傅曉穎 鄧曉敏 陳倩云 彭佳媛 杜旌暢 朱彥鋒 余小平

光是視覺產(chǎn)生和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的基本要素，但過量光刺激可能導致視網(wǎng)膜光化學損傷(RPD)。研究證實，光誘導的氧化應激參與RPD 的始動環(huán)節(jié)[1]。在視網(wǎng)膜感光細胞中，鐵離子作為重要的光轉(zhuǎn)導酶輔助因子，能維持細胞正常代謝，而細胞內(nèi)過量鐵離子可通過芬頓反應產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，從而誘發(fā)氧化應激，加速視網(wǎng)膜退化或某些遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。因此，平衡的鐵代謝狀態(tài)對于維持視覺功能及預防視力損傷至關(guān)重要。

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)主要是由黃斑區(qū)老化及視網(wǎng)膜光損傷而導致的一種退行性視網(wǎng)膜疾病[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮中鐵濃度增加，并繼發(fā)性引起光感受器退化[4]。使用鐵螯合劑可以螯合視網(wǎng)膜中的鐵離子，減少鐵誘導的氧化損傷，具有預防或治療某些視網(wǎng)膜疾病的潛力[5-6]?；ㄇ嗨厥且活惥哂卸喾咏Y(jié)構(gòu)和強抗氧化性的天然黃酮類化合物。飛燕草素(Delphinidin)是花青素中抗氧化效應最強的代表成分，其表現(xiàn)出抗炎[7]、抗增殖和抗腫瘤[8]等多種生物活性。本課題組前期研究結(jié)果證實，在小鼠視網(wǎng)膜感光細胞661W與SD大鼠中，Delphinidin能通過調(diào)控氧化-抗氧化系統(tǒng)有效減輕細胞光化學損傷[9-10]。而RPD中是否存在過量鐵離子，Delphinidin能否通過調(diào)節(jié)鐵離子含量減少光誘導視網(wǎng)膜感光細胞死亡尚不清楚。故本研究以661W細胞為研究對象，以鐵螯合劑DFP為陽性對照，探討Delphinidin調(diào)節(jié)鐵代謝保護光化學損傷661W細胞的可能效應與機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器(1)主要試劑:Delphinidin、DFP(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(中國碧云天公司)，鈣黃綠素-乙酰羥甲基酯熒光探針(Calcein-AM，英國Abcam公司)，BODIPYTM 581/591 C11熒光探針(美國Thermo Fisher Scientific公司)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)抗體(英國Abcam公司)，鐵蛋白輕鏈(FTL)抗體、二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1(DMT1)抗體、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)抗體(中國Proteintech公司)，鐵蛋白重鏈1(FTH1)抗體、兔二抗、鼠二抗(美國CST公司)，GAPDH(中國ZSGB-BIO公司)。(2)主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；CMC-Ⅱ型細胞光照儀(自制，專利號：ZL201821939405.1)；Power Wave XS2酶標儀(美國BioTek公司)；IX71倒置熒光相差顯微鏡(日本 Olympus 公司)；QuanteonTM流式細胞儀(美國ACEA Biosciences公司)；電泳儀、ChemiDoc化學發(fā)光凝膠成像檢測儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細胞來源與培養(yǎng)方法661W細胞購于上海奧陸生物有限公司(源于美國俄克拉何馬州大學)，采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素),置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 藥物濃度篩選661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，分別加入100 μL的含5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1、80 μmol·L-1、160 μmol·L-1Delphinidin或DFP的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每個濃度設3個復孔，按CCK-8試劑盒說明書步驟操作，酶標儀檢測各孔450 nm的光密度(D)，計算細胞活力，篩選Delphinidin和DFP的最佳作用濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組收集對數(shù)生長期的661W細胞進行分組處理，其中，(1) Control組：避光培養(yǎng)細胞24 h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；(2) Light組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(3) Light + DFP組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換為含20 μmol·L-1DFP的培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(4)Light+Delphinidin組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換為含5 μmol·L-1Delphinidin的培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(5) Control+Delphinidin組：避光培養(yǎng)細胞24 h，換為含5 μmol·L-1Delphinidin的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 各組661W細胞活力檢測661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，每組設3個復孔。分組處理后收集各組細胞，按CCK-8試劑盒說明書步驟操作，酶標儀檢測各孔450 nm的D，計算細胞活力。

1.5.2 各組661W細胞膜受損程度661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，每組設3個復孔。分組處理后收集各組細胞，使用細胞凋亡與壞死檢測試劑盒中Hoechst染液與PI染液4 ℃孵育各組細胞30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 各組661W細胞鐵含量測定661W細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔約為1.5×105個細胞，每組設3個復孔。分組處理后收集各組細胞，用500 μL的1 μmol·L-1Calcein-AM熒光探針染液重懸細胞后，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀FITC通道檢測各組細胞平均熒光強度(MFI)。

1.5.4 各組661W細胞脂質(zhì)過氧化物含量測定661W細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔約為1.5×105個細胞，每組設3個復孔。分組處理后收集各組細胞，用500 μL的4 μmol·L-1BODIPYTM 581/591 C11熒光探針染液重懸細胞后，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀FITC通道檢測各組細胞MFI。

1.5.5 Western blot檢測各組661 W細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達分組處理后收集各組細胞，IP裂解液裂解細胞后，提取細胞內(nèi)總蛋白并以BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入DMT1、TfR1、FTL、FTH1、Fpn一抗稀釋液搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入相應二抗稀釋液，再經(jīng)ECL顯影，ImageJ 軟件分析各組細胞條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Delphinidin和DFP對光損傷661W細胞的保護作用CCK-8法檢測不同濃度Delphinidin和DFP對661W細胞活力的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，Delphinidin IC50為124.7 μmol·L-1，其濃度在20 μmol·L-1以下能促進細胞生長；DFP IC50為137.2 μmol·L-1，其濃度在40 μmol·L-1以下能促進細胞生長。由此，設定Delphinidin與DFP的作用濃度分別為5 μmol·L-1和20 μmol·L-1。CCK-8法檢測Delphinidin和DFP對光損傷后661W細胞活力的影響，結(jié)果顯示： 與Control組相比，Light組細胞活力明顯降低(P<0.05)，Control + Delphinidin組細胞活力明顯增加(P<0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞活力均明顯升高(均為P<0.05)，表明DFP和Delphinidin可保護661W細胞減少光照損傷(表1)。

圖1 Delphinidin、DFP對661W細胞的劑量-反應曲線 A:Delphinidin對661W細胞的劑量-反應曲線；B:DFP對661W細胞的劑量-反應曲線。

2.2 Delphinidin改善光損傷661W細胞的細胞膜功能Hoechst-PI染色能檢測早期死亡細胞膜的通透性狀態(tài)。PI無法穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色；而Hoechst可穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光表達明顯增強。熒光顯微鏡下可見：Control組細胞未發(fā)生凋亡反應，細胞核呈現(xiàn)均勻一致的弱藍色低熒光，Light組細胞熒光染色強度明顯增強，細胞膜損傷嚴重，細胞死亡數(shù)量增加；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞熒光染色強度明顯降低，細胞死亡數(shù)量減少，細胞膜受損程度降低(圖2)。

圖2 各組661W細胞的Hoechst-PI雙染圖(×200) 正常細胞為弱紅色熒光加弱藍色熒光，凋亡細胞染色質(zhì)會固縮呈亮藍色熒光。

2.3 Delphinidin降低光損傷661W細胞鐵含量Calcein-AM熒光探針能夠進入細胞，結(jié)合細胞內(nèi)鐵離子后即被淬滅。因此，熒光信號強弱與細胞內(nèi)鐵含量成反比。各組661 W細胞鐵含量檢測結(jié)果表明：與Control組相比，Light組細胞鐵含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示Light組細胞內(nèi)存在鐵蓄積現(xiàn)象；與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞鐵含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞鐵含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，Delphinidin和DFP可減少光誘導的鐵過載(圖3和表1)。

圖3 各組661W細胞鐵含量

表1 各組細胞活力、Calcein-AM MFI、BODIPYTM 581/591 C11 MFI

2.4 Delphinidin減少光損傷661W細胞脂質(zhì)過氧化物含量采用BODIPYTM 581/591 C11熒光探針檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平，結(jié)果表明： 與Control組相比，Light組細胞MFI顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，光照能誘導細胞脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應；與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞MFI無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞MFI均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，Delphinidin和DFP可減少661W細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生(圖4和表1)。

圖4 各組661W細胞脂質(zhì)過氧化物水平

2.5 Delphinidin對光損傷661W細胞鐵代謝相關(guān)蛋白的影響Western blot檢測結(jié)果表明：與Control組相比，Light組細胞DMT1、TfR1、FTL、FTH1蛋白表達水平均升高，F(xiàn)pn蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；與Control組相比，Control+Delphinidin組細胞DMT1、TfR1和Fpn蛋白表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，F(xiàn)TL、FTH1蛋白表達無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞TfR1、Fpn蛋白表達水平均升高，DMT1、FTL和FTH1蛋白表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖5和表2)。

圖5 各組細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達情況

表2 各組細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

高強度或長時間光照會促使感光細胞線粒體生成大量ROS。ROS既是氧化產(chǎn)物，又可作為第二信使通過誘導應激反應或各種蛋白表達來激活不同信號通路，最終導致細胞死亡[11]?；ㄇ嗨卮嬖谟诙喾N果蔬花卉中。由于Delphinidin B環(huán)上有三個羥基結(jié)構(gòu)，其抗氧化能力最強[12]。本課題組前期研究證明Delphinidin可提高抗氧化酶系活性，并通過調(diào)節(jié)凋亡通路相關(guān)蛋白(iNOS、Bax、細胞色素 C、Cleaved-Caspase-3)的表達來降低光誘導的視網(wǎng)膜氧化應激損傷[9-10]。

因661W細胞具有視錐細胞的生化特性[13]，故本研究以661W細胞建立RPD體外模型。結(jié)果顯示，與Control組相比，Light組細胞活力顯著降低，Hoechst-PI熒光染色強度顯著增強，感光細胞的細胞膜受損明顯，細胞死亡數(shù)量增加。不同濃度Delphinidin與DFP處理661W細胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Delphinidin與DFP最佳作用濃度分別為5 μmol·L-1和20 μmol·L-1。與Light組相比，Light+DFP組與Light+Delphinidin組細胞活力均明顯提高，Hoechst-PI熒光染色強度顯著降低，提示Delphinidin能降低光誘導的細胞損傷，維持細胞膜完整性，減少細胞死亡。同時與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞活力顯著升高，表明5 μmol·L-1Delphinidin處理對661W細胞無毒副作用。

Daruich等[14]研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜脫離患者眼中鐵含量隨脫離時間的延長而增加，且與視力恢復不良相關(guān)。AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮及Bruch膜中的鐵含量增高，視網(wǎng)膜鐵過載會加重AMD發(fā)展[15]。Imamura等[16]用2500 lx白色熒光燈照射661W細胞1 h、3 h、6 h和12 h并檢測亞鐵離子水平，發(fā)現(xiàn)光照超過6 h亞鐵離子含量顯著升高。本研究檢測661W細胞鐵含量的結(jié)果與之相似，與Control組相比，Light組細胞鐵含量顯著增加，視網(wǎng)膜存在鐵蓄積現(xiàn)象，而與Light組相比，DFP或Delphinidin干預能明顯減少661 W細胞鐵含量，維護視網(wǎng)膜鐵代謝穩(wěn)態(tài)。

2012年，Dixon等[17]首次報道了鐵死亡(ferroptosis)這一非凋亡性的新型細胞死亡方式。其特征是依賴鐵離子的ROS積累，引起細胞氧化還原水平失衡，進而發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化反應損傷細胞膜的完整性，導致細胞死亡[18]。本課題組前期研究結(jié)果表明，Delphinidin可減少ROS含量，調(diào)節(jié)細胞抗氧化水平[9]。本研究結(jié)果證實，光照后細胞脂質(zhì)過氧化物水平增多，DFP或Delphinidin能通過降低鐵過載引起的脂質(zhì)過氧化反應，減輕光誘導的視網(wǎng)膜氧化損傷。此外，其他花色苷或葉黃素也可增加抗氧化酶的表達[19-20]，減少脂質(zhì)過氧化物含量，保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞[21]。

細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)由多種調(diào)控因子參與。鐵離子主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和TfR1結(jié)合進入細胞[22-23]，然后通過DMT1進入細胞質(zhì)，細胞內(nèi)過量鐵儲存于FTL和FTH1內(nèi)。臨床研究結(jié)果顯示，AMD患者的血液中Tf和TfR1濃度均顯著增加[24]，AMD患者血液中鐵蓄積與鐵的攝取異常有關(guān)。Hadziahmetovic等[25]通過微陣列分析小鼠視網(wǎng)膜光損傷中鐵調(diào)節(jié)基因的變化，發(fā)現(xiàn)TfR1和FTL基因表達上調(diào)。Imamura等[16]研究證明，在光損傷661W細胞體外模型中，TfR1和FTH1基因表達均隨光照時間依賴性增加。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Light組細胞DMT1、TfR1、FTL和FTH1蛋白表達水平均升高；與Light組相比，DFP或Delphinidin作用后DMT1、FTL和FTH1蛋白表達水平均降低，提示Delphinidin可以通過下調(diào)鐵離子的攝取與儲存，改善細胞鐵過載。但DFP或Delphinidin作用后TfR1蛋白表達仍顯著增加，提示Delphinidin作用后細胞內(nèi)鐵離子減少會促使TfR1蛋白表達代償性增加。Fpn是目前發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)唯一的排鐵蛋白。Theurl等[26]提出，鐵離子可通過血管內(nèi)皮中的Fpn進入視網(wǎng)膜，再由Müller細胞轉(zhuǎn)運至光感受器細胞外段，最終從視網(wǎng)膜色素上皮排出，形成鐵離子從光感受器到血液的循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Light組細胞Fpn蛋白表達水平降低，表明光照誘導視網(wǎng)膜鐵含量升高可增加鐵調(diào)素表達，從而引起血管內(nèi)皮細胞Fpn的降解，限制鐵離子進入視網(wǎng)膜。而與Light組相比，DFP或Delphinidin干預后Fpn蛋白表達水平回升，表明Delphinidin作用后細胞內(nèi)鐵含量降低，為增加細胞內(nèi)可利用鐵離子，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞Fpn蛋白表達升高。以上結(jié)果表明，Delphinidin能從鐵的攝取、儲存、利用等方面調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白的表達，維持661W細胞的鐵穩(wěn)態(tài)。

綜上，Delphinidin可通過調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)蛋白表達，緩解光誘導的661W細胞鐵過載，進而抑制脂質(zhì)過氧化反應，減少視網(wǎng)膜氧化損傷。本研究證明RPD的發(fā)生機制中涉及視網(wǎng)膜感光細胞鐵過載。但RPD中鐵過載是否發(fā)展為鐵死亡，還需從胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體途徑、脂質(zhì)代謝途徑、鐵死亡調(diào)節(jié)因子等多方面進一步探討。本研究為黃酮類化合物預防和治療RPD提供了新的理論依據(jù)，對探討鐵死亡在RPD中的作用機制提供一定參考。