王曉潔，卑其成，劉 鋼，謝祖彬?

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049）

土壤是微生物的大本營，通常每克土壤中含有約十億個微生物細胞。目前，自然界中絕大多數(shù)微生物難以被分離培養(yǎng)，這極大地限制了人們對環(huán)境微生物生物多樣性及其功能的認識[1-2]。近年來，高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動了人們對微生物世界的認知。

國內(nèi)外學者對森林、草地、農(nóng)田等不同生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物的多樣性開展了廣泛研究[3-7]。大量的研究表明土壤微生物群落組成及其豐度受到多種因素的影響，如環(huán)境的理化性質(zhì)（土壤pH、碳氮比、含水量）、地上植被類型、外界氣候因素（降雨量、溫度）和自然因素（海拔、緯度）[8-13]。土地利用方式的改變、施肥方式和耕作方式的改變也會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度的變化[14-18]。

水稻土是長期水稻種植并且在翻耕和水肥管理措施下形成的一類獨特的土壤資源。水稻土發(fā)生、發(fā)展和發(fā)育過程，同樣也離不開土壤微生物的參與[19]。我國是世界上最主要的稻米產(chǎn)區(qū)之一，從南到北分布的水稻土類型復雜多樣。根據(jù)第二次土壤普查數(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國水稻土共分為潴育、淹育、滲育、潛育、脫潛、漂洗、鹽漬及咸酸水稻土8個亞類，共114個土屬。研究發(fā)現(xiàn)，生活在水稻根際的土壤微生物，有的可以通過生物固氮作用為植株提供氮素，有的可以分泌鐵載體活化鐵元素，有的可以分泌生長激素促進植物生長[20]。因此，了解水稻土中微生物資源狀況對維持土壤的生產(chǎn)力具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究選取基于我國土壤地理發(fā)生分類的不同類型土壤發(fā)育的四種水稻土，利用15N2氣體示蹤法測定生物固氮速率，通過提取稻田土壤總DNA，借助高通量測序Illumina Hiseq平臺，以16S rRNA基因為分子標靶，揭示四種類型水稻土中細菌群落的數(shù)量、組成及多樣性，分析細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系，分析影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因子。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及理化性質(zhì)測定

本研究供試土壤為：（1）下位砂姜土發(fā)育的水稻土，（2）紅壤發(fā)育的水稻土，（3）黑土發(fā)育的水稻土，（4）紫色土發(fā)育的水稻土。于2014年4月分別在江蘇江都（32°35′48″N，119°42′49″E）、江西鷹潭（28°12′28″N，116°56′13″E）、吉林長春（44°04′16″N，125°44′16″E）和四川鹽亭（31°16′14″N，105°28′27″E）四個省份的長期種植水稻的稻田采集耕作層土壤（0～15 cm）。風干過2 mm篩，去除根系及石子等，室溫保存。土壤基本理化指標測定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[21]。pH采用酸度計法（土水比1︰5）測定，有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定，堿解氮采用堿解擴散法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度計法測定。

1.2 土壤固氮菌固氮速率測定

采用同位素標記15N2氣體示蹤法，將水稻盆栽密閉于智能植物生長箱，定量計算單位時間單位面積土壤中固氮菌固定的氮量[22]。每個盆缽（12 cm×12 cm×20 cm）內(nèi)種植1株水稻（武運粳23），裝土2.6 kg。以4種水稻土類型為4個處理，并設(shè)置3份重復。42 d后，采集土壤樣品（0～1 cm、1～2 cm、2～5 cm、5～15 cm），取一份土樣烘干后用于測定土壤全氮的含量及15N atom%豐度，另一份土樣于-20℃保存，用以土壤DNA提取。

1.3 土壤DNA提取

準確稱取0.5 g鮮土樣，采用FastDNA Spin kit for soil（MP Biomedicals，Cleveland，OH，USA）試劑盒和FastPrep-24核酸提取儀（MP Biomedicals，CA，USA），按照操作手冊提取土壤樣品的DNA。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳測定DNA質(zhì)量，ND-1000 UV-Vis 微量紫外/可見分光光度計（NanoDrop ND-1000，NanoDrop Technologies，Wilmington，USA）測定DNA純度和濃度，然后將提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量PCR法在Applied Biosystems?7500 Real-Time PCR system定量PCR儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster，CA，USA）上測定不同類型水稻土細菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)。擴增引物為細菌通用引物341F（CCTACGGGAGGCAGCAG）/518R（ATTACCGCGGCTGCTGG），反應體系為16 μL，主要包括：模板DNA 8 μL，引物各0.5 μL，SYBR Green 7 μL。構(gòu)建目的基因標準質(zhì)粒，計算目的基因拷貝數(shù)，以10倍稀釋法建立標準曲線。擴增程序：95℃預變性10 min；95℃變性10 s；60℃退火34 s；72℃延伸45 s，40個循環(huán)，并采集分析溶解曲線。實時熒光定量PCR標準曲線的擴增效率為93.0%，R2=0.99。

1.5 16S rRNA基因的高通量測序

利用細菌通用引物341F（CCTACGGGAGGCA GCAG）/518R（ATTACCGCGGCTGCTGG）對樣品DNA的16S rRNA的V3區(qū)域進行擴增，擴增條件：95℃，3 min；25循環(huán)×（95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min；在4℃下保存，進行普通PCR擴增。將PCR產(chǎn)物用磁珠AMPure XP beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化后進行加Nextera XT Index測序標簽的普通PCR擴增，擴增條件：95℃，3 min；8循環(huán)×（95 ℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min；在4 ℃下保存，PCR產(chǎn)物再次用磁珠純化，將構(gòu)建好的每個DNA樣品的文庫按照DNA定量試劑盒Qubit dsDNA HS Assay Kit說明書在熒光定量儀（Qubit 2.0 Fluorometer）上測定濃度，均一化后等體積混合，將混合好的文庫在2%普通瓊脂糖凝膠上電泳，電壓120 V，電泳60 min。在紫外透射儀上用刀片將相應的目標片段切割下來，利用膠回收試劑盒（Qiagen MinElute Gel Extraction Kit）進行回收純化。最終構(gòu)建好的文庫在Illumina Hiseq 2500測序儀上機測序，測序讀長為2×250 bp。Hiseq文庫的構(gòu)建及測序在中國科學院上海植物逆境生物學研究中心基因組學平臺完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理

Hiseq測序得到的結(jié)果采用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME，version 1.9.0）、Mothur等軟件分析。首先對原始FASTQ文件進行質(zhì)控、拼接，然后將拼接后的序列進行過濾，去除嵌合體序列?；?7%相似度水平，通過聚類分析獲得不同可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。進一步抽取每個OTU的最優(yōu)勢序列作為代表性序列，與RDP提供的SILVA128數(shù)據(jù)庫進行比對并獲得分類信息。采用Mothur軟件計算多樣性指數(shù)。使用R軟件基于Bray-Curits距離算法進行聚類分析。采用非度量多維尺度（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析樣品間群落結(jié)構(gòu)差異。采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行皮爾森相關(guān)性分析（Pearson correlation）和單因素方差分析（One-way ANOVA），差異顯著性檢驗采用Tukey法（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 四種類型水稻土的理化性質(zhì)及生物固氮能力

本試驗中，紅壤發(fā)育的水稻土pH最低，與其他三種類型土壤發(fā)育的水稻土相比，具有較高的有機碳、堿解氮和有效磷含量（表1）。四種類型的水稻土經(jīng)過42 d的田間原位15N2培養(yǎng)后，計算所得其土壤生物固氮速率如圖1所示。四種水稻土的生物固氮速率由大到小依次為：紫色土、下位砂姜土、黑土和紅壤。其中，紫色土發(fā)育的水稻土生物固氮作用最為活躍，尤其在土壤表層（0～1 cm）其生物固氮速率達3.2±0.7 mg·kg-1·d-1，并且顯著高于其他三個土壤層次檢測到的生物固氮速率（圖1）。

表1 四種類型水稻土的理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of the four types of paddy soils

2.2 四種類型水稻土的細菌豐度和群落多樣性

針對生物固氮速率最高的表層土壤（0～1 cm），采用實時熒光定量PCR測定不同類型水稻土微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)，結(jié)果見圖2。四種類型水稻土中的細菌豐度范圍在1.8×107～6.7×109copies·g-1干土。其中，紅壤發(fā)育的水稻土中細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)最多，達（6.7±1.7）×109copies·g-1干土，顯著高于其他三種水稻土（P＜0.05）。

Illumina高通量測序結(jié)果顯示，12個土壤樣品共獲得有效序列666 738條，可分為13 097個OTU。每個測序樣品平均序列55 562±9 298條。根據(jù)樣品最少序列數(shù)，將12個樣品統(tǒng)一抽樣至38 715條序列進行下游分析。操作分類單元OTU數(shù)目和Chao 1指數(shù)反映物種豐富度。由表2可知，下位砂姜土發(fā)育的水稻土中土壤細菌Chao 1指數(shù)最高，達7 095±88。OTU數(shù)目與Chao 1指數(shù)顯示相同的趨勢，即下位砂姜土發(fā)育的水稻土中細菌OTU數(shù)目顯著高于其他三種土壤發(fā)育的水稻土（P＜0.05）。紅壤和紫色土發(fā)育的水稻土中細菌OTU數(shù)目和Chao 1指數(shù)均未達顯著差異。PD指數(shù)可反映土壤細菌群落的多樣性，四種水稻土中土壤細菌多樣性由高到低依次為：下位砂姜土、黑土、紫色土、紅壤。

表2 四種類型水稻土細菌豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)Table 2 Richness and diversity of the bacterial communities in the four types of paddy soils

2.3 四種類型水稻土的細菌群落組成

在門分類水平，四種類型水稻土的土壤微生物群落組成相似（圖3）。相對豐度≥1%的門類有11個，主要包含變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍藻門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes），約占各樣品序列總數(shù)的97%。相對豐度＜1%的門類約有40個，僅占各樣品序列總數(shù)的3%左右（圖3）。

變形菌門（Proteobacteria）是土壤中最為優(yōu)勢的菌群，相對豐度占30%左右。其次是酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和藍藻門（Cyanobacteria）。這四大優(yōu)勢類群共占總細菌群落的70%以上。進一步分析土壤細菌群落在屬水平的分布，結(jié)果表明相對豐度≥1%的菌屬中最為優(yōu)勢的6個類群，主要是歸屬于變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和藍藻門（Cyanobacteria）（圖4）。其中，厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）在紫色土發(fā)育的水稻土中的相對豐度顯著低于其他三種水稻土（P＜0.05）。細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）在紫色土發(fā)育的水稻土中相對豐度最高，約為紅壤發(fā)育的水稻土的6倍，其相對豐度顯著高于紅壤發(fā)育的水稻土（P＜0.05）（圖4）。

2.4 環(huán)境因子對水稻土的細菌豐度、群落多樣性及結(jié)構(gòu)的影響

通過分析四種類型土壤發(fā)育的水稻土中細菌的豐度與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤有機碳、堿解氮和有效磷含量則呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表3）。通過分析四種類型土壤發(fā)育的水稻土中細菌群落的物種豐富度和多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)OTU數(shù)目、Chao 1指數(shù)和PD指數(shù)均與土壤有機碳和堿解氮含量存在極顯著的負相關(guān)性（P＜0.01）（表3）。表明土壤有機碳和堿解氮含量顯著影響水稻土中細菌豐度和群落多樣性。利用非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）對四種類型水稻土的細菌群落的相似性進行二維排序，結(jié)果表明四種類型水稻土的細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（Stress＜0.001）（圖5）。相關(guān)性分析表明細菌群落結(jié)構(gòu)分異的NMDS1主軸（解釋度42%）與土壤pH呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）（表3），并且NMDS1主軸與優(yōu)勢類群厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）和細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）顯著相關(guān)（P＜0.05）（表4）。表明土壤pH影響水稻土中優(yōu)勢類群的分布，是影響細菌群落結(jié)構(gòu)分異的主要因子。

3 討 論

本研究采用高通量測序技術(shù)對四種不同類型土壤發(fā)育的水稻土中土壤細菌豐度和群落結(jié)構(gòu)進行了分析研究。前人研究表明，土壤有機碳含量能顯著影響土壤微生物的多樣性和功能[23]。土壤微生物是構(gòu)成土壤肥力的重要因素。較高的微生物豐度通常意味著土壤的營養(yǎng)供給充足，同時也具有較高的微生物活性。在本研究中，水稻土中細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤有機碳和堿解氮含量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.76，P＜0.01；r=0.74，P＜0.01）（表3）。紅壤發(fā)育的水稻土中的土壤細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于其他三種水稻土（圖2）。針對江西長期定位試驗的紅壤性水稻土的研究表明，長期施肥可增加土壤養(yǎng)分含量（如有機質(zhì)、全氮、有效磷和速效鉀），這在一定程度上能夠給土壤微生物帶來更多的碳源和營養(yǎng)元素[24-25]。前人研究發(fā)現(xiàn)施用化肥及有機肥與化肥配施均顯著提高了土壤細菌豐度[26]。在四種水稻土中，紅壤發(fā)育的水稻土的土壤有機碳、堿解氮和有效磷含量顯著高于其他三種類型水稻土（表1）。本研究中所采集的紅壤為長期水稻種植區(qū)的耕層土壤，長期耕種施肥提升了紅壤肥力，為微生物創(chuàng)造了良好的生存環(huán)境，進而刺激了微生物的生長和活動。因此，推測紅壤肥力較高可能是本研究中紅壤發(fā)育的水稻土中細菌豐度顯著高于其他三種水稻土的重要原因之一。

表3 土壤理化性質(zhì)與細菌豐度、群落多樣性及結(jié)構(gòu)的相關(guān)性Table 3 Relationships of soil properties with abundance，diversity and structure of the bacterial communities in the four types of paddy soils

目前已知絕大部分的細菌均適宜在中性環(huán)境（pH 7.0）中生存，僅少數(shù)細菌可以在極酸或極堿的環(huán)境下生長[27]。前人研究發(fā)現(xiàn)大分子（如DNA，蛋白質(zhì)）的生物過程受pH影響，pH的變化會引發(fā)蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象的改變而導致其生理活性的下降、喪失[28]。本研究中酸性紅壤發(fā)育的水稻土中的細菌豐富度指數(shù)（OTU數(shù)目和Chao 1指數(shù)）均顯著低于下位砂姜土和黑土，但是與中性紫色土發(fā)育的水稻土中的細菌豐富度指數(shù)無顯著差異（表2）。目前，微生物資源調(diào)查的研究發(fā)現(xiàn)土壤pH能夠顯著影響細菌的多樣性，并發(fā)現(xiàn)細菌群落的分布顯著受到土壤pH的影響[8，29]，土壤養(yǎng)分含量、溫度、水分等因素也均能夠影響微生物的群落組成、多樣性以及分布[3，9-10]。pH的改變會導致土壤營養(yǎng)元素（如磷、鉀）有效性的變化[13]，重金屬離子毒性的變化等[30]，這些均有可能會對細菌群落產(chǎn)生顯著的影響。由于底物生物可利用性的限制，進一步可能會使得具有特定碳源偏好性的微生物類群大量增殖，從而導致生態(tài)系統(tǒng)中群落多樣性丟失的風險增加。在酸性土壤中，尤其當土壤pH＜5時，無毒的難溶性鋁硅酸鹽或氧化鋁極易轉(zhuǎn)變?yōu)榻粨Q性鋁（主要是Al3+、Al（OH）2+和大量溶出的鋁離子會抑制植物根系伸長及其吸收功能[31]。同時有研究發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，鋁離子通過與ATP結(jié)合導致菌株細胞生理代謝失活[32]。因此，推測pH降低導致土壤鋁活化的毒害作用可能是本研究中酸性紅壤發(fā)育的水稻土中細菌多樣性降低的重要原因之一。

雖然固氮酶只有在厭氧條件下才能催化氮氣還原成氨，本研究中水稻土的生物固氮速率隨著土壤深度的增加而降低，表層土壤（0～1 cm）生物固氮速率顯著高于其他土壤層次（1～2 cm，2～5 cm，5～15 cm）。pH 7.7的中性紫色土和pH 6.1的中性下位砂姜土發(fā)育的水稻土表層土壤固氮作用較為活躍，而pH 5.4的酸性黑土和pH 4.9的酸性紅壤發(fā)育的水稻土表層土壤中的固氮作用則較為微弱。表明在一定的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，水稻土中的固氮作用也有著明顯的增強（r=0.82，P＜0.01）。在進一步分析四種水稻土中的細菌優(yōu)勢類群的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，土壤生物固氮速率和優(yōu)勢類群細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）（表4），并且土壤pH與優(yōu)勢類群厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）和細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）顯著相關(guān)（P＜0.05）（表4）。細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）隸屬于δ-變形菌亞綱，是一類已知具有nifH基因由固氮酶介導能將空氣中的氮氣還原為植物可利用氨的微生物[33]。對于固氮菌而言，生物固氮是一個高耗能的過程，固氮基因的表達與土壤中有效氮的含量密切相關(guān)[34-35]。當環(huán)境中有效氮富余的時候，固氮菌存在但是其固氮基因并不一定表達活性。Ma等[36]通過田間15N2氣體示蹤法結(jié)合穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù)（DNA-stable isotope probing）證實在稻田土壤中細鞘絲藻菌屬（Leptolyngbya）是生物固氮最主要的貢獻者之一。因此，推測酸性紅壤發(fā)育的水稻土表層土壤生物固氮作用弱于紫色土的原因可能在于，首先紫色土中性偏堿的土壤pH環(huán)境更有利于細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）大量繁殖，其次紅壤中較高的堿解氮含量抑制細鞘絲藻菌屬（Leptolyngbya）的固氮活性，可能導致紅壤發(fā)育的水稻土固氮速率顯著低于紫色土。此外在本研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢類群厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）與土壤有效磷含量顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表4）。已知厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）是一類典型的呼吸型鐵還原菌，具有代謝乙酸鹽的特質(zhì)，在厭氧條件下通過微生物異化Fe（Ⅲ）還原作用，能夠有效地競爭電子供體抑制水稻土中依賴乙酸鹽的產(chǎn)甲烷過程[37]。因此關(guān)于厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）的鐵還原能力與土壤有效磷含量的關(guān)系值得進一步深入研究。同時，重視細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）在水稻土細菌群落中的優(yōu)勢地位，對提升水稻土的生物固氮潛力和制定稻田生物固氮調(diào)控措施具有重要參考意義。

表4 土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢細菌類群的相關(guān)性Table 4 Relationships between the soil properties and dominant bacterial groups in the four types of paddy soils

4 結(jié) 論

本研究利用多種分子技術(shù)得出不同類型土壤發(fā)育的四種水稻土中細菌群落的數(shù)量、組成及多樣性的分布規(guī)律。四種類型土壤發(fā)育的水稻土細菌群落優(yōu)勢類群為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和藍藻門（Cyanobacteria）。四種類型土壤發(fā)育的水稻土細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。紅壤發(fā)育的水稻土中細菌豐度最高，群落多樣性最低。紫色土發(fā)育的水稻土具有最高的土壤生物固氮速率，其中優(yōu)勢類群細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）是潛在的生物固氮主要貢獻者。土壤pH、有機碳和堿解氮含量是顯著影響四種類型土壤發(fā)育的水稻土細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子。