趙 晶，劉靜嫻，劉 瑛

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），20世紀(jì)30年代由Rebecca Lancefield分離自患牛乳腺炎的奶牛而得名，因其具有蘭氏B組抗原，又稱被稱為B族鏈球菌（Group BStreptococcus）。《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》將其描述為革蘭染色陽性、觸酶陰性的兼性厭氧菌，呈球形或卵圓形，直徑小于2 μm。B族鏈球菌可在健康女性的生殖道和消化道中定植，青春期以后的女性檢出率較高，在孕婦中可以達(dá)到17%～19%[1]。定植于孕產(chǎn)婦生殖道B族鏈球菌，可導(dǎo)致圍產(chǎn)期嬰兒感染，成為引起產(chǎn)褥期肺炎、膿毒血癥和腦膜炎等侵襲性新生兒疾病的主要危險(xiǎn)因素[2]。嬰兒出生后7 d內(nèi)發(fā)生的早發(fā)型感染（early onset disease，EOD）常伴發(fā)肺炎，1周后至3個(gè)月發(fā)生的遲發(fā)型感染（late onset disease，LOD）通常與膿毒血癥和腦膜炎相關(guān)。大于3月齡的嬰兒亦可被B族鏈球菌感染，稱為超遲發(fā)型感染（long late onset disease，LLOD）。此外，B族鏈球菌還是產(chǎn)后感染和患有糖尿病、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、腫瘤等特定人群機(jī)會(huì)性感染的重要病原體，可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎等[3]。自1938年首例致死性產(chǎn)后感染病例被報(bào)道，到上世紀(jì)70年代以來，B族鏈球菌已成為新生兒敗血癥和腦膜炎的主要病原體。在產(chǎn)前篩查聯(lián)合預(yù)防性使用抗生素（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）策略實(shí)施之前，它是造成發(fā)達(dá)國家新生兒死亡的頭號(hào)感染因素。得益于IAP的廣泛實(shí)施，近年EOD-B族鏈球菌感染率已顯著下降，然而LOD患病率并沒有明顯變化，LOD-B族鏈球菌感染仍是新生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一[4]。綜上，了解全球B族鏈球菌在人群尤其是孕產(chǎn)婦體內(nèi)定植和新生兒疾病中的分子流行病學(xué)特征以及分子流行病學(xué)分析方法十分重要。

1 B族鏈球菌分型和分子流行病學(xué)特征

1.1 莢膜血清型（capsular polysaccharide serotype，CPS）

B族鏈球菌菌體外包裹著一層莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP），由CP決定的血清型稱為CPS。根據(jù)B族鏈球菌CP的免疫反應(yīng)性，目前已鑒定出10種血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ）和不可分型（nontypeable，NT）。CPS可以通過膠乳凝集法和多重PCR等分子生物學(xué)方法檢測(cè)來鑒定。研究中常利用CPS將B族鏈球菌分離株分成血清學(xué)上相似的群體，以了解該菌在懷孕和非懷孕成人體內(nèi)定植以及新生兒疾病中的流行情況。B族鏈球菌最常見的莢膜CPS包括Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，占全球血清型的98%[1]。然而，在世界各大洲之間，聯(lián)合國定義的發(fā)達(dá)國家和非發(fā)達(dá)國家之間，不同血清型的流行率存在著差異（見表1）[5-26]。

表1 無乳鏈球菌莢膜血清型全球流行分布及特點(diǎn)

1.2 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

近年來，隨著新的核酸檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)，B族鏈球菌基因編碼信息不斷被破譯，其分子流行病學(xué)研究得到了新的發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)，編碼CPS的基因組，其包含的基因信息與特定的血清型并不完全一致。2003年，Jones等[27]利用7個(gè)已知的管家基因（adhP、atr、glcK、glnA、pheS、sdhA和tkt）建立了B族鏈球菌的MLST方法。隨后Jolley等[28]創(chuàng)立了MLST數(shù)據(jù)庫，該庫現(xiàn)已收錄4 000多個(gè)B族鏈球菌分離株信息。數(shù)據(jù)庫顯示目前全球主要流行的ST型包括ST-17（20.4%）、ST-1（13.6%）、ST-23（12.6%）、ST-19（7.9%）、ST-10（6.6%）[26]。

CPS與MLST序列類型（ST）有一定相關(guān)性，但并不是嚴(yán)格對(duì)應(yīng)，具有相同ST的B族鏈球菌菌株可能有不同的血清型。數(shù)個(gè)ST可組成克隆復(fù)合體（clonal complexes，CC），同 一CC的ST成 員包含的上述7個(gè)管家基因中最多僅允許1個(gè)等位基因發(fā)生變異。CC的編號(hào)根據(jù)其祖系ST型或主要ST型確定。從人體分離的B族鏈球菌主要CC包括CC-17、CC-1、CC-23、CC-19、CC-10等[4]。從MLST全球數(shù)據(jù)庫中可以得知各大洲B族鏈球菌分離株數(shù)據(jù)的分布差異，其中來自歐洲數(shù)據(jù)的占39.1%，非洲28.5%，亞洲13.4%，北美洲11.9%，南美洲0.1%，大洋洲數(shù)據(jù)缺少，而荷蘭、肯尼亞、日本、美國、巴西分別提交了所屬洲最多的數(shù)據(jù)[26]。需要指出的是，數(shù)據(jù)量占比并不代表其實(shí)際流行分布，主要與該地區(qū)的數(shù)據(jù)提交量有關(guān)。

從MLST數(shù)據(jù)庫可以看到ST和CPS之間的某些關(guān)聯(lián)性，每個(gè)最流行的ST及其所屬的CC似乎都與某些特定的血清型相關(guān)，致病性亦有其相對(duì)獨(dú)特的表現(xiàn)（見表2）。CC-17組的血清型同質(zhì)性明顯，除一小部分未明確的血清型外，所有分離株均關(guān)聯(lián)CPS Ⅲ[26]。有研究指出，導(dǎo)致侵襲性新生兒感染的主要克隆株多屬于Ⅲ型，且主要來自CC-17，占LOD-B族鏈球菌感染的80%以上[4]。前述我國臺(tái)灣地區(qū)的研究中，ST-17占B族鏈球菌嬰幼兒侵襲性疾病的56.6%，其中87.3%的ST-17為血清Ⅲ型[12]。CC-17以外的克隆株更多見于成人侵襲性感染。ST-12和CPS Ⅰb之間的相關(guān)性密切，而除了ST-17外其他所有ST中都發(fā)現(xiàn)有CPS Ⅴ菌株[29]。美國和加拿大的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CC-1組中的ST-1與CPS Ⅴ之間存在顯著的相關(guān)性，而非妊娠期成人的侵襲性B族鏈球菌感染由Ⅴ型引起的占了相當(dāng)大比重。該研究中的Ⅴ型分離株中ST-1占92%，非ST-1菌株最主要為ST-19。作者認(rèn)為ST-1菌株的出現(xiàn)是20世紀(jì)90年代以來成人B族鏈球菌侵襲性感染的主要原因[30]。分離自人體的ST-1被認(rèn)為可能與分離自牛的B族鏈球菌 ST-1型同源，全基因組測(cè)序確認(rèn)了1992年的ST-1克隆株與20世紀(jì)70年代導(dǎo)致奶牛乳腺炎的瑞典菌株密切相關(guān)[4,30]。除此之外，部分B族鏈球菌克隆株還與定植有相關(guān)。前述Jones等[27]發(fā)現(xiàn)ST-19和部分ST-1與無癥狀定植顯著相關(guān)，而ST-23在定植和侵襲性感染中均常見。來自加拿大的一項(xiàng)研究同樣得出了類似的結(jié)論，認(rèn)為ST-1和ST-23是孕婦中最常見的定植株[31]。而在非洲東北部，從孕婦陰道、直腸和新生兒體表分離的定植株主要克隆復(fù)合體為CC-10，占68.8%，其中ST-10最常見占37.5%[32]。綜上所述，利用MLST分析B族鏈球菌的分子流行病學(xué)特征是近期的研究熱點(diǎn)，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用為我們提供了從血清型基因方面了解B族鏈球菌流行特點(diǎn)的新的角度。

表2 部分無乳鏈球菌MLST分型與莢膜血清型相關(guān)性

2 分子流行病學(xué)檢測(cè)方法

2.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

PFGE是另一種分析B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征的分子生物學(xué)方法，在評(píng)估菌株遺傳親緣關(guān)系方面具有高區(qū)分度的特殊優(yōu)勢(shì)。有研究應(yīng)用PFGE方法發(fā)現(xiàn)，血清Ⅰb、Ⅲ和Ⅴ型菌株具有同源性，而血清Ⅳ、Ⅰa和Ⅱ型菌株則不具有同源性[33]。這表明經(jīng)典的CPS分析無法全面地揭示B族鏈球菌菌株之間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。雖然使用PFGE可以觀察到比傳統(tǒng)血清學(xué)分型更為深入的菌株親緣關(guān)系，但該技術(shù)也有其局限性。由于缺乏統(tǒng)一的命名分型系統(tǒng)，加之鑒定凝膠上的片段條帶具有主觀性，在報(bào)告條帶大小時(shí)缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)，PFGE分析很難在不同研究之間進(jìn)行比較[26]。目前，該法多用于分析一項(xiàng)研究中來源不同的菌株及其傳播方式之間的差異。例如，有項(xiàng)早期的研究觀察到來自母體和其分娩兒的B族鏈球菌分離株具有相同的片段圖譜模式，從而明確了該型菌株的母嬰垂直傳播[34]。從另一方面看，拋開其局限性，PFGE法揭示了B族鏈球菌菌株血清型內(nèi)和血清型間存在的遺傳變異，提供了從另一個(gè)角度研究B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征的工具，促進(jìn)了新的發(fā)展。

2.2 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA）

MLVA原理與MLST相似，但該法利用的不是管家基因，而是VNTR（variable-number tandem-repeat）基因座。VNTR由遍布于整個(gè)細(xì)菌基因組不同基因位點(diǎn)的DNA的重復(fù)序列組成。不同菌株VNTR基因座的重復(fù)序列數(shù)量不盡相同，因此可以類似MLST，將幾個(gè)VNTR基因座組合起來進(jìn)行綜合分析，從而產(chǎn)生不同菌株的VNTR特征性圖譜。應(yīng)用MLVA可以對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行新的分型。Radtke等[35]研究了B族鏈球菌基因組5個(gè)最具多樣性的基因座（SATR1、SATR2、SATR3、SATR4和SATR5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLVA分型與CPS分型或MLST分型大體相符，但前者區(qū)分度更高。該研究中總共126株B族鏈球菌實(shí)驗(yàn)分離株具有70種不同的MLVA類型（MT），而只有36種MLST的ST型和19種CPS。同時(shí)該研究還顯示，SATR2的重復(fù)序列與CPS Ⅸ型相對(duì)應(yīng)，SATR3與ST-17密切相關(guān)，SATR5則與CPS Ⅴ/ST-1有一定相關(guān)性。SATR1基因座被認(rèn)為是由成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered

regularly interspaced short palimdromic repeats，

CRISPR）組成的，其在MLVA分析中的作用尤為特殊和重要。

也有人僅使用6個(gè)VNTR基因座進(jìn)行分析，包括上述Radtke等[35]研究的3個(gè)，同樣顯示了MLVA的98種 分 型 相 比MLST的51種 分 型 具有更大的區(qū)分力。該研究還發(fā)現(xiàn)，MLVA MT與MLST CC有相似之處，所有人體分離株CC-17均出現(xiàn)在MT-9群中。同時(shí)該研究還將MLST CC-23分成了CPSⅢ和CPS Ⅰa兩群，再一次體現(xiàn)了MLVA的高區(qū)分度[36]。巴西一項(xiàng)研究對(duì)育齡非孕婦定植的B族鏈球菌利用MLVA進(jìn)行基因分型，總共86株分離株中發(fā)現(xiàn)了15種MT[37]。另一項(xiàng)關(guān)于孕婦的研究中41株B族鏈球菌分離株中發(fā)現(xiàn)30株MT，同樣顯示了MLVA分型高度多樣性的流行特征[38]。然而，與PFGE類似，因?yàn)闆]有統(tǒng)一命名標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫，該分型方法同樣很難在研究之間進(jìn)行比較。但是MLVA分析顯示出了高度區(qū)分力、高度多樣性的B族鏈球菌分子流行病學(xué)特征，這一新技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用值得進(jìn)一步關(guān)注。

2.3 CRISPR

CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)核苷酸序列，在生物進(jìn)化史上，細(xì)菌為了將病毒、噬菌體的外來入侵基因清除，進(jìn)化出了CRISPR-Cas系統(tǒng)。CRISPR和Cas（CRISPR相關(guān)蛋白）在細(xì)菌主動(dòng)性防御和適應(yīng)性免疫中起到重要作用。該系統(tǒng)保守而特殊的回文樣基因排列及其變異，保留了細(xì)菌久遠(yuǎn)進(jìn)化史上各個(gè)時(shí)期基因入侵的痕跡。上文提及的MLVA SATR1基因座即被認(rèn)為是由CRISPR組成。在B族鏈球菌中，已經(jīng)確定了兩個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)，包括普遍存在且有功能的II-A型系統(tǒng)和罕見且常不完整的I-C型系統(tǒng)，分別與CRIPSR locus 1 （CRISPR 1）和CRISPR 2相對(duì)應(yīng)[39]。CRISPR1廣泛存在于細(xì)菌基因組，使其成為追蹤基因變異的一個(gè)非常重要的分子標(biāo)記。利用這種方法，法國的一項(xiàng)研究能夠在11年的時(shí)間里追蹤監(jiān)測(cè)100名女性的陰道B族鏈球菌定植演變情況[40]。另一項(xiàng)同樣來自法國的研究則揭示了2群共存于孕婦體內(nèi)的B族鏈球菌定植菌株群親緣相近，可能來自同一祖先[41]。CRIPSR 1作為一種新的基因標(biāo)志物，其記錄了細(xì)菌隨著時(shí)間演變形成的更為細(xì)致而又多樣性的分子流行特征和流行趨勢(shì)，成為了近年來的研究熱點(diǎn)。

3 總結(jié)

本文綜合闡述了目前全球無乳鏈球菌的分子流行病學(xué)特征，以及一些新的分子流行病學(xué)分析方法的研究應(yīng)用。傳統(tǒng)的CPS分型及其分布目前在全球研究得最為廣泛和深入，其取得的大量數(shù)據(jù)，顯示出了相對(duì)清晰的經(jīng)典分子流行趨勢(shì)。MLST是目前研究較多的技術(shù)領(lǐng)域，其描述的分子特征相對(duì)CPS更具多樣性并有其自身的流行規(guī)律，提供了從基因?qū)用媪私釨族鏈球菌流行特點(diǎn)的新角度。PFGE可用于分析分子特征相近菌株之間的遺傳親緣關(guān)系，在單項(xiàng)研究?jī)?nèi)了解血清型內(nèi)和血清型間細(xì)微的遺傳變異方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。MLVA具有高區(qū)分度特點(diǎn)，其描述的細(xì)菌分子特征展現(xiàn)了B族鏈球菌更為復(fù)雜多樣化的流行結(jié)構(gòu)。CRISPR系統(tǒng)特有代代相傳的基因入侵印跡，能讓我們更為深入細(xì)致地了解菌株之間的遺傳同源性。本文關(guān)于這些分子流行病學(xué)特征及研究進(jìn)展的初步探討，旨在為防治B族鏈球菌侵襲性疾病提供重要的流行病學(xué)資料，為血清型相關(guān)的疫苗研發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)，為早期干預(yù)治療母嬰B族鏈球菌感染，減少母嬰間垂直傳播提供有價(jià)值的信息。全球各國學(xué)者對(duì)于B族鏈球菌分子流行病學(xué)的研究正在不斷深入，前景值得期待。