李豪亮 朱然 張希熹 陸志峰 錢晶晶 梁舒

真菌性角膜炎(FK)是由真菌入侵角膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答而引起的致盲性眼病[1]。FK導(dǎo)致的后果嚴(yán)重，是發(fā)展中國家勞動人群失明的主要原因之一，在中國某些地區(qū)成為角膜盲的首要原因[2-3]。FK的致病真菌在中國主要是鐮刀菌屬和曲霉菌屬[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，角膜上皮細胞表達多種模式識別受體(PRRs)，可介導(dǎo)并識別鐮刀菌等真菌菌絲與孢子抗原誘導(dǎo)角膜上皮產(chǎn)生固有免疫反應(yīng)，進而清除病原菌，在角膜上皮細胞抗真菌免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮首要作用。角膜上皮細胞表達的PRRs有Toll樣受體、C型凝集素受體、甘露糖受體等，新近研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體(NLRs)也表達于人角膜上皮細胞(hCEC)[6-7]。NLRs屬于胞漿內(nèi)PRRs，可識別胞內(nèi)菌及其衍生物，具有細胞內(nèi)免疫監(jiān)視作用。當(dāng)NLRs結(jié)合抗原后，絲氨酸/蘇氨酸激酶2被激活并啟動NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Caspase-1等信號通路，介導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生并誘導(dǎo)細胞凋亡[8-10]。

目前，國內(nèi)外對曲霉菌性角膜炎的分子免疫機制研究較多，對鐮刀菌性角膜炎的分子免疫機制研究較少，而NOD2在真菌感染中的作用相關(guān)研究罕見，尚未見有研究茄病鐮刀菌對hCEC中NOD2表達的影響。因此，本研究采用滅活的茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC，觀察不同濃度的茄病鐮刀菌孢子刺激后對hCEC中NOD2及其下游炎癥因子含量的影響，進而探索hCEC抗茄病鐮刀菌的固有免疫機制，并為今后FK的治療提供一種新的藥物干預(yù)分子靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器hCEC(凍存于南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科實驗室)、茄病鐮刀菌(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，菌種編號：BNCC121547)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、2.5 g·L-1胰蛋白酶、D-Hank’s液、DMSO、PBS均購自Gibco公司(美國)；沙氏培養(yǎng)板(安圖生物工程，中國)，NOD2兔抗人多克隆一抗(美國Signalway Antibody 公司)、HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗、熒光二抗Alexa Fluor 488(英國Abcam公司)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、ELISA試劑盒(深圳市達科為科技有限公司)；紫外分光光度計(Thermo公司)；熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀(Gene Company Limited)；熒光顯微鏡(Leica德國公司)。

1.2 細胞分組將hCEC用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取傳3代之后的hCEC進行研究。將hCEC分為對照組(不加入真菌)與真菌刺激組(按照加入真菌孢子濃度不同再分為103、104、105、106CFU·mL-1茄病鐮刀菌刺激組)；按分組將PBS沖下的茄病鐮刀菌孢子加入真菌刺激組。

1.3 方法

1.3.1 體外真菌感染hCEC模型制備將生長良好的hCEC接種至6孔板，每孔105個細胞，培養(yǎng)24 h 待細胞貼壁后，取出6孔板進入微生物實驗室。PBS沖刷生長于沙氏培養(yǎng)基的茄病鐮刀菌(27 ℃培養(yǎng)7 d)，將沖下的真菌孢子稀釋后計數(shù)并配制茄病鐮刀菌孢子懸液。65 ℃ 1 h滅活真菌孢子后用紗布過濾至EP管，使母液濃度為10×106CFU·mL-1。將真菌刺激組根據(jù)加入茄病鐮刀菌濃度再分為103、104、105、106CFU·mL-1刺激組，每組分別設(shè)置空白對照組(不加真菌組)。補足對照組及各真菌刺激組PBS體積，使各組所含PBS體積保持一致。

1.3.2 qRT-PCR檢測各組hCEC中NOD2 mRNA表達于培養(yǎng)箱取出生長在培養(yǎng)瓶中無雜菌污染的hCEC，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)液稀釋并吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度后均勻接種至12孔板，待細胞貼壁后吸取上清培養(yǎng)液，根據(jù)分組處理完畢，各孔分別于4 h、8 h、12 h、16 h提取細胞RNA后利用紫外分光光度儀檢測細胞RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于PCR儀檢測各組hCEC中NOD2 mRNA表達。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：β-actin 上游引物為CGT-GGA-CAT-CCG-CAA-AGA-CCT-G、下游引物為TGG-GAG-CCA-GAG-CAG-TGA-TCT-C，大小為22 bp； mNOD-2 上游引物為CCG-CAA-GCA-CTT-CCA-CTC-CAT-C、下游引物為AGC-CGC-TCC-TCC-TGC-ATC-TC，大小為20 bp。反應(yīng)過程為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，持續(xù)40個循環(huán)，最終延伸72 ℃ 7 min 。每組3個復(fù)孔，NOD2 mRNA的相對表達量以β-actin的表達為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算。

1.3.3 Western blot檢測各組hCEC中NOD2蛋白表達于培養(yǎng)箱取出生長在培養(yǎng)瓶中無雜菌污染的各組hCEC，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)液稀釋并吹打成單細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度后均勻接種至6孔板，待細胞貼壁后吸取上清培養(yǎng)液，處理各孔細胞12 h、24 h、36 h后用RIPA裂解液提取細胞蛋白后用BCA蛋白定量檢測各組hCEC中NOD2蛋白表達，經(jīng)過配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗與二抗孵育、洗膜后顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，ImageJ軟件計算GAPDH和NOD2蛋白的灰度值并量化。

1.3.4 細胞免疫熒光檢測各組hCEC中NOD2的表達于24孔細胞培養(yǎng)板中每孔放置無菌細胞爬片(直徑14 mm)，調(diào)整制備的hCEC懸液濃度(無血清DMEM稀釋)，每孔接種3000個hCEC，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h待細胞貼壁后取出24孔板，各真菌刺激組加入茄病鐮刀菌孢子懸液，使每孔真菌孢子濃度為105mL-1，培養(yǎng)24 h后經(jīng)過清洗、固定、封閉、一抗與二抗孵育、染色、封片，于熒光顯微鏡下拍照。

1.3.5 ELISA法檢測各組hCEC上清液中IL-6、IL-8、TNF-α蛋白含量于培養(yǎng)箱取出生長在培養(yǎng)瓶中無雜菌污染的hCEC，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)液稀釋并吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度后均勻接種至6孔板，待細胞貼壁后吸取上清培養(yǎng)液，根據(jù)分組處理各孔36 h后收取上清液，1000 r·min-1離心5 min后取上清，分別用IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒檢測各組hCEC上清液中不同炎癥因子的蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。整體間差異采用單因素方差分析，各組間差異采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞和菌種形態(tài)特征及模型建立茄病鐮刀菌接種于沙氏培養(yǎng)基，于27 ℃培養(yǎng)7 d后正面呈白色絨毛狀，背面呈淺黃色(圖1A、B)。真菌涂片檢光鏡下可見大量真菌分隔菌絲及孢子(圖1C)。傳代細胞接種于6孔板約3 h可貼壁，呈圓形；6 h開始細胞體積逐漸增大，逐漸變?yōu)殚L梭形，12 h開始進入對數(shù)生長期，48 h可見細胞生長形態(tài)趨于穩(wěn)定，為多角短梭形、排列緊密的上皮樣形態(tài)(圖1D)。收集的真菌孢子滅活處理后調(diào)整濃度加入含hCEC的6孔板，建立真菌孢子刺激hCEC模型(圖1E)。

圖1 茄病鐮刀菌和hCEC形態(tài)及茄病鐮刀菌孢子感染hCEC模型 A:茄病鐮刀菌菌落正面; B:茄病鐮刀菌菌落背面;C:菌絲涂片，菌絲(藍色箭頭)，假頭狀小分生孢子(紅色箭頭)(×200);D：hCEC培養(yǎng)48 h，細胞較多，呈多角形、單層生長,融合度達80%左右; E：茄病鐮刀菌孢子感染hCEC，鏡下可見hCEC周圍存在大量鐮刀狀分生孢子。

2.2 各組hCEC中NOD2 mRNA表達103CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 4 h、8 h、12 h、16 h后，hCEC中NOD2 mRNA相對表達水平分別為1.14±0.20、1.21±0.16、1.18±0.18、1.17±0.07，對照組為1.04±0.37，組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.263,P>0.05)。104CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 4 h、8 h、12 h、16 h后，hCEC中NOD2 mRNA相對表達水平分別為1.31±0.12、1.89±0.04、1.61±0.16、1.62±0.13，與對照組(1.03±0.29)比較，刺激4 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.572,P>0.05)，刺激 8 h、12 h、16 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.045、-3.016、-3.178,均為P<0.05)。105CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 4 h、8 h、12 h、16 h后，hCEC中NOD2 mRNA相對表達水平分別為1.34±0.16、2.98±0.14、1.77±0.18、1.38±0.09，與對照組(1.01±0.18)比較，刺激4 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.335,P>0.05)，

刺激8 h、12 h、16 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-14.894、-5.158、-3.171,均為P<0.05)。106CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 4 h、8 h、12 h、16 h后，hCEC中NOD2 mRNA相對表達水平分別為1.79±0.35、2.70±0.35、2.42±0.42、1.58±0.15，與對照組(1.04±0.35)比較，刺激4 h、16 h差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.625、-2.466,均為P>0.05)，刺激8 h、12 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.794、-4.381,均為P<0.05)。

2.3 各組hCEC中NOD2蛋白表達105CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 12 h、24 h、36 h，hCEC中NOD2蛋白相對表達水平分別為1.62±0.13、2.18±0.33、1.78±0.12，與對照組(1.00±0.06)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.379、-6.026、-10.023,均為P<0.05)(見圖2)。105CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 24 h后，hCEC中NOD2熒光分子表達量與對照組相比顯著增強(見圖3)。

圖2 105 CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激不同時間hCEC中NOD2 蛋白的表達變化

圖3 105 CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激24 h后hCEC中NOD2 熒光分子的定位和表達

2.4 各組hCEC上清液中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α分泌103、104、105、106CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC 36 h后，IL-6蛋白含量與對照組相比，103CFU·mL-1刺激組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.091,P>0.05)，104、105、106CFU·mL-1刺激組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-20.663、-33.675、-39.778,均為P<0.05)；IL-8蛋白含量與對照組相比，103CFU·mL-1刺激組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.01,P>0.05)，104、105、106CFU·mL-1刺激組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-18.957、-8.608、-10.671,均為P<0.05)；TNF-α蛋白含量與對照組相比，103CFU·mL-1刺激組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.825,P>0.05)，104、105、106CFU·mL-1刺激組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.437、-6.182、-7.079,均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組hCEC上清液中IL-6、IL-8、TNF-α蛋白含量比較

3 討論

在鐮刀菌和曲霉菌感染的FK患者角膜組織中，NOD2 mRNA的相對表達量是正常角膜組織的上千倍[7]。有研究表明用滅活的煙曲霉菌孢子刺激hCEC可上調(diào)NOD2的表達[11]，但尚無研究表明茄病鐮刀菌在體外對hCEC中NOD2表達的影響。Jin等[12]用滅活的茄病鐮刀菌刺激hCEC，檢測了各型Toll樣受體(TLRs)的表達差異，發(fā)現(xiàn)TLR2、3、4、6型mRNA及蛋白表達與對照組(未用真菌刺激組)比較均顯著升高。又有研究表明TLR受體與NOD2受體之間亦存在直接聯(lián)系，各型TLR受體的上調(diào)也會促進NOD2受體的表達[11，13-14]。因此，本研究用滅活的茄病鐮刀菌孢子刺激hCEC進而檢測NOD2表達具備充足的理論依據(jù)。

項目組先前的研究發(fā)現(xiàn)[15]，未加熱滅活的茄病鐮刀菌與尖端賽多孢子菌在體外不同糖濃度環(huán)境下均能夠通過上調(diào)hCEC中MMP-9 mRNA和蛋白表達，進而增加真菌對hCEC的黏附作用。而本研究為排除真菌的毒性和黏附力的影響，采用滅活的茄病鐮刀菌孢子作為抗原刺激hCEC，發(fā)現(xiàn)滅活的真菌在體外亦能上調(diào)細胞中炎癥因子的表達。隨著滅活的茄病鐮刀菌孢子刺激濃度的升高，hCEC中NOD2 mRNA表達逐漸增加，105CFU·mL-1茄病鐮刀菌孢子濃度刺激8 h可達峰值，而用該濃度的茄病鐮刀菌孢子刺激24 h NOD2蛋白表達可達高峰。隨著茄病鐮刀菌孢子濃度的升高，與NOD2介導(dǎo)有關(guān)的下游相關(guān)炎癥因子的表達亦可升高。因此，本研究結(jié)果表明，滅活的茄病鐮刀菌孢子在體外能上調(diào)hCEC中NOD2 mRNA及蛋白的相對表達，并促進下游炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的蛋白表達。

角膜損傷是感染FK的首要因素[16]，當(dāng)真菌入侵受損的角膜后，角膜緣血管活化并趨化中性粒細胞在內(nèi)的炎癥細胞參與對病原菌吞噬并介導(dǎo)炎癥通路激活和炎癥因子的釋放。另外，hCEC作為抗真菌固有免疫的第一道屏障也參與其中。NLRs及其介導(dǎo)下游炎癥通路激活的作用成為近年來研究的熱點問題，以往NLRs在FK的發(fā)病機制中少有研究并認(rèn)為其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在FK中發(fā)揮次要作用，而近年來認(rèn)為NLRs是參與FK的主要PRRs[6，17]。有研究表明，用滅活的煙曲霉菌感染hCEC后，NOD2 mRNA和蛋白表達峰值的時間點均小于本研究結(jié)果[11]，其原因可能是刺激菌種、真菌孢子濃度等的不同而造成的差異。通過比較煙曲霉菌及茄病鐮刀菌對NOD2表達峰值時間的差異，可能對分析二者的病程及預(yù)后有一定意義。鐮刀菌及曲霉菌感染的FK患者預(yù)后都較差，陳懿等[18]研究認(rèn)為鐮刀菌感染的患者相對于曲霉菌感染的患者藥物治愈的所需時間更長，這可能與本研究中hCEC對茄病鐮刀菌的識別、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)時間較長有一定關(guān)系。

在治療FK時除運用抗真菌藥物外，糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的選用和使用時機一直以來是研究的熱點問題[19]。炎癥反應(yīng)是清除病原菌的重要保護機制，而過度的炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致角膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，影響角膜透光性，嚴(yán)重時導(dǎo)致潰瘍穿孔和失明。FK早期貿(mào)然應(yīng)用免疫抑制藥物將抑制中性粒細胞趨化導(dǎo)致感染擴散，甚至引起潰瘍穿孔，而在炎癥反應(yīng)后期適時應(yīng)用免疫抑制類藥物將明顯改善炎癥相關(guān)細胞和因子對角膜的損傷。因此，對不同菌種造成角膜炎癥反應(yīng)時間峰值點的基礎(chǔ)研究對FK臨床診治具有一定的意義。

綜上所述，NOD2參與了hCEC抗茄病鐮刀菌的固有免疫過程，因此NOD2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在FK中發(fā)揮重要作用，故而在控制真菌感染的炎癥后期同時抑制NOD2表達可能對治療FK的炎癥反應(yīng)有一定效果，NOD2可能是治療FK的新型靶分子。