李穎,李保玲,范鑫,白雪,黃峻榕,曹云剛

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安,710021)

法蘭克福香腸和博洛尼亞香腸等乳化類肉制品因質(zhì)地細(xì)膩、汁液豐富、口味獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)深受世界各地消費(fèi)者的喜愛(ài),在這種乳化性肉制品中,脂肪球或油滴被包裹并嵌入了蛋白質(zhì)基質(zhì)中從而形成了不均勻的復(fù)合結(jié)構(gòu)[1-3]。盡管有肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白的存在,肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)作為肌肉蛋白中含量最高的組分,在包裹脂肪微粒和小油滴的乳液界面蛋白膜的形成及熱誘導(dǎo)蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成過(guò)程中起著重要作用,因而在很大程度上決定了乳化肉制品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等性質(zhì)[4-5]。

乳化類肉制品的脂肪含量可高達(dá)20%～30%,在加工和貯存過(guò)程中,由于脂肪和蛋白質(zhì)的共存,脂肪氧化和蛋白氧化很可能是相互關(guān)聯(lián)的。已有研究表明,脂質(zhì)過(guò)氧化氫、脂質(zhì)自由基及其衍生的活性醛類物質(zhì)均可誘導(dǎo)蛋白氧化,且蛋白本身也極易發(fā)生氧化反應(yīng),進(jìn)而對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性造成影響[15-17]。然而關(guān)于氧化脂質(zhì)對(duì)MP乳化性能影響的研究非常有限,脂肪酶催化的不飽和脂肪酸氧化可以產(chǎn)生氧化脂質(zhì),前期的研究揭示了亞油酸誘導(dǎo)的氧化修飾對(duì)豬MP的理化性質(zhì)和膠凝性能的影響,本研究的目的是評(píng)價(jià)亞油酸氧化對(duì)MP乳化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬外脊肉(Longissimuslumborum)、金龍魚(yú)大豆油,當(dāng)?shù)爻?陜西西安)購(gòu)買；大豆脂肪氧合酶、水溶性維生素E(trolox),美國(guó)Sigma-Aldrich公司；亞油酸(>95%),上海阿拉丁化學(xué)有限公司；其他試劑至少為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司；高剪切分散乳化機(jī),上海弗魯克(FLUKO)科技發(fā)展有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀,英國(guó)Malvern Instruments有限公司；Haake-Mars 60 流變儀、DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀,德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；安東帕LitesizerTM500納米粒度及Zeta電位分析儀,奧地利Anton Paar公司；DM2500M顯微鏡,德國(guó)Leica公司。

1.3 MP的提取及樣品制備

1.3.1 MP 的提取及氧化處理

MP的提取參照PARK等[17]的方法進(jìn)行,使用雙縮脲法以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,將所得MP置于碎冰浴4 ℃保存并在48 h內(nèi)使用。用含0.4 mol/L NaCl的25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)將MP稀釋至45 mg/mL,將MP溶液分散于脂肪氧化體系(含0.5～10.0 mmol/L亞油酸,3 750 U/mL脂肪氧合酶)使MP質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/mL并于4 ℃反應(yīng)12 h。通過(guò)添加終濃度為1 mmol/L的trolox來(lái)終止氧化反應(yīng),未添加氧化體系的MP溶液為空白對(duì)照。

1.3.2 MP 乳液的制備

采用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將氧化處理后的蛋白溶液分別稀釋至1、10、30 mg/mL。向稀釋后的MP溶液中加入20%(體積分?jǐn)?shù))純大豆油,混合液使用高剪切分散乳化機(jī)在13 000 r/min下乳化2.5 min,從而得到新鮮的MP乳液。除去測(cè)定蛋白乳液流變性能(30 mg/mL)以及蛋白乳化活性、乳化穩(wěn)定性(1 mg/mL)外,其余蛋白乳化性能測(cè)定如粒度等均使用質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白。

1.4 乳化活性(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index,ESI)的測(cè)定

根據(jù)KEVIN等[18]提出的比濁法并略做改動(dòng)測(cè)定MP乳液的EAI和ESI。按1.3.2乳液的制備方法制得新鮮乳液,立即從距離瓶底0.5 cm處取100 μL乳液置于試管中,而后加入5 mL 1 mg/mL SDS溶液,混勻后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在500 nm處的吸光度,10 min后再次于相同部位取樣重復(fù)測(cè)定,以1 mg/mL SDS溶液在500 nm處的吸光度作為空白對(duì)照。EAI和ESI的計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A0,A10分別為蛋白乳液在0、10 min時(shí)于 500 nm處的吸光值；φ為油相體積分?jǐn)?shù)；ρ為乳化前蛋白質(zhì)溶液中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度,g/mL；N為稀釋倍數(shù)。

1.5 MP乳液的粒度測(cè)定

采用靜態(tài)光散射法對(duì)蛋白乳液樣品的平均粒徑進(jìn)行了分析。測(cè)量時(shí)以蒸餾水作為分散介質(zhì),分散劑折射率為1.330,乳液的粒徑分布結(jié)果由平均粒徑(d3,2和d4,3)表示,重復(fù)測(cè)定3次取其平均值。

1.6 MP乳液的Zeta電位測(cè)定

制得的新鮮蛋白乳液用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)按體積比1∶100進(jìn)行稀釋。取1 mL稀釋后的乳液置于微量樣品池中,平衡時(shí)間設(shè)定60 s,測(cè)試溫度為25 ℃,多次測(cè)定取其平均值。

1.7 MP乳液的界面蛋白含量測(cè)定

參照CHANYONGVORAKUL等[19]所描述的方法略做修改測(cè)定界面吸附蛋白含量。新鮮乳狀液在11 000×g下離心35 min,將乳脂和乳清相分離,使用濾膜過(guò)濾乳清相。以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白來(lái)計(jì)算乳清相蛋白的質(zhì)量濃度。界面吸附蛋白含量計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：ρ0和ρ1分別代表初始蛋白乳狀液以及乳清相中的蛋白濃度。

1.8 MP乳液的流變學(xué)特性

采用Haake-Mars 60流變儀在25 ℃下對(duì)MP乳液的流變特性進(jìn)行了表征。平行板(直徑35 mm)間距設(shè)定為1 mm,在0.1～300 s-1的剪切速率范圍內(nèi),測(cè)定乳液的穩(wěn)態(tài)剪切流變特性,并對(duì)乳液的剪切速率和表觀黏度之間的關(guān)系進(jìn)行表征。通過(guò)頻率掃描測(cè)定乳液的動(dòng)態(tài)黏彈特性：頻率范圍為0.1～10 Hz,應(yīng)變?yōu)?.5%(處于線性黏彈區(qū)間),記錄儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.9 MP乳液的微觀結(jié)構(gòu)表征

使用萊卡DM2500M光學(xué)顯微鏡觀察MP乳液的微觀結(jié)構(gòu),取適量新鮮乳液樣品制備玻片標(biāo)本,在室溫下于40×物鏡下進(jìn)行觀察。MP乳液樣品的圖像用顯微鏡上附帶的相機(jī)進(jìn)行記錄和分析。

1.10 MP乳液的疏水相互作用和氫鍵作用表征

新鮮的蛋白乳液使用DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀和DXR 785 nm激光光源進(jìn)行光譜測(cè)定。高功率(35 mW)激光通過(guò)顯微鏡10×/0.25 BD定向聚焦于MP乳液,光譜的獲取條件設(shè)定為：收集曝光時(shí)間30 s；孔徑50 μm；光斑直徑為3.1 μm；分辨率4.7～8.7 cm-1。數(shù)據(jù)由OMNIC軟件收集后使用LabSpec對(duì)所得光譜進(jìn)行平滑、基線校正并使用1 003 cm-1處的苯丙氨酸帶進(jìn)行歸一化處理,記錄760 cm-1處的歸一化強(qiáng)度和830、850 cm-1的相對(duì)強(qiáng)度比。

1.11 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2～3次,數(shù)據(jù)使用Statistix 9.0分析軟件通用線性模型進(jìn)行方差分析,采用LSD全配對(duì)多重比較方法進(jìn)行顯著性分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。使用Sigma Plot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化MP乳液的EAI和ESI分析

脂肪氧化體系中亞油酸濃度對(duì)MP乳液EAI和ESI的影響如圖1所示。與未氧化MP樣品相比,當(dāng)亞油酸濃度低于1.0 mmol/L時(shí),氧化MP乳液的EAI和ESI值隨亞油酸濃度的增加而增大,而亞油酸濃度的進(jìn)一步增加(3.0～10.0 mmol/L)則會(huì)導(dǎo)致樣品EAI和ESI值的顯著降低(P<0.05)。低濃度氧化亞油酸誘導(dǎo)MP構(gòu)象發(fā)生變化,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分解折疊從而暴露出更多的疏水基團(tuán),因此MP在形成乳液過(guò)程中能更好地吸附在水油界面上,從而有效提升了MP乳液的EAI和ESI[20]。過(guò)度氧化情況下蛋白共價(jià)交聯(lián)形成不溶性的蛋白聚集體,蛋白分子柔韌性降低、蛋白分子間的靜電相互作用以及乳狀液界面—水相互作用減弱,乳液體系難以形成穩(wěn)定的界面膜,蛋白與脂肪間的交聯(lián)能力降低,導(dǎo)致乳狀液分層加快,乳化活性和乳化穩(wěn)定性不斷降低[21]。在羥自由基氧化體系中,李艷青等[21]研究發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度的增加,鯉魚(yú)MP的EAI和ESI不斷降低；在脂肪氧化體系中,王丹丹等[22]研究發(fā)現(xiàn),適量添加氧化亞油酸(<4.5 mmol/L)時(shí),核桃分離蛋白樣品的EAI和ESI有明顯改善,而過(guò)量添加時(shí)EAI值顯著下降、ESI變化則不明顯。猜測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性與氧化劑種類以及蛋白種類的差異等因素有關(guān)。

圖1 亞油酸添加量對(duì)MP乳液EAI及ESI的影響

2.2 氧化MP乳液的粒度分析

MP乳液的粒徑變化如圖2所示,乳液的平均粒徑通常用來(lái)反映蛋白質(zhì)的乳化能力,包括液滴的形成與穩(wěn)定過(guò)程。相關(guān)研究表明乳液的EAI、ESI與乳液的平均粒徑d3,2和d4,3有關(guān)：一定程度上乳液平均粒徑越小,樣品乳化性能越好[23]。未氧化MP樣品的d3,2和d4,3值分別為29.14和48.32 μm,亞油酸濃度為1.0 mmol/L時(shí),乳液的d3,2和d4,3分別下降為27.01和45.86 μm,而后隨著亞油酸濃度從1.0 mmol/L增加到3.0 mmol/L,MP乳液的平均粒徑(d3,2和d4,3)顯著增大(P<0.05),這也與MP樣品EAI和ESI的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。類似研究表明輕度氧化降低了乳液的平均粒徑(d3,2和d4,3),而嚴(yán)重氧化增大了過(guò)氧化氫自由基生成體系的平均粒徑[24]。有趣的是本實(shí)驗(yàn)中亞油酸濃度為10.0 mmol/L時(shí),氧化MP乳液的平均粒徑反而低于亞油酸濃度為3.0 mmol/L時(shí)的MP樣品,葉鳳凌等[25]在研究2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH)熱解產(chǎn)生的烷過(guò)氧自由基濃度對(duì)兔肉MP粒徑影響時(shí)得到類似結(jié)果,可能是AAPH濃度過(guò)高(10.0 mmol/L)導(dǎo)致MP被過(guò)度氧化、肽鍵斷裂從而降低了MP樣品的粒徑。

圖2 亞油酸添加量對(duì)MP乳液平均粒徑的影響

2.3 氧化MP乳液的Zeta電位分析

乳液的Zeta電位是反映乳液體系潛在穩(wěn)定性的重要指標(biāo),相關(guān)研究表明乳液的絮凝、沉淀主要與界面層上的靜電作用力有關(guān),乳液液滴間的靜電作用力越強(qiáng)則乳液體系的穩(wěn)定性越好[26]。Zeta電位的變化主要由氧化誘導(dǎo)的氨基酸側(cè)鏈的修飾和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化引起[24]。如圖3所示,所有MP乳液樣品的Zeta電位均為負(fù)值,推測(cè)是因?yàn)镸P乳液的pH值(pH 6.2)高于其等電點(diǎn)(pH 5.3)。與MP乳液EAI、ESI結(jié)果相似,當(dāng)亞油酸濃度低于1.0 mmol/L時(shí),隨著亞油酸濃度的增加,Zeta電位的絕對(duì)值顯著增大(P<0.05),當(dāng)亞油酸濃度繼續(xù)增加時(shí)(3.0～10.0 mmol/L),Zeta電位的絕對(duì)值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與未氧化MP乳液相比,亞油酸濃度為10.0 mmol/L時(shí),Zeta電位絕對(duì)值下降了27.8%。這一結(jié)果表明在輕度氧化條件下,蛋白結(jié)構(gòu)適度展開(kāi)暴露出更多電荷的結(jié)合位點(diǎn),從而增強(qiáng)了乳液間的靜電排斥力,起到穩(wěn)定乳液、減少液滴聚集的作用[27-28],而過(guò)度氧化則相反。

圖3 亞油酸添加量對(duì)MP乳液Zeta電位的影響

2.4 氧化MP乳液的界面吸附蛋白含量

乳液的界面吸附蛋白含量可以作為評(píng)價(jià)乳液穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖4所示,與未氧化MP樣品相比,界面吸附蛋白含量隨著亞油酸濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì),并在亞油酸濃度為1.0 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值,這一結(jié)果與ZHOU等[29]的研究結(jié)果相似。輕度氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi),促進(jìn)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露、蛋白柔性增加,同時(shí)由于蛋白質(zhì)分子間相互作用力的改變,使得更多的蛋白質(zhì)吸附在乳狀液表面,引起乳液的平均粒徑減小(圖2)、蛋白質(zhì)間的靜電斥力增強(qiáng)(圖3)。而過(guò)度氧化情況下,蛋白與蛋白之間形成過(guò)量的強(qiáng)共價(jià)鍵,使得蛋白難以附著到乳液界面或易于從乳液界面脫離,界面蛋白吸附量減少、乳液穩(wěn)定性降低[30]。

圖4 亞油酸添加量對(duì)MP乳液界面蛋白吸附含量的影響

2.5 氧化MP乳液的流變學(xué)特性

乳液的流變學(xué)性能也與乳液體系穩(wěn)定性息息相關(guān),乳液的表觀黏度隨剪切速率的變化關(guān)系如圖5-a所示,所有的乳液均表現(xiàn)出明顯的剪切稀化的非牛頓流體特性,乳狀液的表觀黏度隨著剪切速率從0～300 s-1的增加而逐步減小。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可知這一結(jié)果主要是由脂肪球的絮凝作用引起[31]。值得注意的是,在任何剪切速率下未被氧化MP乳液均表現(xiàn)出較低的表觀黏度,而氧化MP乳液的表觀黏度隨亞油酸濃度的增加而增加(0.5～1.0 mmol/L),隨著亞油酸濃度的進(jìn)一步增加(1.0～10.0 mmol/L)而降低。較大的乳狀液表觀黏度可以減緩乳化液液滴的遷移和碰撞,減少液滴聚集,從而提高乳液體系穩(wěn)定性,這一結(jié)果與上述乳液的乳化穩(wěn)定性和Zeta電位的結(jié)果是一致的(圖1、圖3)。

圖5 亞油酸添加量對(duì)MP乳液流變性能的影響

MP乳液的G′和G″隨頻率的變化曲線如圖5-b所示,在測(cè)試的線性黏彈范圍內(nèi),所有樣品乳液的G′值都高于G″值,說(shuō)明其內(nèi)部存在弱凝膠狀結(jié)構(gòu),從而保證了乳液的穩(wěn)定性[32]。隨著振蕩頻率的增加,不同乳液的G′和G″都在逐漸增加,這一點(diǎn)在其他凝膠狀乳液中已有報(bào)道[31,33]。其中G′值的增加最有可能是由液滴與蛋白質(zhì)間的相互作用引起[34]。亞油酸濃度為1.0 mmol/L乳液的G′和G″值在所有乳液中最高,說(shuō)明輕度氧化增強(qiáng)了脂肪和蛋白質(zhì)之間的一些非共價(jià)相互作用,從而增強(qiáng)了乳液的彈性性能和穩(wěn)定性。

2.6 MP乳液的微觀結(jié)構(gòu)

如圖6所示,未氧化MP和不同氧化程度MP樣品制備的乳狀液微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異。結(jié)合圖2乳狀液的粒徑變化發(fā)現(xiàn),與未氧化MP乳液相比,隨著亞油酸濃度的增加(0.5～10.0 mmol/L),乳狀液顆粒呈現(xiàn)先減小后增大的變化趨勢(shì)(圖6-a～圖6-e),亞油酸濃度為1.0 mmol/L時(shí),MP乳液的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化：乳化液的顆粒明顯變小,同時(shí)分布也更加的均勻,結(jié)合以上EAI、ESI、粒徑、Zeta電位等乳化性質(zhì)的結(jié)果,可以認(rèn)為蛋白質(zhì)氧化程度影響了乳液中蛋白質(zhì)和脂滴的吸附和分布。王丹丹等[22]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化會(huì)影響蛋白的表面疏水性及其微觀結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致蛋白表面活性、蛋白質(zhì)分子的柔韌性和電荷的變化,而上述變化最終影響了蛋白質(zhì)的乳化性能。

a-對(duì)照;b-0.5 mmol/L亞油酸;c-1.0 mmol/L亞油酸;d-3.0 mmol/L亞油酸;e-10.0 mmol/L亞油酸

2.7 MP乳液的疏水相互作用及氫鍵作用

乳液的色氨酸殘基(I760/I1003)和酪氨酸雙重態(tài)(I850/I830)的拉曼強(qiáng)度如表1所示,MP乳液接近760 cm-1處的歸一化強(qiáng)度提供了關(guān)于蛋白質(zhì)乳液疏水相互作用的信息[35]。結(jié)果表明,與未氧化MP樣品相比,亞油酸濃度增加到1.0 mmol/L時(shí),樣品的歸一化強(qiáng)度(I760/I1003)顯著增加(P<0.05),而隨亞油酸濃度的進(jìn)一步增加(3.0～10.0 mmol/L),I760/I1003值未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。先前研究表明,拉曼條帶歸一化強(qiáng)度(I760/I1003)的增加意味著埋藏的色氨酸殘基暴露在極性溶液中,從而增強(qiáng)了乳液的疏水相互作用[36]。

表1 亞油酸添加量對(duì)MP乳液的疏水相互作用及氫鍵作用的影響

酪氨酸雙重態(tài)的比值(I850/I830)可以監(jiān)測(cè)MP乳液的酪氨酸殘基微環(huán)境的變化[37]。結(jié)果表明,與未氧化MP樣品相比,隨著亞油酸濃度從0.5 mmol/L增加到1.0 mmol/L,酪氨酸雙重態(tài)比值(I850/I830)無(wú)明顯變化(P>0.05),而當(dāng)亞油酸濃度由1.0 mmol/L增大到10.0 mmol/L時(shí),酪氨酸雙重態(tài)比值顯著降低(P<0.05)。酪氨酸雙重態(tài)比值(I850/I830)為1.29～1.41,說(shuō)明酪氨酸殘基(—OH)主要暴露在水環(huán)境中與水形成中、弱氫鍵。色氨酸殘基(I760/I1003)和酪氨酸雙重態(tài)比值(I850/I830)的結(jié)果表明,輕度氧化增強(qiáng)了MP乳液的疏水相互作用和氫鍵作用,這可能是輕度氧化條件下乳液體系黏彈性及穩(wěn)定性提高的內(nèi)在原因。

3 結(jié)論

不同氧化程度對(duì)豬肌原纖維蛋白乳化性能的影響具有顯著差異。適度氧化導(dǎo)致乳液平均粒徑下降(d3,2和d4,3)、Zeta電位絕對(duì)值增加、表觀黏度增強(qiáng)、G′和G″以及AP%增加,在一定程度上提高了MP的EAI和ESI；但過(guò)度氧化則會(huì)嚴(yán)重破壞MP的乳化性能。因此,在肉制品加工和原料肉貯存過(guò)程中要合理控制氧化程度,以提高原料肉的加工性能、改善肉制品的品質(zhì)。