董輝偉， 陳鄭珊， 王麗芳， 金 敏， 李君文， 楊 棟

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，它可由多種微生物引起，包括細(xì)菌、病毒和真菌等，是全世界發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一〔1-2〕。在住院過(guò)程中，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive care unit，ICU)，50%的危重癥患者發(fā)生院內(nèi)感染，其中，呼吸系統(tǒng)感染占60%以上，使得患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)成倍增加〔3〕。研究表明，來(lái)自受污染的示波器、旁路機(jī)、自來(lái)水和透析液等相關(guān)醫(yī)療設(shè)施或試劑的革蘭氏陰性菌傳播頻率越來(lái)越高〔4〕，各種導(dǎo)管的使用使患者易受革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌和放線菌等病原體侵害，氣管插管更是極易使患者患呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎。 病原體通常通過(guò)患者吸入口咽部分泌物進(jìn)入下呼吸道，是否發(fā)展為肺炎在很大程度上取決于患者的吸液量、吸入頻率以及吸入病原菌的接種量相對(duì)于宿主免疫的毒力。為探索細(xì)菌性感染肺炎的機(jī)制，首先要建立相關(guān)細(xì)菌的肺炎動(dòng)物模型。目前，各文獻(xiàn)報(bào)道的動(dòng)物肺炎模型多是單一菌種感染，而臨床常見(jiàn)的肺炎感染，尤其是醫(yī)院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)，往往都是多重細(xì)菌感染〔5〕。根據(jù)中國(guó)耐藥基因監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告，2019年全國(guó)臨床分離菌株排前兩位的分別為大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)，并且肺炎克雷伯菌同樣是呼吸系統(tǒng)分離菌株最常見(jiàn)的細(xì)菌〔6〕。本文通過(guò)氣管滴注大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌建立大鼠肺炎模型，更充分地模擬多重細(xì)菌感染性肺炎。

1 材料與方法

1.1 菌種大腸埃希菌MG1655(E.coli)，具有四環(huán)素抗性(本實(shí)驗(yàn)室保存)；肺炎克雷伯菌ATCC35657(Kpn)，具有美羅培南抗性(本實(shí)驗(yàn)室改造)。接種前過(guò)夜培養(yǎng)，離心后使用滅菌PBS重懸，使用多功能酶標(biāo)儀通過(guò)OD600 nm值測(cè)定，調(diào)節(jié)濃度至109 CFU/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組21只雄性SPF級(jí)SD大鼠(購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體質(zhì)量180-200 g，隨機(jī)分為7組，每組3只,觀察不同時(shí)間大鼠肺部感染情況。大鼠自由飲無(wú)菌水和進(jìn)食滅菌食物，屏障設(shè)備內(nèi)飼養(yǎng)條件嚴(yán)格控制 (溫度:20～25℃;濕度:50%～70%;光照/黑暗:12 h/12 h)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處理符合軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與樣本采集大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，將其豎立固定在操作臺(tái)，使用鑷子拉出大鼠舌頭, 用移液器從大鼠氣管注入300 μL等體積E.coli與Kpn混合菌液。接種后使大鼠保持直立位約30 s,以保證接種菌液被充分吸入肺部〔7〕。 在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、8 h、72 h)，使用戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉大鼠殺鼠取材，其中0 h組為對(duì)照組，灌菌后立即取材。通過(guò)心臟采血，加入EDTA抗凝管做血常規(guī)分析，而后將大鼠右上肺通過(guò)無(wú)菌縫合線結(jié)扎，只灌洗大鼠肺部其余部分，使用10 mL注射器共吸取20mL(第1次8 mL、第2次6 mL，第3次6 mL)滅菌PBS溶液對(duì)肺內(nèi)部進(jìn)行反復(fù)灌洗，取得支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)樣品并立即置于冰上，留取5 mL用于抗性篩查培養(yǎng)，其余全部?jī)龃嬗?80 ℃冰箱。將結(jié)扎的右上肺切除，放入4%多聚甲醛固定以進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色及病理分析。

1.4 平皿傾注法細(xì)菌計(jì)數(shù)分別將灌洗液取出1 mL加入9 mL滅菌PBS中稀釋10倍，依此方法將灌洗液稀釋成4個(gè)濃度梯度。將不同濃度梯度灌洗液分別取出1mL使用傾注法進(jìn)行抗生素抗性篩選。E.coli具有四環(huán)素抗性，但不具有美羅培南抗性，Kpn具有美羅培南抗性，但不具有四環(huán)素抗性。因此，含有四環(huán)素終濃度為60 mg/mL的平皿將篩選出E.coli，含有美羅培南終濃度為3 mg/mL的平皿將篩選出Kpn。

1.5BALF炎癥因子檢測(cè)使用ELISA試劑盒(四正柏生物科技有限公司)通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)BALF中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1-α(Interleukin-1α，IL-1α)、白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)水平變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析使用OriginPro 8.5對(duì)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行趨勢(shì)擬合分析。使用GraphPad Prism 7對(duì)不同時(shí)間段血細(xì)胞計(jì)數(shù)及BALF炎癥因子進(jìn)行One way ANOVA統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平皿傾注法BALF菌落計(jì)數(shù)經(jīng)平皿抗性篩查培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)E.coli數(shù)量(圖1A)、Kpn數(shù)量(圖1B)及兩者總數(shù)量(圖1C)在大鼠肺部呈指數(shù)下降，尤其在前6個(gè)小時(shí)減少速度最快，在72小時(shí)，大鼠肺部大部分加入細(xì)菌已被清除。

圖1 BALF菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)注：A.E.coli數(shù)量 B.Kpn數(shù)量 C.E.coli與Kpn總數(shù)量

2.2 血液中免疫細(xì)胞檢測(cè)與對(duì)照組比較，各組血液中白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(Neu)、淋巴細(xì)胞(Lym)水平均略有升高，在48 h相對(duì)較高，而后在72 h出現(xiàn)下降(圖2A、圖2B、圖2C)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)注：A.白細(xì)胞數(shù)量 B.中性粒細(xì)胞數(shù)量 C.淋巴細(xì)胞數(shù)量

2.3BALF炎癥因子變化通過(guò)對(duì)大鼠BALF中炎癥因子TNF-α、IL-1α、IL-6水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BALF中上述炎癥因子均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中，TNF-α、IL-6在3 h、6 h和對(duì)照組有顯著差異，且在6 h左右達(dá)到峰值；IL-1α在6 h、12 h和對(duì)照組有顯著差異，也在6 h左右達(dá)到峰值。見(jiàn)圖3。

圖3 BALF炎癥因子變化注：A.TNF-α濃度 B.IL-1α濃度 C.IL-6濃度

2.4 肺組織病理分析對(duì)不同時(shí)間組肺組織固定并進(jìn)行H&E染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組正常肺組織結(jié)構(gòu)相比，3 h肺泡間質(zhì)輕微增厚,但未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；6h部分肺泡萎縮塌陷，肺組織輕度實(shí)質(zhì)化并可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織病理?yè)p傷進(jìn)一步加重，在48 h，肺組織整體結(jié)構(gòu)異常，肺泡萎縮塌陷進(jìn)一步加重，肺輕度實(shí)質(zhì)化伴明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)；72 h肺損傷與48 h基本一致。

圖4 大鼠肺組織病理注：A.0 h B.3 h C.6 h D.48 h

3 討論

醫(yī)院獲得性肺炎是肺炎最常見(jiàn)的類(lèi)型，在歐洲每年發(fā)生多達(dá)50萬(wàn)例〔8〕。在我國(guó)，根據(jù)Xiong等報(bào)道，在696例醫(yī)院感染患者標(biāo)本中共檢出病原菌1872株,其中下呼吸道感染占比約40%，感染的細(xì)菌中又以Kpn為主，占比約20%〔9〕。根據(jù)Che等報(bào)道，臨床108例多重耐藥菌感染的患者中,共檢出病原菌130株,其中呼吸系統(tǒng)感染占比75%，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌為主〔10〕。 HAP往往導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療后果，包括住院時(shí)間延長(zhǎng)，長(zhǎng)期體質(zhì)虛弱和抑郁以及死亡率增加〔11〕。HAP也給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，在歐洲，每次治療的平均費(fèi)用為4萬(wàn)歐元，在美國(guó)，每年的醫(yī)療費(fèi)用達(dá)到80億美元〔12〕。當(dāng)前，預(yù)防和治療HAP主要是通過(guò)使用抗生素減少呼吸系統(tǒng)細(xì)菌載量〔5〕。但HAP往往感染不止一種細(xì)菌，尤其隨著各種耐藥細(xì)菌病原體的出現(xiàn)，HAP的治療將變得更加困難，其中在重癥患者中，臨床治愈率通常不超過(guò)70%〔13〕。在未來(lái)十年內(nèi)，預(yù)防和治療HAP的效率將變得更低〔14〕。 建立有效的動(dòng)物感染模型是研究細(xì)菌性肺炎的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中大鼠氣管滴注加入的細(xì)菌含有特定抗生素抗性，用含特定抗生素的培養(yǎng)基能夠較好地區(qū)分出加入細(xì)菌在大鼠肺部的數(shù)量變化，并排除支氣管土著菌或環(huán)境中其他細(xì)菌的干擾。本研究發(fā)現(xiàn)，E.coli和Kpn在大鼠氣管滴注后均快速被殺滅或清除，尤其在前6小時(shí)減少最快，充分地反映了呼吸系統(tǒng)對(duì)外來(lái)病原體強(qiáng)大的防御能力。 目前對(duì)于不同品系大鼠的血細(xì)胞數(shù)量并沒(méi)有統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)，與人血液中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞中占比高不同，大鼠白細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞占比更高，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致〔15-16〕。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠肺部染菌后，血細(xì)胞中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均略有升高，且在48 h達(dá)到相對(duì)較高水平，在72 h出現(xiàn)下降。

在大鼠感染細(xì)菌后，淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的多肽調(diào)節(jié)因子，可被多種刺激物誘導(dǎo)發(fā)生，在炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類(lèi)細(xì)胞因子。其中，IL-1α能夠促進(jìn)趨化因子及其他細(xì)胞因子的分泌,誘導(dǎo)其下游的炎癥介質(zhì)合成及表達(dá)，激發(fā)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)等〔17〕；IL-6可起到刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能等。我們發(fā)現(xiàn)，在BALF中炎癥因子反映炎癥變化較迅速，在肺部染菌后3 h即開(kāi)始出現(xiàn)，6 h左右達(dá)到峰值。隨接種時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肺內(nèi)外源細(xì)菌被逐漸清除，炎癥因子水平也不斷下降，基本能夠反映肺部早期急性炎癥感染變化。

經(jīng)肺組織病理分析發(fā)現(xiàn)，在染菌后3 h即出現(xiàn)肺泡間質(zhì)輕微增厚，但未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，6 h可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞并出現(xiàn)肺組織輕度實(shí)質(zhì)化改變。之后雖然大鼠肺內(nèi)加入的細(xì)菌數(shù)量已經(jīng)大量減少，但是肺組織病理變化卻進(jìn)一步加重。肺泡萎縮塌陷、肺實(shí)質(zhì)化進(jìn)一步加重并伴明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。反映了在大鼠肺部細(xì)菌被清除之后，其炎癥反應(yīng)帶來(lái)的損傷并沒(méi)有隨之減弱，反而在短期內(nèi)會(huì)進(jìn)一步加重。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管滴注大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌混合菌液，探究了外源細(xì)菌在大鼠肺部的數(shù)量變化情況，對(duì)支氣管與肺泡灌洗液中炎癥因子水平與肺組織病理分析，結(jié)果表明大鼠肺部炎癥明顯，為后續(xù)研究多重細(xì)菌感染性肺炎奠定了基礎(chǔ)。