緣關(guān)系較近，均為鼠傷寒沙門氏菌。

表1 36株沙門氏菌MLST分型結(jié)果Table 1 36 strains of Salmonella MLST typing results

2.3 毒力基因分析

基于全基因組測序結(jié)果，采用毒力因子數(shù)據(jù)庫對毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR、侵襲基因invA/invF、細(xì)胞致死膨脹素基因cdtB、毒力基因spvB等進(jìn)行分析見表2。

表2 36株沙門氏菌毒力基因分析Table 2 Analysis of virulence genes of 36 strains of Salmonella 株

將36株沙門氏菌進(jìn)行全基因組重測序，選用VFDB數(shù)據(jù)庫對菌株毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）SPI-1、SPI-2、 SPI-3、 SPI-4、SPI-5 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除sopE、sopE2外其余致病島基因均為保守基因。 88.2%（15/17）腸炎沙門氏菌攜帶sopE，69.2%（9/13）鼠傷寒氏菌攜帶sopE。腸炎沙門氏菌中88.2%（15/17）的菌株攜帶sopE2，鼠傷寒沙門氏菌中92.3%（12/13）的菌株攜帶sopE2。研究表明沙門氏菌的致病性與毒力基因相關(guān)，包括菌毛黏附類因子、調(diào)節(jié)因子、毒力島、質(zhì)粒上的毒性基因、毒素等[5-6]。感染初期沙門氏菌入侵腸上皮細(xì)胞是由毒力島SPI-1控制的。SPI-2Ⅲ型分泌系統(tǒng)編碼sseL使細(xì)菌在體內(nèi)持續(xù)慢性感染，它通過阻止宿主細(xì)胞中的免疫細(xì)胞遷移，減弱宿主清除細(xì)菌的能力[7-9]。 SPI-3的基因mgtC與宿主吞噬細(xì)胞的毒力相關(guān)[10]。除了染色體上的毒力基因，毒力質(zhì)粒上的代表基因主要是spvB和pefA[4，11]。prot6E一般位于腸炎沙門氏菌質(zhì)粒中，pefA可促進(jìn)細(xì)菌吸附于腸上皮細(xì)胞，與菌毛形成有關(guān)[12-15]。

本研究中36株沙門氏菌均攜帶有SPI1～SPI5代表性基因和調(diào)節(jié)基因，它們是沙門氏菌具有高致病力的分子基礎(chǔ)。該菌重要的致病因子鞭毛蛋白由fliC或fliB編碼，可引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。hisH為組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基底結(jié)合蛋白，可使組氨酸降解成氨，影響組氨酸的合成。36株沙門菌株中，66.7%（24/36）菌株含有毒性質(zhì)粒spvB基因。腸炎沙門氏菌攜帶spvB高達(dá)82.4%（14/17）、鼠傷寒沙門氏菌攜帶spvB的菌株占76.9%（10/13）。本次分離到的胥伐成格隆沙門菌為多克隆ST241型，占5.56%（2/36）。胥伐成格隆沙門菌與腸炎沙門氏菌明顯不同，兩株胥伐成格隆沙門菌均未攜帶質(zhì)粒毒力基因spvB、pefA、prot6E，反映出基因型差別對攜帶毒力基因的影響。在我國胥伐成格隆沙門菌攜帶毒力基因的研究比較少見。有些毒力因子可以直接產(chǎn)生毒素，如細(xì)胞致死膨脹毒素（cytolethal distending toxin B，CdtB）。 百日咳類毒素（pertussis-like toxins，PltA）在胥伐成格隆沙門氏菌中普遍存在。CdtB、PltA經(jīng)NCBI Blast比對，與傷寒沙門氏菌的相應(yīng)基因（S.typhi CT18）DNA相似性達(dá)97%以上。

2.4 沙門氏菌分離株聚類分析

采用全基因組測序分型方法對36株沙門氏菌分離株進(jìn)行聚類分析，將所有菌株的基因組序列與參考菌株基因組序列進(jìn)行比對分析，獲得單核苷酸多態(tài)性包括3 005個基因為核心基因，共聚成9類。沙門氏菌分離株聚類分析圖見圖2。

圖2 沙門氏菌分離株聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of Salmonella isolates

腸炎沙門氏菌檢測率較多的樣品主要集中在禽肉、豬肉和牛肉。本研究中腸炎沙門氏菌均來源于禽肉包括雞源、鴨源。由圖2可知，腸炎沙門氏菌聚在一類，包括菌株 1、4、5、6、12、13、22、28 等。鼠傷寒沙門氏菌聚在一類，包括 3、7、8、23、25、33、31、35。菌株 2、27號聚在一起，均為胥伐成格隆沙門氏菌。通過聚類圖分析，全基因組分型將沙門氏菌分成9簇，相同的血清型可能分在同一個簇。如2株胥伐成格隆沙門菌，基因型具有高度的相似性。10株鼠傷寒沙門氏菌分在不同的2個簇里，可能是由于不同品種肉類（雞源、鴨源）的沙門氏菌在進(jìn)化上產(chǎn)生了變異。2株胥伐成格隆沙門氏菌聚在一起，均從雞大胸中分離產(chǎn)生。

3 討論與結(jié)論

通過對2017年北京地區(qū)禽類中分離的36株沙門氏菌進(jìn)行分型研究，發(fā)現(xiàn)不同來源菌株的毒力、耐藥、致病性等方面均有存在差異，進(jìn)一步揭示沙門氏菌的分布特征。采用MLST分型法，獲得11個ST型，其中雞源ST11腸炎沙門氏菌為優(yōu)勢菌株；鴨源ST19鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢菌株。印第安納沙門氏菌為ST17型、胥伐成格隆沙門菌為ST241型。同時通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)幾株國內(nèi)未報道過的沙門氏菌，MLST分型分別是 ST1941、ST2441、ST1546。

非傷寒沙門菌（non-typhoid Salmonella，NTS）中，腸炎血清型和鼠傷寒血清型引起的感染和暴發(fā)最為常見，胥伐成格隆血清型原本很少見，但近些年來很多國家發(fā)現(xiàn)該血清型在臨床患者和食源性動物中的分離率明顯上升。細(xì)胞致死膨脹毒素亦出現(xiàn)在此非傷寒沙門菌血清型。在沙門氏菌中，cdtB、pltA、pltB基因編碼組成細(xì)胞膨脹毒素。國內(nèi)外研究表明細(xì)胞致死膨脹毒素CdtA和CdtC在部分沙門氏菌亞種中會缺失，百日咳類毒素PltA和PltB將代替其發(fā)揮作用[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)cdtB、pltA基因在2株胥伐成格隆沙門氏菌中均為陽性，因此推測在胥伐成格隆沙門氏菌普遍攜帶細(xì)胞致死膨脹毒素。本次分離到的胥伐成格隆沙門氏菌均為多克隆ST241型，與劉曉霞等從腸道腹瀉病人標(biāo)本中分離的16株胥伐成格隆沙門菌MLST分型一致[19]。但均未攜帶質(zhì)粒毒力基因spvB、pefA、prot6B。可見胥伐成格隆沙門菌基因型與鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌明顯不同，反映出基因型差別對攜帶毒力基因的影響。在非傷寒沙門氏菌中，近年來數(shù)據(jù)顯示該血清型已經(jīng)在許多國家成為引起食源性疾病的主要病原菌之一[20]，結(jié)合前期耐藥性試驗結(jié)果，該血清型具有多重耐藥性。

綜上所述，通過對36株沙門氏菌進(jìn)行全基因組測序、MLST分型及毒力基因篩查，比較不同來源菌株的基因型及毒力基因分布情況，需要警惕多重耐藥胥伐成格隆沙門菌等對禽肉制品的感染，該菌在我國具有潛在的上升趨勢和被低估的可能。進(jìn)一步推測胥伐成格隆沙門氏菌可能在全球范圍內(nèi)傳播，提示相關(guān)部門需加強(qiáng)進(jìn)口禽肉制品的監(jiān)控力度。考慮本研究涉及的區(qū)域較小、時間尚短，因此建議在我國更大范圍內(nèi)持續(xù)開展相關(guān)監(jiān)測和研究，為我國禽類致病性沙門氏菌的防治提供了一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。