伍清芳,王敏,陳鴻平,陳林,胡媛,劉友平

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都,611137)

薏苡仁來源于禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf)的干燥成熟種仁,屬于我國(guó)常見的傳統(tǒng)食品,也是衛(wèi)計(jì)委公布的101種藥食同源類中藥材之一,具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)的功效[1],在治療水腫、扁平疣及肝癌等疾病中均具有較好療效[2-6],具有非常高的食用及藥用價(jià)值,是各種藥品、食品、保健品開發(fā)的熱點(diǎn)對(duì)象之一。現(xiàn)代研究表明,薏苡仁除了含有脂肪酸、多糖、黃酮、三萜、生物堿等成分外[7],還含有多類氨基酸成分[8-9]。

氨基酸作為構(gòu)成生命物質(zhì)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)和人體中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分,可用其作為衡量薏苡仁品質(zhì)的指標(biāo)性成分。目前,越來越多的學(xué)者采用柱前衍生化HPLC[10-19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)[20-24]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(liquid chromatograph fluorescent detection,LC-FLD)[25]等方法分析鹿茸片、玉米等多種物質(zhì)中的氨基酸成分,檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和高效。本研究采用異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)對(duì)薏苡仁氨基酸進(jìn)行柱前衍生化,即在堿性條件下,氨基酸成分與PITC相結(jié)合生成具有紫外吸收的化合物,利用HPLC對(duì)其進(jìn)行氨基酸組成分析和含量測(cè)定,以期為薏苡仁在食品、藥品及保健品方面的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天冬氨酸(Asp,批號(hào)CHB170224)、L-谷氨酸(Glu,批號(hào)CHB180617)、L-天冬酰胺(Asn,批號(hào)CHB190213)、L-絲氨酸(Ser,批號(hào)CHB170221)、L-組氨酸(His,批號(hào)CHB181129)、L-精氨酸(Arg,批號(hào)CHB190120)、L-蘇氨酸(Thr,批號(hào)CHB190215)、L-α-丙氨酸(Ala,批號(hào)CHB180307)、L-脯氨酸(Pro,批號(hào)CHB180904)、L-酪氨酸(Tyr,批號(hào)CHB190110)、L-纈氨酸(Val,批號(hào)CHB180313)、L-甲硫氨酸(Met,批號(hào)CHB180227)、L-胱氨酸(Cys,批號(hào)CHB180410)、L-異亮氨酸(Ile,批號(hào)CHB170921)、L-亮氨酸(Leu,批號(hào)CHB170712)、L-苯丙氨酸(Phe,批號(hào)CHB170414)、L-賴氨酸(Lys,批號(hào)CHB180111),對(duì)照品純度均大于98%,成都克洛瑪生物科技有限公司；三乙胺溶液、PITC試劑、正己烷溶液皆為實(shí)驗(yàn)用分析純,乙腈為色譜純。16批薏苡仁樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)鑄云教授鑒定均為禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁,見表1。

表1 薏苡仁樣品信息

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國(guó))有限公司；SQP萬分之一天平,賽多利斯儀器(北京)有限公司；B25-12D超聲波清洗儀,寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；DHS16-A多功能紅外水份儀,上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DHG—9245電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-1恒溫水浴鍋,國(guó)華電器有限公司；DY-3型電動(dòng)熔封機(jī),長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取適量氨基酸對(duì)照品,加入10 mL容量瓶?jī)?nèi),精密稱定,加入0.1 mol/L HCl溶液,溶解定容,制備成各氨基酸濃度范圍為58.0～399 μg/mL的混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱定薏苡仁樣品粉末0.2 g,置于可熔封安瓿瓶中,精密加入6 mol/L HCl溶液5 mL,然后熔封,150 ℃烘箱中加熱反應(yīng)1 h,取出置冷卻,轉(zhuǎn)移至5 mL EP管,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液至安瓿瓶,水浴蒸干,待冷卻至常溫,加入0.1 mol/L HCl溶液,使其充分溶解后,將溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中定容,即得薏苡仁供試品溶液。

1.3.3 衍生化

精密移取混合氨基酸對(duì)照品稀釋溶液、薏苡仁供試品溶液和400 μL 0.1 mol/L HCl溶液至EP管,依次加入200 μL新鮮配制的1 mol/L三乙胺-乙腈溶液和200 μL新鮮配制的0.1 mol/L PITC-乙腈溶液,振蕩混勻,避光1 h,再加入600 μL正己烷溶液,振蕩混勻,靜置10 min,取200 μL下層清液,加入800 μL超純水進(jìn)行稀釋,渦旋混勻,用0.22 μm 微孔濾膜過濾,置于進(jìn)樣瓶中,得到空白、對(duì)照品、薏苡仁供試品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱采用SVEA C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液,流動(dòng)相B：0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈(6∶94體積比),梯度洗脫：0～4 min,0%A；4～6 min,0%～6%A；6～16 min,7%A；16～20 min,7%～12%A；20～40 min,12%～25%A；40～49 min,25%～35%A；49～55 min,35%～100%A；55～60 min,100%A；60～65 min,100%～0%A。流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,柱溫38 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。按上述條件操作,對(duì)照品及供試品中17種氨基酸的色譜峰分離效果良好,見圖1。

1-Asp；2-Glu；3-Asn；4-Ser；5-His；6-Arg；7-Thr；8-Ala；9-Pro；10-Tyr；11-Val；12-Met；13-Cys；14-Ile；15-Leu；16-Phe；17-Lys

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析及聚類分析

根據(jù)表5的回歸方程可計(jì)算得到薏苡仁樣品17種氨基酸含量,見表2。可得各產(chǎn)地薏苡仁總氨基酸含量為122.6～274.0 μg/g,共檢測(cè)到17種氨基酸,含7種人體必需氨基酸,以異亮氨酸、酪氨酸含量較高,以貴州省興仁縣產(chǎn)的薏苡仁總氨基酸含量最高。

為了進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地薏苡仁中的17種氨基酸成分差異,評(píng)價(jià)其質(zhì)量,采用軟件SPSS 26.0對(duì)薏苡仁氨基酸含量進(jìn)行了主成分分析和系統(tǒng)聚類分析。由相關(guān)矩陣特征值的計(jì)算結(jié)果可知,前3個(gè)主成分(天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率高達(dá)85.06%(表3),鑒于此結(jié)果選取了前3個(gè)主成分對(duì)薏苡仁品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià),見表4。

表4 因子載荷矩陣

用特征值和各因子載荷矩陣對(duì)各氨基酸得分系數(shù)進(jìn)行計(jì)算,可以進(jìn)一步得到PC1、PC2、PC3和綜合得分Y方程式如下:

PC1=0.058X1+0.071X2+0.083X3+0.065X4+0.051X5+0.054X6+0.093X7+0.07X8+0.078X9+0.084X10+0.094X11+0.09X12+0.078X13+0.073X14+0.089X15+0.096X16+0.038X17

PC2=-0.077X1-0.171X2-0.134X3+0.027X4-0.02X5-0.202X6+0.07X7+0.211X8+0.175X9-0.122X10-0.015X11-0.096X12+0.175X13-0.161X14+0.1X15+0.053X16+0.191X17

PC3=0.22X1+0.101X2+0.045X3+0.398X4-0.325X5+0.146X6+0.097X7+0.001X8-0.099X9-0.04X10-0.131X11+0.036X12-0.099X13-0.2X14-0.141X15-0.074X16+0.327X17

Y=0.594 8PC1+0.192 8PC2+0.060 1PC3

X1～X17分別為各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)化值。利用上述公式計(jì)算各產(chǎn)地薏苡仁氨基酸主成分綜合得分,值越高,表明薏苡仁氨基酸質(zhì)量越佳,按照結(jié)果進(jìn)行排序,可得到貴州興仁縣產(chǎn)的薏苡仁氨基酸質(zhì)量最佳,見表2,根據(jù)主成分得分繪制的三維圖見圖2。

圖2 主成分得分三維圖

由系統(tǒng)聚類結(jié)果得到16個(gè)產(chǎn)地薏苡仁樣品被聚為5類,黑龍江綏化市、吉林省吉林市、廣東省東莞市、廣東省蒲城市、云南省鹽津縣、湖北省湘潭市、湖北省黃岡市、河北省滄州市、內(nèi)蒙古通遼市、貴州省青山市產(chǎn)薏苡仁為第1類,緬甸產(chǎn)薏苡仁為第2類,福建省龍巖市、江西省樟樹市、云南省勐臘縣產(chǎn)薏苡仁為第3類,海南省海口市產(chǎn)薏苡仁和貴州省興仁縣產(chǎn)薏苡仁分別為第4類和第5類,見圖3。

圖3 系統(tǒng)聚類分析圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

精密量取氨基酸混合對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L HCl溶液稀釋定容,即得不同梯度濃度的氨基酸混合對(duì)照品溶液,按1.3.3的方法進(jìn)行衍生并測(cè)定,以濃度(x,mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(y,mAU)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用的17種氨基酸在限定濃度范圍內(nèi)均有良好線性關(guān)系,見表5。

表5 十七種氨基酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.2 精密度試驗(yàn)

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液按一定比例稀釋,取稀釋液適量,遵循1.3.2的方法制備供試品溶液,計(jì)算可得17種氨基酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.26%～3.42%,本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品S1制備供試品溶液,分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算得到不同時(shí)間點(diǎn)17種氨基酸對(duì)應(yīng)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.72%～3.36%,樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定6份質(zhì)量相等的樣品S1,制備供試品溶液,由計(jì)算結(jié)果可得各氨基酸含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.63%～3.81%,可知該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取6份濃度確定的S1水解液樣品各200 μL,分別加入稀釋后的混合對(duì)照品溶液,并制備供試品溶液,得到氨基酸含量、計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,計(jì)算可得17種氨基酸的平均加樣回收率為97%～101%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%～4.86%。

3 結(jié)論與討論

本研究表明藥食兩用薏苡仁中含有豐富的氨基酸成分,共檢測(cè)得到17種氨基酸,包括7種人體必需氨基酸，為賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及蘇氨酸,其中以異亮氨酸含量為最高。其余10種人體非必需氨基酸中,酪氨酸含量最高。李恃圻等[8]、樂巍等[9]采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)薏苡仁氨基酸得到的氨基酸種類與本研究結(jié)果大致相似,部分氨基酸含量略有差異,推測(cè)可能是薏苡仁的品種、采收期、貯藏條件等因素差異導(dǎo)致。

本研究建立了PITC柱前衍生化HPLC檢測(cè)薏苡仁中氨基酸含量的方法,方法簡(jiǎn)單實(shí)用,能準(zhǔn)確檢測(cè)薏苡仁中17種氨基酸的含量,為薏苡仁中氨基酸含量測(cè)定及薏苡仁質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新方法。同時(shí),對(duì)貴州、云南和福建等16個(gè)產(chǎn)地的薏苡仁中氨基酸含量進(jìn)行了主成分分析,得到不同產(chǎn)地薏苡仁氨基酸含量有一定差異,以貴州省興仁縣產(chǎn)薏苡仁中總氨基酸含量最高,表明薏苡仁質(zhì)量與產(chǎn)地存在一定相關(guān)性。可針對(duì)產(chǎn)地對(duì)薏苡仁綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)行研究,為薏苡仁種植基地的選擇和發(fā)展提供新的思路。