劉雅慧，朱龍英，楊學(xué)東，朱為民，張 輝，張迎迎

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403）

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要的蔬菜作物和模式植物，具有重要的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值［1］。糖度是影響番茄品質(zhì)性狀的主要因子，也是影響其風味品質(zhì)的重要因素［2］，番茄重要性狀基因已成為目前的研究熱點之一。

蔗糖作為植物光合作用的主要產(chǎn)物，是植物生長、發(fā)育及防護的主要碳資源。高等植物中，蔗糖的合成受多種酶控制，其中包括蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase, SPS），它以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）為供體，催化6-磷酸果糖合成6- 磷酸蔗糖；6- 磷酸蔗糖再在蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphate Phosphatase, SPP）的催化下水解脫磷酸形成蔗糖。該反應(yīng)中的SPS 是植物體內(nèi)控制蔗糖合成的限速酶［3］，SPS 參與植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成，其活性直接反應(yīng)了植物體內(nèi)蔗糖合成的能力［4］。在柑橘、甘蔗、玉米和荔枝中已證實，植物體內(nèi)蔗糖的積累與SPS 的活性呈正相關(guān)［5-8］。最初，認為SPS 是以單基因形式存在于植物體內(nèi)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)高等植物中存在多個SPS 同工酶，而且屬于不同的家族，單子葉植物中含4 個SPS 家族，雙子葉植物中含有3 個SPS 家族，由此暗示著不同的SPS 在植物中的功能產(chǎn)生了分工與合作［4, 9-11］。

研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)不同的SPS 家族基因的表達特性不同，所發(fā)揮的功能也存在著共性和差異性。反義表達CmSPS1的轉(zhuǎn)基因甜瓜蔗糖含量下降、果實變小［12］；轉(zhuǎn)菠菜SPS基因的棉花表現(xiàn)出更高的蔗糖/淀粉比率，棉花纖維細胞次生壁增厚，品質(zhì)提高［13］；轉(zhuǎn)玉米SPS基因的馬鈴薯葉片SPS活性提高，葉片抗衰老，產(chǎn)量增加、蔗糖含量提高［14］。南極發(fā)草在南極夏天長白晝的環(huán)境下，SPS 活性極高，蔗糖超量積累從而適應(yīng)極端寒冷氣候［15］。低溫處理下獼猴桃果實的SPS基因轉(zhuǎn)錄水平提高［16］。干旱促進水稻中SPS 活性增加［17］。高鹽處理下的玉米秧苗的SPS活性增加［18］。本研究將番茄中的1 個SlSPS基因轉(zhuǎn)化擬南芥進行異源過量表達，并對轉(zhuǎn)基因的擬南芥進行表型觀察發(fā)現(xiàn)，揭示SlSPS基因影響植物生長發(fā)育和蔗糖積累的生物學(xué)功能，對番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)改良及其生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材和培養(yǎng)方法

以擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0生態(tài)型作為遺傳轉(zhuǎn)化的材料和對照組。野生型和轉(zhuǎn)基因植株的種子經(jīng)消毒后在1/2 MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)，1 周后移栽至穴盤中，于25 ℃，濕度50%～60%的人工氣候室培養(yǎng)。

1.2 基因克隆、蛋白比對與載體構(gòu)建

番茄蔗糖磷酸合成酶基因SlSPS的編碼序列CDS從茄科基因組網(wǎng)站上獲得（Solyc07g007790, https://solgenomics.net/），擬南芥同源基因序列從擬南芥信息網(wǎng)站上獲得（TAIR, https://www.arabidopsis.or g/）。蛋白比對通過ClustalW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw） 和ESPript3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）完成。從cDNA文庫中擴增該基因后，以內(nèi)切酶KpnI 和XbaI 為酶切位點，設(shè)計酶切引物 SlSPS-CDS-F-KpnI，SlSPSCDS-R-XbaI（表 1），通過酶切連接構(gòu)建到植物雙元表達載體pCAMBIA1300-35S 的多克隆位點上（該載體以pCAMBIA1300 為骨架，插入35S 啟動子于MCS 前，載體由本實驗室保存），得到以CaMV 35S 啟動子和SlSPS基因的CDS 融合的表達載體。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

SlSPS基因過表達載體pCAMBIA1300-35SSlSPS 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 后，通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-0，獲得獨立轉(zhuǎn)化株系。經(jīng)過潮霉素抗性培養(yǎng)基的篩選后，利用PCR 擴增潮霉素基因、SlSPS基因（鑒定引物見表1）鑒定陽性幼苗后，隨后通過實時熒光定量PCR 鑒定SlSPS1基因的表達量。所獲得的3 個獨立轉(zhuǎn)化株系用于后續(xù)的試驗研究。

表1 鑒定轉(zhuǎn)基因植株的PCR 引物Table1 Primer sequence for identification of transgenic lines

1.4 表達量鑒定

取10 d 期野生型和T3 代轉(zhuǎn)基因擬南芥的整株幼苗，經(jīng)液氮速凍后研磨，采用翊圣植物RNA 提取試劑盒提取RNA，然后使用翊圣反轉(zhuǎn)錄酶Hifair?II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR(gDNA digester plus） 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 針對SlSPS基因的CDS 設(shè)計引物（表達量鑒定引物見表1），以Actin2基因為對照，在Applied Biosystems QuantStudio 5 系統(tǒng)上進行qPCR 檢測。通過相對定量2—ΔΔCT法分析結(jié)果。

1.5 蔗糖、可溶性糖及酶活測定

蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化，在480 nm 下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的深淺成正比。在野生型和T3 代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗生長4周時，將同一獨立轉(zhuǎn)化株系的3 株長勢一致的蓮座葉同一部位的葉片混合取樣，液氮研磨勻漿。蔗糖測定采用間苯二酚法測定，可溶性糖測定采用蒽酮比色法，蔗糖磷酸合成酶酶活測定采用間苯二酚法測定。上述測定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒，于可見光分光光度計下測定。

1.6 表型鑒定

表型鑒定采用野生型和T3 代轉(zhuǎn)基因植株進行分析。擬南芥放在人工氣候室（溫度25 ℃，14 h 光照/10 h 黑暗），從種子萌發(fā)后3 d 開始觀察分析，轉(zhuǎn)基因植株和野生型的成苗高度、根長、果莢通過直尺或游標卡尺進行測量。同時將不同的材料在黑暗下培養(yǎng)7 d 測定下胚軸長度。取長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因植株各10 株，進行比較和測量。成苗高度和果莢在6 周時測量，根長和下胚軸長度在1 周時測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥過表達番茄蔗糖磷酸合成酶基因SlSPS的克隆及轉(zhuǎn)基因植株的獲得和鑒定

根據(jù)已報道的蔗糖磷酸合成酶的蛋白序列，在茄科植物基因組網(wǎng)站中進行了同源比對，結(jié)合最新的番茄基因組注釋ITAG4.0（ftp://ftp.solgenomics.net/tomato_genome/annotation/ITAG4.0_release/），獲得了番茄中蔗糖磷酸合成酶基因的基因號（Solyc07g007790）及其序列。對其序列和擬南芥中SPS基因（At5g11110）進行蛋白同源性比對發(fā)現(xiàn)，其蛋白相似度達到69.29%（圖1A）。通過基因合成，將SlSPS基因的CDS 區(qū)域經(jīng)PCR 擴增后通過酶切連接的手段克隆到植物雙元表達載體pCAMBIA 1300-35S 上，并測序驗證，得到pCAMBIA1300-35S-SlSPS載體(圖1C)。載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌后進行遺傳轉(zhuǎn)化，得到T0 代幼苗。對T0 代幼苗的基因組DNA 進行PCR 擴增，利用潮霉素抗性基因和目標基因SlSPS基因，篩選陽性幼苗。對T3 代幼苗進行了SlSPS基因表達量鑒定，其中，獲得了3 個表達量顯著上調(diào)的獨立轉(zhuǎn)化株系SlSPS-OE20,SlSPSOE44 和SlSPS-OE60（圖1B），用于后續(xù)的表型分析和生理指標檢測。

圖1 SlSPS 蛋白比對及表達量分析Fig.1 Alignment of SlSPS protein sequence and expression level analysis

2.2 過表達SlSPS 基因擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中蔗糖磷酸合成酶活性提高

對轉(zhuǎn)基因植株蔗糖磷酸合成酶的酶活測定后，進一步驗證在擬南芥中過表達SlSPS基因的酶活性（圖2A）。過表達轉(zhuǎn)基因株系均呈現(xiàn)出蔗糖磷酸合成酶活性升高的趨勢。3 個獨立轉(zhuǎn)化株系的酶活與野生型相比提高了20%～30%。該結(jié)果表明過表達番茄SlSPS基因能夠提高擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖磷酸合成酶的活性，正常行使SlSPS基因預(yù)測的生物學(xué)功能。

2.3 過表達SlSPS 基因擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖、可溶性糖的含量顯著上升

蔗糖磷酸合成酶是蔗糖合成過程的關(guān)鍵限速酶?？扇苄蕴前ㄆ咸烟?、果糖、蔗糖，是番茄品質(zhì)的重要構(gòu)成性狀之一。通過對過表達SlSPS基因在轉(zhuǎn)基因植株中蔗糖、可溶性糖含量的測定，進一步挖掘SlSPS基因的直接生化功能。對擬南芥生長4 周幼苗葉片中的蔗糖、可溶性糖進行測定（圖2），結(jié)果表明：與野生型Col-0 相比（0.673 μmol/mgprot），過表達轉(zhuǎn)基因植株中的蔗糖含量（1.269 μmol/mgprot，1.148 μmol/mgprot，1.104 μmol/mgprot） 顯 著 提高；轉(zhuǎn)基因植株中的可溶性糖的含量（7.155 mg/g，7.692 mg/g，7.302 mg/g）也顯著高于野生型Col-0（5.962 mg/g）。這表明過表達SlSPS基因提升了擬南芥中蔗糖的含量，同時可溶性糖的含量也隨之升高。

圖2 轉(zhuǎn)基因和野生型植株中蔗糖磷酸合成酶酶活、蔗糖和可溶性糖水平分析Fig.2 Analysis of sucrose phosphate synthase activity and content of sucrose and soluble sugar in transgenic lines and wild type Col-0

2.4 過表達SlSPS 基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的株型增大

過表達SlSPS基因不僅提高了擬南芥中SPS 的活性，蔗糖和可溶性糖的含量，還進一步促進了轉(zhuǎn)基因植株的株型。選取種子萌發(fā)后5 d（5 days after germination， 5DAG）（ 圖3 A），1 周（1 week）（圖3E），10 d(10 days after germination, 10DAG) （圖3B），2 周（2 week）（圖3F），4 周（4 weeks）（圖3C）和6 周（weeks）（圖3D）的植株觀察葉片和株型大小。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株從營養(yǎng)生長期至生殖生長期，其植株大小，包括葉片大小、根長、蓮座和成苗高度，相較于野生型都增大。5DAG 時即出現(xiàn)明顯的葉片增大的表型。1 周時測量根長，相較于野生型其根長顯著伸長了12.15%（圖3H）。2 周時，其株型大小和每片葉的大小都增大。到了6 周時，其成苗高度升高了24.69%，顯著高于野生型（圖3G）。以上結(jié)果表明過表達SlSPS基因促進了擬南芥整個生育期的株型增大，其葉片、根長和成苗高度都顯著增大。

圖3 過表達SlSPS 基因轉(zhuǎn)基因植株的表型分析Fig.3 Phenotype analysis of transgenic lines with overexpression of SlSPS gene

2.5 過表達SlSPS 基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株黑暗下下胚軸顯著伸長

為了探究過表達SlSPS基因?qū)M南芥暗形態(tài)建成的影響，將消毒后的種子培養(yǎng)于1/2 MS 培養(yǎng)基上避光垂直培養(yǎng)，觀察和測量其下胚軸（圖4）。如圖所示，暗培養(yǎng)下轉(zhuǎn)基因植株的下胚軸顯著長于野生型，增加了17.09%。表明過表達SlSPS基因能促進暗形態(tài)建成。

2.6 過表達SlSPS 基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株花和果莢增大，種子也變大

通過對花蕾（圖5A、B）、果莢（圖5D）和種子大小（圖5C）的觀察和測量，以探究過表達SlSPS基因?qū)τ谏称鞴侔l(fā)育的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的花蕾更大，其果莢長度顯著長于野生型，增長了25.17%（圖5E）。此外，轉(zhuǎn)基因植株的種子也大于野生型（圖5）。以上結(jié)果表明，過表達SlSPS基因能夠促進擬南芥中生殖器官的變大。

圖4 暗培養(yǎng)下過表達SISPS 基因轉(zhuǎn)基因植株下胚軸長度差異Fig.4 The significant elongation of hypocotyls of transgenic lines with overexpression of SISPS gene in dark culture

圖5 過表達SlSPS 基因轉(zhuǎn)基因植株的生殖器官表型Fig.5 Phenotypes of reproductive organs of transgenic lines with overexpression of SlSPS gene

3 結(jié)論與討論

蔗糖是植物光合作用的重要產(chǎn)物，同時參與生長發(fā)育過程中的合成和代謝過程。番茄中蔗糖參與其產(chǎn)量和風味品質(zhì)的形成。而蔗糖磷酸合成酶是蔗糖合成過程中的關(guān)鍵限速酶，其活性與植物體內(nèi)蔗糖合成能力直接相關(guān)。本研究在擬南芥中異源表達番茄蔗糖磷酸合成酶基因SlSPS，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中，SlSPS基因表達量顯著上調(diào)，且SPS 酶活性、蔗糖和可溶性糖含量顯著升高；表型分析結(jié)果顯示擬南芥轉(zhuǎn)基因植株增大，其中包括根長伸長、葉片增大、蓮座大小增大、成苗高度增高；暗形態(tài)建成中下胚軸顯著伸長；生殖器官（花蕾、果莢、種子）大小增大。以上結(jié)果表明，在擬南芥中過表達番茄SlSPS基因能夠提高SPS 酶活、蔗糖和可溶性糖含量，增強暗形態(tài)建成，促進植株的營養(yǎng)器官和生殖器官的增大，全面提高植株大小。

異源表達SlSPS基因促進了擬南芥中SPS 酶活增加、蔗糖含量提高，這與基因注釋的功能吻合。同時，已報道的研究中，證實了在柑橘、甘蔗、玉米和荔枝中，植物體內(nèi)蔗糖的積累與SPS 的活性呈正相關(guān)［5-8］；反義表達SPS基因的轉(zhuǎn)基因甜瓜蔗糖含量下降［12］；轉(zhuǎn)菠菜SPS基因的棉花表現(xiàn)出更高的蔗糖/淀粉比率，棉花纖維細胞次生壁增厚，品質(zhì)提高［13］；轉(zhuǎn)玉米SPS基因的馬鈴薯葉片SPS 活性提高，產(chǎn)量增加、蔗糖含量提高［14］。本試驗結(jié)果進一步說明，SlSPS基因與其他物種中的同源基因具有相同或相似的功能，均能夠提高SPS 活性，促進蔗糖的合成。此外，本研究發(fā)現(xiàn)可溶性糖水平也得到提高，說明蔗糖含量提高并不影響其他可溶性糖的合成，比如果糖、葡萄糖。我們進一步推測SPS 催化蔗糖合成對其他可溶性糖合成沒有反饋抑制的影響，說明SPS基因可以應(yīng)用于提高作物中蔗糖和可溶性糖的含量，從而提高糖分積累，改良產(chǎn)量和品質(zhì)。

為了適應(yīng)土壤中的生長環(huán)境，幼苗形態(tài)發(fā)育為暗形態(tài)建成，表現(xiàn)為下胚軸快速向上伸長，子葉擴展被嚴格抑制并閉合，減少向上生長所遇到的土壤阻力。幼苗出土后，下胚軸伸長抑制，子葉快速打開和擴展，以吸收更多陽光，實現(xiàn)光合自養(yǎng)生長。幼苗出土前后的形態(tài)建成巨變，與所處土壤環(huán)境的劇變緊密聯(lián)系，是研究植物適應(yīng)環(huán)境的經(jīng)典模型［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)過表達SlSPS基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗，相較于野生型，具有更加突出的暗形態(tài)建成的表型，具有更顯著的下胚軸伸長。這表明SlSPS基因可以促進暗形態(tài)建成，可能使得種子破土而出的存活能力提高，活力增強。

過表達SlSPS基因使得擬南芥植株的營養(yǎng)器官和生殖器官都變大。在其營養(yǎng)生長時期，其幼苗根變長，蓮座葉片增大，成苗高度增高；而在其生殖生長時期，其花蕾、果莢和種子的大小都增大。這表明SlSPS基因能夠在整個生育期促進植株株型變大。SPS 可作為高糖積累的生化指標［20］。在幼苗期，通過促進根的伸長提高對水分和無機鹽的吸收，通過促進葉片的增大提高了光合作用的效率,由此可能促進能量的累積，增強了碳的固定，進而促進了生殖器官的增大。因此，我們推測過表達SlSPS基因通過促進根的伸長、葉片增大從而提高對營養(yǎng)物質(zhì)的固定，促進生殖器官的發(fā)育，從而使得植株生長更加旺盛，提高產(chǎn)量。

綜合本研究結(jié)果，在擬南芥中異源過表達SlSPS基因能夠提高SPS 酶活性、蔗糖和可溶性糖含量，增強暗形態(tài)建成，推測可能提高了能量的累積，同時促進植株的營養(yǎng)器官和生殖器官的增大。本研究有助于對SlSPS的基因功能及其參與蔗糖合成以及下游代謝機制的研究，從而挖掘該基因?qū)χ参锷L發(fā)育的影響，并說明SlSPS基因可以用于改良番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，為分子設(shè)計育種提供遺傳資源。