胡彧嫻
(漳州市農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心,福建 漳州 363000)
琯溪蜜柚是我國(guó)名優(yōu)柚類品種[1],原產(chǎn)于福建省平和縣,已有500多年栽培歷史[2],其酸甜可口,營(yíng)養(yǎng)豐富,具鮮食和藥用雙重價(jià)值,深受人們的喜愛(ài)?,g溪蜜柚作為漳州的主要經(jīng)濟(jì)作物,有較高的經(jīng)濟(jì)效益,已成為果農(nóng)增加收入的主要途徑。近年來(lái)種植規(guī)模不斷擴(kuò)大,據(jù)報(bào)道[3]2018年全市蜜柚種植面積約105萬(wàn)667m2、產(chǎn)量超過(guò)150萬(wàn)t,果品不僅在全國(guó)各地銷售,同時(shí)還出口歐盟等40多個(gè)國(guó)家或地區(qū)。
種植過(guò)程中為防治果樹(shù)病蟲害的發(fā)生,提高蜜柚的產(chǎn)量,農(nóng)藥的使用成為果園管理的重要手段,阿維菌素、螺螨酯、乙螨唑、嘧菌酯等都是在蜜柚果園中經(jīng)常用到的農(nóng)藥。隨著蜜柚種植面積迅速擴(kuò)大、種植結(jié)構(gòu)過(guò)于單一,增加了果園病蟲害發(fā)生的概率,而農(nóng)藥使用量也隨之不斷增加。一些禁止在柑橘類水果上使用的農(nóng)藥如滅多威、克百威、氧樂(lè)果、殺撲磷等在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中也偶有檢出。近年來(lái),蜜柚中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題成為蜜柚質(zhì)量安全關(guān)注的焦點(diǎn)之一,影響到蜜柚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
農(nóng)藥多殘留的樣品前處理方法主要有液液萃取法[4]、固相萃取法[5]、凝膠滲透色譜(GPC)法[6]和QuEChERS法[7-9]等。QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)法是由Anastassiades等[10]于2003年提出,該方法相較于其它方法,操作簡(jiǎn)單、快速、有機(jī)溶液用量少,已在世界很多國(guó)家和地區(qū)得到驗(yàn)證和推廣。檢測(cè)方法主要有氣相色譜(GC)法[11-12]、高效液相色譜(HPLC)法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法[6,15]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[16-17]等。HPLC-MS/MS具有靈敏度高,定性準(zhǔn)確等特點(diǎn),已成為測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留的重要檢測(cè)手段。
國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200系列農(nóng)殘檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的前處理絕大部分都采用復(fù)雜的固相萃取方法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,有機(jī)溶劑用量也較大;此外經(jīng)常在蜜柚上使用的農(nóng)藥如烯肟菌胺、乙唑螨腈等目前還沒(méi)有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。故尋求QuEChERS結(jié)合HPLC-MS/MS同時(shí)快速檢測(cè)蜜柚中多種農(nóng)殘的方法將有很大優(yōu)越性及前沿性,具有實(shí)用性。
1.1 材料與試劑 供試材料:琯溪蜜柚。
供試試劑:阿維菌素、螺螨酯、乙螨唑、滅多威、噻嗪酮、多菌靈、異丙威、嘧霉胺、氧樂(lè)果、克百威、啶蟲脒、莠滅凈、吡蟲啉、甲霜靈、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、聯(lián)苯肼酯、殺撲磷、克螨特、丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、噠螨靈、唑蟲酰胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、樂(lè)果、三環(huán)唑、烯酰嗎啉、馬拉硫磷、戊唑醇、咪鮮胺、烯肟菌胺、唑螨酯、乙唑螨腈、蟲酰肼、毒死蜱等36種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100mg/L);氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂(分析純);分散凈化劑N-丙基乙二胺(PSA);乙腈、甲醇(色譜純);甲酸(色譜純);試驗(yàn)用水為超純水。
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確吸取0.5mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100mg/L)于25mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,配制成各農(nóng)藥組分均為2mg/L的混合工作液,于4℃冰箱中避光保存。根據(jù)需要分別用乙腈和空白樣品基質(zhì)稀釋工作液,制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。
1.2 儀器與設(shè)備 DIONEX Ultimate 3000-Thermo TSQ Quantum Ultra EMR高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有ESI源);QUINTIX612上皿式天平;3-18K高速離心機(jī)。
1.3 分析方法
1.3.1 樣品提取與凈化 參考蔡恩興[18]的方法并適當(dāng)改動(dòng),稱取10g(精確至0.01g)蜜柚樣品置于50mL離心管中,加入20mL乙腈,4g無(wú)水硫酸鎂和1g氯化鈉,劇烈振蕩2min,于4 500r/min的離心機(jī)中離心5min。離心后取2mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有0.1g PSA、0.3g無(wú)水硫酸鎂的15mL離心管中,渦旋混勻1min,以4 500r/min的離心機(jī)中離心5min,上清液過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜,待高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測(cè)定。
1.3.2 儀器工作條件
1.3.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Atlantis T3 (100mm×2.1mm,3μm);柱溫:35℃;流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液;進(jìn)樣量:2.0μL;流速:0.25mL/min;梯度洗脫條件(表1)。
表1 梯度洗脫條件
1.3.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM);噴霧溫度為270℃;電噴霧電壓為4 000V;離子傳輸管溫度為300℃;鞘氣(N2)流量為3.62L/min;輔助氣(N2) 流量為5.38L/min;36種農(nóng)藥保留時(shí)間和質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)(表2)。
表2 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)
續(xù)表
續(xù)表
2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別將1mg/L的36種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)注射泵注入ESI離子源中,選擇正離子掃描模式,調(diào)節(jié)合適的注射泵流速及離子源氣流、電壓、溫度使得待測(cè)物信號(hào)>106,且響應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。先通過(guò)母離子掃描確定每個(gè)化合物的母離子,再進(jìn)行去簇電壓(DP)的優(yōu)化,然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子的掃描,并優(yōu)化碰撞能量,選擇豐度較高的2個(gè)特征碎片離子用于定性和定量,最終確定36種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)。
2.2 提取溶劑的選擇 農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理常用到的提取溶劑較多,本試驗(yàn)考察了丙酮、甲醇、乙腈這3種溶劑提取效果。丙酮作為提取劑時(shí)提取液的顏色較深,較易提取出蜜柚樣品中的雜質(zhì),且克百威、吡蟲啉的回收率<60%;甲醇提取液的顏色雖然較丙酮淺,但回收率相對(duì)較差,多數(shù)目標(biāo)物的回收率<60%,這可能與其較難與水層分離有關(guān)[15]。乙腈作為一種通用溶劑,其極性較強(qiáng)對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥都能有效提取,且不易提出其他雜質(zhì)和色素[19],提取液顏色極淺,回收率能滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求,因此本試驗(yàn)選擇乙腈作為提取劑。同時(shí),試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),樣品量和提取劑的比例為1:2時(shí)保證了較好的回收率,而樣品量和提取劑的比例采用1:1時(shí),回收率較差,這與孔志強(qiáng)等[20]的試驗(yàn)結(jié)果類似。
2.3 基質(zhì)效應(yīng) 在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中,基質(zhì)效應(yīng)(ME)的存在不可避免,可能對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)效應(yīng)?;|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式[21]如下:
其中Sm代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,Ss代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
當(dāng)ME為-20%~20%時(shí)表示弱基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)-50%~-20%或20%~50%時(shí)表示中等基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)<-50%或>50%時(shí)表示強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[22]。
不同農(nóng)藥在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定中表現(xiàn)出來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)(圖1),在蜜柚基質(zhì)中各有50%的農(nóng)藥表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)和增強(qiáng)效應(yīng)?;|(zhì)效應(yīng)大部分表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng),占比61.1%,其中27.8%為弱抑制效應(yīng),33.3%為弱增強(qiáng)效應(yīng);36.1%的農(nóng)藥表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng),只有2.8%的農(nóng)藥(甲基硫菌靈)表現(xiàn)為強(qiáng)抑制效應(yīng),沒(méi)有農(nóng)藥表現(xiàn)為強(qiáng)增強(qiáng)效應(yīng)。由此可見(jiàn),蜜柚基質(zhì)的干擾較大,不同的農(nóng)藥表現(xiàn)出來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)有所不同,因此試驗(yàn)中有必要采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析,以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
圖1 36種農(nóng)藥在蜜柚中的基質(zhì)效應(yīng)
2.4 添加回收試驗(yàn) 在蜜柚空白樣品中分別加入3個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)6次。按1.3.1和1.3.2方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果(表3),36種農(nóng)藥在蜜柚中的平均回收率為73.3%~108.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%~10.8%。
表3 36種農(nóng)藥在蜜柚中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
續(xù)表
續(xù)表
2.5 線性范圍和靈敏度 通過(guò)向蜜柚空白基質(zhì)添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,配制基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)樣分析,以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行回歸分析。結(jié)果(表4)顯示,36種農(nóng)藥在0.5~200μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)除滅多威為0.997 8外,其他35種農(nóng)藥均>0.999。以信噪比(S/N)的3倍和10倍作為儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),該儀器檢出限為0.01~0.25μg/kg、定量限為0.03~0.80μg/kg;以添加回收試驗(yàn)中最低濃度水平作為方法的定量限,其方法定量限除螺螨酯、滅多威、吡蟲啉、苯醚甲環(huán)唑?yàn)?μg/kg,其余均為2μg/kg。
表4 36種農(nóng)藥在蜜柚中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
本試驗(yàn)建立了QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量,在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成對(duì)蜜柚中36種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定性定量檢測(cè)。36種農(nóng)藥在蜜柚中的平均回收率為73.3%~108.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%~10.8%,方法定量限除螺螨酯、滅多威、吡蟲啉、苯醚甲環(huán)唑?yàn)?μg/kg,其余均為2μg/kg。該分析方法操作簡(jiǎn)單,操作過(guò)程耗時(shí)較短,有機(jī)溶液用量少,回收率和精密度均較高,符合農(nóng)藥殘留分析的要求[23],具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。