楊玉亮,衣大龍,劉春雨,辛瑜,顧正華,劉懷高,郭自濤*,張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)2(安徽國(guó)肽生物科技有限公司,安徽 宣城,242100)

人體在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基,過(guò)量積累將會(huì)引發(fā)衰老、癌癥、糖尿病、心腦血管疾病等一系列慢性疾病[1-4]。因此,清除自由基對(duì)維持人體健康至關(guān)重要。隨著科技的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們對(duì)于人工合成的抗氧化劑持有懷疑態(tài)度[5],天然抗氧化劑的研究引起了人們的極大興趣[6]。生物活性肽能夠以多種方式發(fā)揮其抗炎、抗氧化等特性,包括清除自由基、抑制活性氧的產(chǎn)生以及抑制促炎細(xì)胞因子的釋放等[7-9]。自然界中存在的膠原蛋白及其衍生肽具有強(qiáng)氧化性、強(qiáng)生物相容性和對(duì)人體無(wú)刺激等特點(diǎn)[10]。已報(bào)道多種來(lái)源的多肽具有抗氧化功能,如羅非魚(yú)皮多肽[11]、低值海洋魚(yú)低聚肽[12]、大豆多肽[13]等。

牦牛主要生活在青藏高原等高海拔地區(qū),是一種罕見(jiàn)的可抗低溫且耐受力超強(qiáng)的物種[14]。極端的生活環(huán)境使牦牛肉產(chǎn)品在蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸等含量上優(yōu)于普通牛肉產(chǎn)品。牦牛骨是牦牛肉類(lèi)加工的副產(chǎn)品,富含礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]。但在牦牛肉加工的過(guò)程中,產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物牦牛骨被丟棄,沒(méi)有得到進(jìn)一步的利用。牦牛骨富含膠原蛋白,其水解物已被證實(shí)具有抗氧化[16-17]、抗高血壓[18]、促成骨細(xì)胞增殖[19]等潛在的生物活性。然而,酶解牦牛骨膠原蛋白制備抗氧化肽時(shí),使用的蛋白酶以堿性蛋白酶為主,這與人體消化系統(tǒng)中的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)在酶解位點(diǎn)上有明顯差異,所形成的多肽也會(huì)顯著不同,且在胃腸消化過(guò)程中消化酶和極端pH條件可能會(huì)影響蛋白或肽的結(jié)構(gòu)及活性[20]。因此,考察胃腸消化對(duì)牦牛骨膠原蛋白肽抗氧化活性的影響對(duì)于牦牛骨合理開(kāi)發(fā)利用具有重要作用。

本文選用一種酶解法制備的牦牛骨膠原蛋白肽,通過(guò)測(cè)定體外模擬胃腸消化前后分子質(zhì)量分布、氨基酸組成,結(jié)合·OH清除能力、Fe2+螯合能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力等抗氧化性特征的分析,綜合評(píng)價(jià)胃腸消化對(duì)于牦牛骨膠原蛋白肽抗氧化能力的影響。本研究可為牦牛骨膠原蛋白肽作為功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛骨膠原蛋白粉,安徽國(guó)肽生物科技有限公司；食品級(jí)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶,諾維信；胃蛋白酶、胰液、17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司；牛膽鹽,國(guó)藥滬試；本實(shí)驗(yàn)所用其他藥劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器,國(guó)華儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì),上海雷磁公司；UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司；酶標(biāo)儀,南京科麟得儀器有限公司；UltiMate3000高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本日立公司；電熱恒溫水槽,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵,上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平,奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牦牛骨膠原蛋白肽的制備流程

將食品級(jí)堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶以2∶2∶0.5的質(zhì)量比例混合,加入牦牛骨膠原粉溶液中進(jìn)行水解。酶/底物(牦牛骨膠原蛋白粉)質(zhì)量比為3∶1 000。水解溫度(55±0.5)℃,水解4 h,95 ℃加熱20 min終止酶反應(yīng),水解結(jié)束。冷卻至室溫,10 000×g離心15 min。收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮后冷凍干燥,-20 ℃保存待進(jìn)一步分析[21]。

1.3.2 體外模擬胃腸消化

根據(jù)產(chǎn)品推薦使用量,配制30 g/L牦牛骨膠原蛋白肽溶液。使用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0,以酶底質(zhì)量比1∶50加入胃蛋白酶。37 ℃水浴搖床,在100 r/min下反應(yīng)1 h。之后,樣品使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.0使胃蛋白酶失活。加入適量胰液[m(胰液)∶m(底物)=1∶25]和牛膽鹽[m(牛膽鹽)∶m(底物)=1∶35]。攪拌均勻后,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～8.0,容器上方充氮?dú)?蓋緊瓶塞后放入37 ℃水浴搖床中,在100 r/min下反應(yīng)2 h。沸水加熱10 min使酶失活。放入-80 ℃冷凍4 h后放入真空冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥[22]。

1.3.3 水解度的測(cè)定

利用甲醛法[23]測(cè)定其水解度,取水解液8 mL,加超純水60 mL。使用NaOH溶液調(diào)pH為8.2,加甲醛10 mL,用0.025 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為9.2,所用NaOH的體積為V1。取8 mL同濃度未酶解的蛋白溶液,按上述方法做空白實(shí)驗(yàn),記錄NaOH的消耗量V0。再用凱氏定氮法測(cè)牦牛骨膠原蛋白肽中的氮含量,按公式(1)計(jì)算樣品的水解度：

(1)

式中：V1,水解液消耗的NaOH體積,mL；V0,空白消化液消耗的NaOH體積,mL；V,總酶解液體積,mL；c,滴定時(shí)所用NaOH濃度,mol/L；14.01,氮的摩爾質(zhì)量,g/mol；m,樣品質(zhì)量,g。

1.3.4 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用Waters液相色譜系統(tǒng)測(cè)定牦牛骨膠原蛋白肽體外模擬消化前后的分子質(zhì)量分布。

色譜條件：色譜柱TSK gel G2000 SWXL 色譜柱；柱溫40 ℃；流動(dòng)相V(0.1%三氟乙酸)∶V(乙腈)=45∶55；等梯度洗脫流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL;波長(zhǎng)214 nm。

標(biāo)品校準(zhǔn)：Gly-Sar(146 Da)；Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)；Bacitracin(1 422 Da)；Aprotinin(6 511 Da)；Cytochrome C(12 327 Da)。建立保留時(shí)間(X)和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(Y)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.5 水解氨基酸含量分析

采用液相色譜法測(cè)定樣品氨基酸的組成。取水解管編號(hào),稱(chēng)取模擬消化前后樣品100.0 mg左右,精確到小數(shù)點(diǎn)后1位,并詳細(xì)記錄稱(chēng)樣質(zhì)量。樣品中加入 8 mL 6 mol/L的HCl溶液(先加入 4 mL搖勻潤(rùn)濕,再加入其余HCl溶液),充氮?dú)? min,調(diào)流速,使溶液呈微沸狀態(tài),擰緊水解管蓋。放入已設(shè)定為 120 ℃的烘箱中,水解 22 h。將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移至具塞試管,加4.8 mL 10 mol/L的NaOH 溶液中和,用蒸餾水定容至 25 mL。雙層濾紙過(guò)濾,取1 mL澄清濾液于 1.5 mL離心管內(nèi),編號(hào),15 345×g離心30 min。取 400 μL上清液于液相樣品瓶,利用OPA柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定氨基酸[24]。

分析條件：色譜柱Agilent Hypersil ODS柱(5 μm,4.0 mm×250 mm)；流動(dòng)相A：V(27.6 mmol/L醋酸鈉)∶V(三乙胺)∶V(四氫呋喃)=500∶0.11∶2.5；流動(dòng)相B：V(80.9 mmol/L醋酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2；流速1 mL/min;洗脫流程：0 min 8%B，17min 50%B，20.1 min 100%B，24.0 min 0%B；柱溫40 ℃；紫外器檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，脯氨酸以波長(zhǎng)262 nm檢測(cè)。

1.3.6 抗氧化能力測(cè)定

1.3.6.1 ·OH清除能力的測(cè)定

用超純水將樣品配制為0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 g/L 的樣品溶液,取1 mL樣品加入300 μL 8 mmol/L FeSO4溶液、250 μL 20 mmol/L H2O2溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸(乙醇溶液),混勻,37 ℃水浴20 min,以6 820×g離心1 min,上清液于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。蒸餾水取代樣品所測(cè)吸光值為A0,甲醇取代H2O2所測(cè)的吸光值為A2,·OH清除能力根據(jù)公式(2)進(jìn)行計(jì)算[25]:

(2)

1.3.6.2 Fe2+離子螯合能力

200 μL質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 g/L的樣品溶液加入2.5 μL 2 mmol/L FeCl2溶液、5 μL 5 mmol/L菲咯嗪反應(yīng)10 min,測(cè)其562 nm波長(zhǎng)處吸光度A1,200 μL的純凈水代替樣品作為空白組吸光度為A0,2.5 μL的純凈水代替FeCl2作為對(duì)照組,其吸光度為A2,根據(jù)公式(3)計(jì)算Fe2+的螯合能力[26]。

(3)

1.3.6.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

采用KETNAWA 等[27]的方法并稍作修改。用超純水將樣品配制為0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 g/L 的樣品溶液。取 38.4 mg ABTS 和 6.623 mg K2S2O8混合,蒸餾水定容至 10 mL 配成ABTS母液。20 ℃避光反應(yīng)12～16 h,用 pH 7.4的PBS稀釋ABTS母液,調(diào)734 nm處吸光值為(0.7 ± 0.2)左右。分別取50 μL樣品溶液與150 μL ABTS母液混合,室溫避光反應(yīng) 6 min,于734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光值A(chǔ)i。以50 μL 蒸餾水代替樣品的反應(yīng)體系為控制組其吸光值為Ac,以 150 μL PBS代替ABTS母液的反應(yīng)體系為樣品空白組其吸光值為Aj,以50 μL蒸餾水和150 μL PBS分別代替樣品和ABTS母液的反應(yīng)體系為空白組其吸光值A(chǔ)b。按公式(4)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力：

ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力/%=

(4)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用獨(dú)立樣本T檢測(cè)進(jìn)行顯著性分析,數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,P<0.05表示顯著差異,P<0.01表示極顯著差異,并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量分布變化

模擬胃腸消化過(guò)程中分子質(zhì)量分布變化如圖1所示。在模擬胃液消化的過(guò)程中,分子質(zhì)量500～1 000 Da的組分變化不明顯,其他分子質(zhì)量組分都發(fā)生明顯變化。其中,分子質(zhì)量>1 000 Da的組分顯著降低,降幅超過(guò)50%,<500 Da的組分顯著升高。以上結(jié)果說(shuō)明,>1 000 Da的組分在胃腸道酶的作用下可被降解成分子質(zhì)量更小的多肽及游離氨基酸。而<1 000 Da 的組分,特別是分子質(zhì)量介于180～1 000 Da的部分能夠抵抗胃腸液的消化。牦牛骨膠原蛋白肽體外模擬胃腸道消化過(guò)程中水解度為1.36%,雖然>1 000 Da的組分有明顯降低,但其含量所占比例較低,因此水解度較低。由以上結(jié)果可知,牦牛骨膠原蛋白肽可以有效抵抗胃腸液的消解作用。

圖1 消化前后分子質(zhì)量分布變化

2.2 體外模擬胃腸消化后樣品氨基酸組成的變化

模擬胃腸消化期間釋放的游離氨基酸和多肽,可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的信息[28],體外模擬胃腸消化前后樣品氨基酸組成的變化如表1所示。

表1 體外模擬胃腸消化前后氨基酸組成的變化

疏水性氨基酸對(duì)多肽的抗氧化性起決定性作用。消化前苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸等疏水性氨基酸占總量的32.30%,消化后占總量的32.90%,消化前后疏水氨基酸含量無(wú)明顯差異。極性氨基酸和非極性氨基酸可通過(guò)協(xié)同作用來(lái)增強(qiáng)牦牛骨膠原蛋白肽抗氧化的能力,且每個(gè)單位極性氨基酸的抗氧能力是非極性氨基酸的1.2倍,每個(gè)單位芳香族氨基酸的抗氧化能力是脂肪族氨基酸的2倍[29]。消化前極性氨基酸與非極性氨基酸分別占氨基酸總量的44.39%和35.47%,消化后分別占42.82%和35.47%；消化前芳香族氨基酸與脂肪氨基酸分別占氨基酸總量的31.88%和54.11%,消化后分別占36.59%和51.92%。消化前后與抗氧化有關(guān)的氨基酸含量均無(wú)明顯變化,表明胃腸消化對(duì)牦牛骨膠原蛋白肽的抗氧化活性可能影響較小,適合營(yíng)養(yǎng)品和保健品等方面的應(yīng)用。

2.3 模擬胃腸消化后產(chǎn)物的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 ·OH清除能力的測(cè)定

·OH清除能力結(jié)果如圖2所示。消化前后牦牛骨膠原蛋白肽的·OH清除能力都隨樣品濃度增加而增強(qiáng),且消化前后的·OH清除能力無(wú)明顯差異。表明牦牛骨膠原蛋白肽中含有抗氧化活性的片段,且胃腸消化對(duì)其·OH清除能力活性影響不明顯。

圖2 模擬消化前后·OH清除能力的對(duì)比

2.3.2 Fe2+螯合能力

Fe2+螯合能力結(jié)果如圖3所示。Fe2+螯合能力是物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo),Fe2+被螯合可防止其被氧化為Fe3+。當(dāng)樣品濃度增加時(shí),消化后樣品的Fe2+螯合能力比消化前增長(zhǎng)快,并在30 g/L時(shí)已達(dá)到92.8%。食物中具有明顯抗氧化性的肽段分子質(zhì)量為0.5 k～1.8 kDa[30]。牦牛骨膠原蛋白肽在體外模擬胃腸消化后大部分以二肽至十肽的結(jié)構(gòu)存在,可有效增強(qiáng)抗氧化速率。因此消化后的Fe2+螯合能力和消化前相比有所提高。

圖3 模擬消化前后Fe2+螯合力的對(duì)比

2.3.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定可應(yīng)用于親脂性和親水性化合物,并且已經(jīng)廣泛用作抗氧化活性測(cè)定。ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力結(jié)果如圖4所示,在樣品濃度增加時(shí),體外模擬胃腸消化后樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力增加速度更快,且在質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),消化前后牦牛骨膠原蛋白肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力趨近100%,可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,多肽鏈上的部分氨基酸被酶解下來(lái)，從而提高了抗氧化能力。

圖4 模擬消化前后ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的對(duì)比

·OH清除能力、Fe2+螯合能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力可作為評(píng)價(jià)牦牛骨膠原蛋白肽抗氧化性的重要指標(biāo)。由以上結(jié)果可知,消化后除·OH清除能力無(wú)明顯差異外,其他抗氧化性均有提高。膠原蛋白肽模擬胃腸消化過(guò)程中需要引入酸堿進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)以模擬胃腸道環(huán)境。但是這個(gè)過(guò)程會(huì)引入大量離子,經(jīng)凍干后進(jìn)入樣品,這些離子的引入可能會(huì)對(duì)后續(xù)抗氧化活性的測(cè)定造成影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中以及后續(xù)結(jié)果分析時(shí)應(yīng)充分考慮離子對(duì)抗氧化活性的影響。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,采用了HCl與NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié),引入的離子為Cl-和Na+,推測(cè)可能對(duì)抗氧化活性影響不明顯。綜上所述,嚴(yán)苛的胃腸消化環(huán)境不能破壞牦牛骨膠原蛋白中的抗氧化性功能肽。另外,由于分子質(zhì)量變小,更有利于牦牛骨膠原蛋白肽穿過(guò)小腸壁被人體所吸收,因此消化后的牦牛骨膠原蛋白肽更能充分發(fā)揮其生物效應(yīng)。

3 結(jié)論

該牦牛骨膠原蛋白肽經(jīng)體外模擬胃腸消化后,抗氧化活性并未降低。消化后除·OH清除能力無(wú)明顯變化外,其他抗氧化性均有提高。此現(xiàn)象可能是因?yàn)榉肿淤|(zhì)量>1 000 Da的多肽大部分被模擬胃腸液中蛋白酶水解為小分子肽及游離氨基酸;這些游離氨基酸及小分子肽能夠增強(qiáng)抗氧化活性及速率。除此之外,小分子多肽更容易被小腸吸收,更有利于牦牛骨膠原蛋白肽在體內(nèi)發(fā)揮其抗氧化活性。因此該牦牛骨膠原蛋白肽產(chǎn)品適合應(yīng)用于抗氧化保健品及營(yíng)養(yǎng)品的開(kāi)發(fā)。