呂志勇，董 方，宋文琪，甄景慧，周 為，楊 溪

流感嗜血桿菌為革蘭陰性短小桿菌，能寄居并侵犯人體上呼吸道黏膜，是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要致病菌。該菌主要引起兒童呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管炎、扁桃體炎、肺炎等，也可引起關(guān)節(jié)炎、菌血癥和腦膜炎等侵襲性疾病，嚴(yán)重影響患兒的健康[1]。研究表明，5歲以下急性上呼吸道感染的患兒鼻咽部流感嗜血桿菌攜帶率高達(dá)26.3%[2]。近年來隨著抗菌藥物的廣泛使用，流感嗜血桿菌的耐藥率也在逐年上升，給臨床治療帶來了挑戰(zhàn)。了解流感嗜血桿菌臨床分布特點(diǎn)及其耐藥情況，對(duì)于臨床合理選用抗菌藥物，提高治療效果具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌來源 收集2015年1月1日—2019年12月31日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院門急診和住院患兒分離流感嗜血桿菌菌株，剔除同一患者、同一部位重復(fù)分離菌株，共收集3 026株流感嗜血桿菌。

從無菌部位分離到的流感嗜血桿菌的感染為侵襲性流感嗜血桿菌感染；從非無菌部位分離到的流感嗜血桿菌的感染為非侵襲性流感嗜血桿菌感染。

1.1.2 試劑與儀器 巧克力平板購自鄭州安圖生物工程有限公司，HTM藥敏平板為實(shí)驗(yàn)室自制（瓊脂培養(yǎng)基HTM和營養(yǎng)補(bǔ)充劑SRO158E）；抗菌藥物紙片、Ⅴ+Ⅹ因子紙片、Ⅹ因子紙片、Ⅴ因子紙片頭孢硝噻吩試劑、HTM干粉以及SRO158E均購自英國OXOID公司。VITEK質(zhì)譜儀及BACTEX FX血培養(yǎng)儀分別為法國梅里埃和美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.3 質(zhì)控菌株 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC 49247，流感嗜血桿菌質(zhì)譜鑒定質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng) 按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行操作，將痰液、呼吸道分泌物、陰道分泌物等臨床標(biāo)本接種于巧克力平板，37℃、5%CO2孵育18～24 h。血液注入血培養(yǎng)瓶，放入BD BACTEC FX血培養(yǎng)儀培養(yǎng)，如報(bào)警陽性再轉(zhuǎn)種巧克力平板，37℃、5%CO2孵育18～24 h。

1.2.2 菌種鑒定及藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中嗜血桿菌屬鑒定要點(diǎn)[3]，根據(jù)典型菌落形態(tài)做“衛(wèi)星現(xiàn)象”試驗(yàn)，采用Ⅴ+Ⅹ、Ⅹ、Ⅴ因子生長需求試驗(yàn)輔助鑒定進(jìn)行初篩，對(duì)初篩陽性菌株采用VITEK質(zhì)譜儀進(jìn)行確認(rèn)。使用紙片擴(kuò)散法（K-B）進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，按照2019年CLSI M100標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判讀[4]。

1.2.3 β內(nèi)酰胺酶測(cè)定 采用頭孢硝噻吩紙片法進(jìn)行定性檢測(cè)，出現(xiàn)紅色為陽性，即產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶；1 h后無顏色改變?yōu)殛幮裕醇?xì)菌不產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2.1.1 患兒的基線情況 2015—2019年共分離3 026株非重復(fù)流感嗜血桿菌，其中1 241株（41.0%）分離自男性患兒，1 785株（59.0%）分離自女性患兒。分離自嬰兒期（0～1歲）患兒1 195株（39.5%），幼兒期（＞1～3歲）1 262株（41.7%），學(xué)齡前期（＞3～6歲）372株（12.3%），學(xué)齡期（＞6歲）197株（6.5%）。見表1。

2.1.2 門急診和住院患兒分離的菌株 流感嗜血桿菌源自門急診1 267株（41.9%）；分離自住院患兒1 759株（58.1%），其中ICU患兒分離153株，非ICU患兒分離1 606株。見表1。

2.1.3 標(biāo)本來源 標(biāo)本主要來自痰液（1 363株，45.0%）、陰道分泌物（1 051株，34.7%）、支氣管灌洗液（339株，11.2%）、呼吸道分泌物（159株，5.3%）、支氣管肺泡灌洗液（55株，1.8%）、耳分泌物（24株，0.8%）、膿液（23株，0.8%）、血液（8株，0.3%），胸腔積液和腦脊液標(biāo)本各2株。見表1。

2.1.4 季節(jié)分布 以冬季和春季多，秋季最少。其中春季（3月份～5月份）858株（28.4%）、夏季（6月份～8月份）810株（26.8%）、秋季（9月份～11月份）437株（14.4%）、冬季（12月份～次年2月份）921株（30.4%）。見表1。

表1 3 026例患兒相關(guān)臨床資料Table 1 Clinical data of 3 026 children

2.2 藥物敏感性分析

2.2.1 β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果 3 026株流感嗜血桿菌中，β內(nèi)酰胺酶陽性菌株為1 760株，檢出率 為58.2%（1 760/3 026），2015—2019年 每 年的檢出陽性率依次為50.0%（267/534）、52.5%（318/606）、58.8%（381/648）、60.3%（425/705）和69.2%（369/533）。β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥（β-lactamase negative and ampicillin-resistant，BLNAR）菌株為92株，檢出率為3.0%，BLNAR菌株均分離自痰標(biāo)本。每年的檢出率依次為3.4%（18/534）、3.1%（19/606）、3.2%（21/648）、3.1%（22/705）和2.3%（12/533）。

2.2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥情況見表2。未檢出對(duì)頭孢曲松、美羅培南不敏感菌株。侵襲性菌株與非侵襲性菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率或不敏感率差異不明顯。在非侵襲性流感嗜血桿菌中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶菌株對(duì)頭孢克洛、甲氧芐啶-磺胺甲唑和氨芐西林的耐藥率＞57.0%，對(duì)阿莫西林-克拉維酸的耐藥率為26.3%，對(duì)頭孢唑肟和阿奇霉素的不敏感率分別為7.9%和59.8%，均顯著高于不產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶菌株（P＜0.05）。

表2 兒童分離3 026株流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of 3 026 strains of H. influenzae isolated from children to antimicrobial agents（%）

2.2.3 歷年藥敏試驗(yàn)結(jié)果 2015—2019年分離的流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況見表3。各年份分離菌株對(duì)氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥率、對(duì)頭孢唑肟和阿奇霉素的不敏感率呈逐年上升的趨勢(shì)。對(duì)頭孢克洛和阿莫西林-克拉維酸的耐藥率也呈逐年上升的趨勢(shì)，除2017年分離菌株對(duì)頭孢克洛的耐藥率和2018年分離菌株對(duì)阿莫西林-克拉維酸的耐藥率外，各年份分離流感嗜血桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率變化不大。

表3 2015—2019年分離流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of H. influenzae isolates to antimicrobial agents by year from 2015 to 2019（%）

3 討論

流感嗜血桿菌定植于鼻咽部，是引起呼吸道感染的主要病原菌之一，也可引起腦膜炎、敗血癥等侵襲性疾病，嚴(yán)重威脅兒童健康[5]。研究表明，流感嗜血桿菌可通過黏附侵入呼吸道上皮細(xì)胞，從而長期定植于呼吸道[6]。本研究中流感嗜血桿菌主要分離自呼吸道標(biāo)本，占總分離株的63.3%，遠(yuǎn)低于之前的文獻(xiàn)報(bào)道[7]，其中痰標(biāo)本最多，其次為支氣管灌洗液標(biāo)本。呼吸道標(biāo)本分離株占比下降是因陰道分泌物標(biāo)本分離株的增多所致，本研究中陰道分泌物標(biāo)本分離株占34.7%，高于陳珊珊等[8]的報(bào)道。有研究表明，外陰陰道炎在青春期前是最常見的小兒婦科疾病，國內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)40%～81.4%，其中流感嗜血桿菌占陰道炎分離菌株的第二位，僅次于大腸埃希菌。我院兒童陰道分泌物中分離的致病菌中流感嗜血桿菌居第一位，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道有差別[9]。流感嗜血桿菌可通過污染的手傳播到兒童陰道中，國外文獻(xiàn)報(bào)道流感嗜血桿菌的生物型Ⅳ型和Ⅶ型是引起青春期前女孩外陰陰道炎的常見型別，該型別菌株毒力較強(qiáng)，因此應(yīng)引導(dǎo)兒童養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣。

本組資料顯示男性患兒中檢出的流感嗜血桿菌的比例明顯高于女性患兒，推測(cè)可能與男性患兒更易受該菌感染有關(guān)，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8，10]。從流感嗜血桿菌感染患兒的年齡結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)嬰兒期和幼兒期患兒占81.2%，明顯高于學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童，即主要的感染人群為嬰幼兒，與嬰幼兒鼻黏膜柔軟易受感染、肺彈力發(fā)育差、免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全等因素有關(guān)。因此流感疫苗的接種對(duì)嬰幼兒流感嗜血桿菌的感染具有至關(guān)重要的預(yù)防作用。本研究顯示我院冬季和春季檢出的流感嗜血桿菌占全年的58.8%，引起的相關(guān)感染好發(fā)于冬春季，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

氨芐西林是用來治療流感嗜血桿菌引起的各類感染性疾病的首選藥物，但近年來隨著抗菌藥物的廣泛使用，流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率逐漸上升。氨芐西林耐藥的流感嗜血桿菌于1972年首次從腦膜炎患者體內(nèi)分離出，隨后越來越多的氨芐西林耐藥株被檢測(cè)到，耐藥形勢(shì)不容樂觀[12]。本組研究資料顯示我院流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為61.6%，耐藥率由2015年的53.1%逐步上升到2019年的71.4%，明顯高于國內(nèi)報(bào)道的42.4%[13]。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制分為兩種：一是產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶，分為TEM-1和ROB-1兩種類型[14]，常見的是TEM-1型，ROB-1型檢出率低[15]。本研究的3 026株流感嗜血桿菌中共檢出1 760株β內(nèi)酰胺酶陽性菌株，陽性率為58.2%，高于金瑛等[16]報(bào)道的44.7%，與2019年CHINET監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相近[17]。且在2015—2019年β內(nèi)酰胺酶陽性率呈逐年上升的趨勢(shì)。本研究中氨芐西林耐藥率與β內(nèi)酰胺酶陽性率相近，提示我院流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制主要為β內(nèi)酰胺酶對(duì)抗菌藥物的水解。文獻(xiàn)報(bào)道，流感嗜血桿菌細(xì)胞壁上青霉素結(jié)合蛋白3（PBP3)的ftsI基因氨基酸位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變，可導(dǎo)致細(xì)菌與β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的親和力下降[18]。另一種機(jī)制導(dǎo)致的氨芐西林耐藥稱為BLNAR菌株。本研究中共檢出92株BLNAR菌株，檢出率為3.0%，且每年的檢出率相對(duì)穩(wěn)定。BLNAR菌株在加拿大的檢出率較低，但是在日本和韓國的流行率很高[19]。國外有研究表明BLNAR菌株易成為多重耐藥菌[20]，因此應(yīng)對(duì)其給予重視，對(duì)其耐藥機(jī)制應(yīng)進(jìn)行深入研究。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，β內(nèi)酰胺酶陽性菌株對(duì)阿莫西林-克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢克肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、氯霉素、四環(huán)素的耐藥率以及對(duì)阿奇霉素和頭孢唑肟的非敏感率顯著高于β內(nèi)酰胺酶陰性菌株。本研究分離的流感嗜血桿菌對(duì)阿莫西林-克拉維酸的耐藥率由2015年的13.6%逐步升高到2019年的24.9%，作為常用的口服藥物，阿莫西林-克拉維酸仍可作為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥，但逐年上升的耐藥率仍需引起重視。

綜上所述，目前流感嗜血桿菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的比例極高，氨芐西林已不能作為臨床一線用藥，對(duì)其他β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率和阿奇霉素的不敏感率呈逐年上升的趨勢(shì)，因此對(duì)流感嗜血桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物從而減緩耐藥菌株的出現(xiàn)具有重要意義。