含牛輪狀病毒VP6 的嵌合型HBcAg 顆?？乖闹苽浼捌涿庖咴苑治?/h1>
2021-07-24 04:36:20邢亞茹張增賢顧文源彭志豪左玉柱范京惠
河北農(nóng)業(yè)大學學報 2021年3期
邢亞茹，張增賢，顧文源，郭 禹，彭志豪，左玉柱，范京惠
（1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071001; 2. 寧晉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 寧晉 055550; 3. 河北省動物疫病預防控制中心，河北 石家莊 050035; 4. 河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）
牛輪狀病毒（Bovine rotavirus,BRV）是犢牛腹瀉的重要病原之一。1968 年Mebus 等首次從新生犢牛腹瀉糞便中分離到NCDV 株，并證實BRV 是引發(fā)新生犢牛腹瀉的主要病原［1］。1980 年福建畜牧獸醫(yī)研究所研究證實BRV 也存在于我國牛群中［2］。目前BRV感染在全球范圍內(nèi)流行，嚴重威脅著全世界養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展［3］，因此有必要加強對BRV 的及時監(jiān)測和防治。而預防BRV 的主要手段就是通過疫苗進行免疫接種，常見的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。世界范圍內(nèi)唯一的商品化BRV 減毒疫苗（NCDV-lincoln 株）已經(jīng)獲得USDA 的批文［4］。近年來，隨著科學技術的不斷進步和發(fā)展，基因工程疫苗也得到快速的發(fā)展，如嵌合疫苗、轉(zhuǎn)基因疫苗和亞單位疫苗等。
RV 由外層衣殼、內(nèi)層衣殼和核心衣殼3 層衣殼蛋白組成，分別編碼（VP1 ～VP4、VP6、VP7）6 種結(jié)構(gòu)蛋白和（NSP1 ～NSP6）6 種非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。VP6 蛋白可以在組裝病毒顆粒的過程中讓VP4 和VP7 空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而增強外殼蛋白的免疫原性。同時VP6 蛋白可以針對不同輪狀病毒毒株產(chǎn)生交叉保護性免疫應答，這對BRV 疫苗的研制具有重要意義［6］。
1986 年，Newton SE 和Clarke 等人首次報道了HBcAg 可作為VLP 載體，用于包裝外源的口蹄疫病毒片段，并通過實驗證明可獲得良好的免疫保護效果，這為表達其他外源性抗原提供了可能［7-9］，同時HBcAg 在許多表達系統(tǒng)中都能高水平表達，如在人HeLa 細胞、腺病毒載體表達系統(tǒng)及細菌（大腸桿菌、沙門氏菌等）表達系統(tǒng)中都能有效表達［10-11］。因此，本研究以HBcAg 作為載體蛋白，在其主要免疫優(yōu)勢區(qū)插入VP6 序列，經(jīng)誘導后在大腸桿菌中表達獲得重組HBc-VP6 蛋白，并在小鼠模型組中檢測重組蛋白的免疫原性，為今后研制BRV 疫苗提供重要的參考。
1 材料與方法
1.1 材料和試劑
pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 陽性質(zhì)粒由王家鑫老師惠贈；pET32a 空質(zhì)粒由本實驗室保存；BRV病毒陽性血清由本實驗室收集保存；pMD19-T 載體、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α 和BL21 感受態(tài)菌細胞均購自寶生物（大連）有限公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；小鼠細胞因子ELISA 檢測試劑盒為北京綠源伯德生物科技有限公司產(chǎn)品；BALB/c 小鼠購自斯貝福實驗動物科技有限公司。
1.2 引物的設計與合成
根據(jù)BRV（登錄號MN047454）VP6 基因和乙肝病毒核心抗原基因序列（KC774394），設計上下游引物PCR.擴增所需的片段（見表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.3 融合基因的擴增與重組表達載體的構(gòu)建
以pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 為 模 板，使用引物P5 及P6 擴增F3 片段，即HBcAg（編碼83 ～144 aa）基因，膠回收PCR 擴增產(chǎn)物利用XhoⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切回收并連接至pET32a 載體上，獲得pET32a- HBcAg(編碼83 ～144aa)重組質(zhì)粒。同理利用P1 和P2 為引物擴增F1 片段，即HBcAg（編碼1 ～74 aa），使用引物P3 及P4 擴增F2 片段，即VP6 基因。通過Overlap PCR 法將F1 和F2 片段融合擴增得到HBcAg(編碼1 ～74aa)-VP6基因，膠回收PCR 擴增產(chǎn)物利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切回收并連接至pET32a-HBcAg (編碼83 ～144 aa)重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6。
1.4 重組蛋白的表達及純化
將測序正確的陽性菌液培養(yǎng)至OD600nm為0.6 ～0.8 時，加入誘導劑IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌體。超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳，觀察目的蛋白的表達情況。超聲裂解收集誘導的菌體沉淀按照蛋白純化試劑盒說明書進行純化。將純化后的蛋白溶液加入透析袋中，在4 ℃條件下透析，每6 ～8 h 更換1 次透析液，透析液中尿素的濃度依次為6、4、2、1、0 mol/L，測定透析后的蛋白濃度。
1.5 重組蛋白的Western blot 鑒定
將純化后的重組蛋白HBc-VP6 進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜，用1∶500 稀釋的BRV 陽性血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。加入1∶10 000 稀釋的HRP兔抗牛IgG 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。使用DAB 顯色液顯色。
1.6 透射電鏡成像
復性后的目的蛋白送至河北師范大學分析測試中心進行透射電鏡成像實驗，觀察病毒樣顆粒的形成情況。
1.7 小鼠免疫驗證
將24 只6 ～8 周齡的BALB/c 小鼠隨機平均分成3 組。即HBc-VP6 組、VP6 組和PBS 組。于第0 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后進行背部皮下多點注射。HBc-VP6 組接種50 μg/只的HBc-VP6 重組蛋白；VP6 組接種50 μg/只的VP6 重組蛋白；PBS 組接種等量的PBS。在第14、28 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與不完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后按照首次的免疫劑量和方式對各組小鼠進行免疫。于首免后第7、14、21、28、35、42、49 天進行尾靜脈采血。室溫放置1 h 后，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集血清存放于-20 ℃。
1.8 ELISA 檢測
通過間接ELISA 檢測血清中抗BRV 的特異性IgG 抗體。將純化的HBc-VP6 蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，包被96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，以1∶200 稀釋的血清為一抗，以HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，以TMB 底物顯色液顯色，多功能酶標儀檢測OD450值。
1.9 細胞因子檢測
采用商業(yè)化細胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中細胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度。標準孔各加不同濃度的標準品各50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后加待測樣品10 μL，輕輕晃動混勻后每孔加入酶標試劑100 μL，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復洗滌5 次，拍干。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加50 μL 終止液終止反應，450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
采用商業(yè)化細胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中IFN-γ 的質(zhì)量濃度。具體操作參照細胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度的操作方法并結(jié)合小鼠γ 干擾素酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進行檢測。
1.10 數(shù)據(jù)分析
應用GraphPad Prism8.0.1 軟件進行作圖與數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05 認為具有生物統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組質(zhì)粒的鑒定
重組表達質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到5 900 bp（載體）和1 014 bp（目的基因）2 條條帶（圖1），說明重組的HBcAg-VP6基因已成功插入到pET32a 載體中。
圖1 重組質(zhì)粒pET32a- HBcAg-VP6 的酶切鑒定Fig.1 Identification of pET32a-HBcAg-VP6 by enzyme digestion
2.2 重組蛋白的純化與復性
超聲裂解后收集的上清和沉淀進行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示重組蛋白HBc-VP6主要存在于包涵體中（見圖2）。純化并復性后的重組蛋白HBc-VP6 經(jīng)SDSPAGE 檢測可見僅在57 kD 左右的單一條帶（見圖3），經(jīng)BandScan 軟件分析蛋白純度可達80%以上，經(jīng)濃縮后重組蛋白HBc-VP6 的質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL。
圖2 重組蛋白的可溶性檢測Fig.2 Soluble detection of recombinant protein
圖3 HBc-VP6 蛋白純化的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of HBc-VP6 protein purification
2.3 目的蛋白的Western blot 檢測
Western blot 檢測結(jié)果顯示，純化復性后的蛋白HBc-VP6 在約57 kD 處出現(xiàn)單一的條帶（圖4），說明其可以和BRV 陽性血清發(fā)生良好的反應。
圖4 HBc-VP6 蛋白Western-blot 分析Fig.4 Western-blot analysis of HBc-VP6 protein
2.4 透射電鏡檢測重組蛋白HBc-VP6
純化復性后的重組蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（圖5），表明VP6 蛋白與HBc蛋白融合表達后，HBc-VP6 重組蛋白能自我折疊裝配成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。
圖5 透射電鏡檢測HBc-VP6 重組蛋白病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)Fig.5 Observation of virus-like particles of HBc-VP6 recombinant protein by negative-stain TEM
2.5 特異性抗體的ELISA 檢測
ELISA 結(jié)果顯示，重組蛋白HBc-VP6 和VP6首次免疫后第14 天加強免疫，產(chǎn)生的抗BRV 特異性抗體水平明顯升高（圖6）。首次免疫后第14天HBc-VP6 和VP6 抗體水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首次免疫后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于另外兩組（P＜0.01）。在整個過程中，HBc-VP6 組的抗體水平較高，PBS 組并未檢測到抗BRV 特異性抗體。
圖6 免疫后小鼠血清中BRV 特異性抗體IgG 的檢測Fig.6 Detection of BRV specific antibody IgG in serum of immunized mice
2.6 細胞因子的檢測
為了進一步檢測小鼠產(chǎn)生的免疫應答的類型和水平，本研究檢測免疫小鼠血清中Th1 型（IFN-γ）和Th2 型（IL-4）細胞因子的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首免后第7 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平高于VP6 組和PBS 組（P＜0.05）。首免后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于VP6 組（P＜0.01）。首免后第28 天VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組(見圖7)。
圖7 免疫后小鼠血清細胞因子IL-4 的檢測Fig.7 Detection of serum cytokines IL-4 in mice after immunization
細胞因子IFN-γ 檢測結(jié)果表明（見圖8），首免后第7 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平顯著高于PBS 組（P＜0.05），首免后第14 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平極顯著高于PBS 組（P＜0.01），但HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平無明顯差異。
圖8 免疫后小鼠血清細胞因子IFN-γ 的檢測Fig.8 Detection of serum cytokines IFN-γ in mice after immunization
3 結(jié)論與討論
犢牛腹瀉是養(yǎng)牛場飼養(yǎng)管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，而牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉最主要同時也是發(fā)生率最高的病原，7 日齡以內(nèi)犢牛最為易感［12-13］。因此用疫苗接種預防BRV感染就成為犢牛腹瀉防控的關鍵環(huán)節(jié)。VP6 蛋白作為決定輪狀病毒分組的特異性抗原有較強的免疫原性，是輪狀病毒感染血清抗體檢測重要的候選抗原［14］。VP6 蛋白作為RV 共同亞組的抗原蛋白，在原核表達系統(tǒng)中VP6 表達效率高，可作為重組亞單位疫苗抵抗不同基因型RV 的感染［15］。故本研究將VP6 蛋白插入到HBcAg 的免疫顯性區(qū)的基因中，使其在大腸桿菌BL21 中表達融合蛋白HBc-VP6，并通過Western blot 對所表達的融合蛋白進行鑒定。同時在小鼠模型中檢測了重組抗原的免疫原性和產(chǎn)生的免疫反應類型。
BRV 引起的腹瀉在新生犢牛最為常見，新生犢牛的保護機制主要是由泌乳免疫介導的，哺乳初期犢牛主要通過母乳獲得抗體，犢牛從母乳中獲取的BRV 特異性抗體IgG 在預防全身性感染中承擔重要作用［16-18］。本研究結(jié)果表明，最終檢測的HBc-VP6 組和VP6 組均能產(chǎn)生抗BRV 的特異性抗體IgG，且抗體水平顯著高于PBS 對照組(P＜0.01),同時HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于VP6 組，說明HBcAg 與外源基因VP6融合表達后，其自發(fā)組裝成的HBc-VLPs 不僅其本身具有較強的免疫原性，且相連后可與外源基因VP6增強外源基因的免疫原性。
IFN-γ 由Th1 型細胞分泌，在機體產(chǎn)生的細胞免疫過程中承擔重要的作用。IL-4 由Th2 型細胞產(chǎn)生，促進B 淋巴細胞的增殖和分化，在機體的體液免疫反應中承擔重要作用。為探討重組抗原HBc-VP6 誘導的免疫反應類型，本研究檢測了免疫小鼠血清中IFN-γ 和IL-4 的水平，結(jié)果顯示，HBc-VP6 組和VP6 組小鼠在免疫后第7 天既產(chǎn)生IFN-γ，同時也產(chǎn)生IL-4，且分泌水平顯著高于PBS 組(P＜0.01),這表明重組抗原能夠促進Th1 型和Th2 型細胞免疫反應，間接表明HBc-VP6 能同時促進細胞免疫和體液免疫反應。
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牛輪狀病毒（Bovine rotavirus,BRV）是犢牛腹瀉的重要病原之一。1968 年Mebus 等首次從新生犢牛腹瀉糞便中分離到NCDV 株，并證實BRV 是引發(fā)新生犢牛腹瀉的主要病原［1］。1980 年福建畜牧獸醫(yī)研究所研究證實BRV 也存在于我國牛群中［2］。目前BRV感染在全球范圍內(nèi)流行，嚴重威脅著全世界養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展［3］，因此有必要加強對BRV 的及時監(jiān)測和防治。而預防BRV 的主要手段就是通過疫苗進行免疫接種，常見的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。世界范圍內(nèi)唯一的商品化BRV 減毒疫苗（NCDV-lincoln 株）已經(jīng)獲得USDA 的批文［4］。近年來，隨著科學技術的不斷進步和發(fā)展，基因工程疫苗也得到快速的發(fā)展，如嵌合疫苗、轉(zhuǎn)基因疫苗和亞單位疫苗等。
RV 由外層衣殼、內(nèi)層衣殼和核心衣殼3 層衣殼蛋白組成，分別編碼（VP1 ～VP4、VP6、VP7）6 種結(jié)構(gòu)蛋白和（NSP1 ～NSP6）6 種非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。VP6 蛋白可以在組裝病毒顆粒的過程中讓VP4 和VP7 空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而增強外殼蛋白的免疫原性。同時VP6 蛋白可以針對不同輪狀病毒毒株產(chǎn)生交叉保護性免疫應答，這對BRV 疫苗的研制具有重要意義［6］。
1986 年，Newton SE 和Clarke 等人首次報道了HBcAg 可作為VLP 載體，用于包裝外源的口蹄疫病毒片段，并通過實驗證明可獲得良好的免疫保護效果，這為表達其他外源性抗原提供了可能［7-9］，同時HBcAg 在許多表達系統(tǒng)中都能高水平表達，如在人HeLa 細胞、腺病毒載體表達系統(tǒng)及細菌（大腸桿菌、沙門氏菌等）表達系統(tǒng)中都能有效表達［10-11］。因此，本研究以HBcAg 作為載體蛋白，在其主要免疫優(yōu)勢區(qū)插入VP6 序列，經(jīng)誘導后在大腸桿菌中表達獲得重組HBc-VP6 蛋白，并在小鼠模型組中檢測重組蛋白的免疫原性，為今后研制BRV 疫苗提供重要的參考。
1 材料與方法
1.1 材料和試劑
pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 陽性質(zhì)粒由王家鑫老師惠贈；pET32a 空質(zhì)粒由本實驗室保存；BRV病毒陽性血清由本實驗室收集保存；pMD19-T 載體、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α 和BL21 感受態(tài)菌細胞均購自寶生物（大連）有限公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；小鼠細胞因子ELISA 檢測試劑盒為北京綠源伯德生物科技有限公司產(chǎn)品；BALB/c 小鼠購自斯貝福實驗動物科技有限公司。
1.2 引物的設計與合成
根據(jù)BRV（登錄號MN047454）VP6 基因和乙肝病毒核心抗原基因序列（KC774394），設計上下游引物PCR.擴增所需的片段（見表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.3 融合基因的擴增與重組表達載體的構(gòu)建
以pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 為 模 板，使用引物P5 及P6 擴增F3 片段，即HBcAg（編碼83 ～144 aa）基因，膠回收PCR 擴增產(chǎn)物利用XhoⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切回收并連接至pET32a 載體上，獲得pET32a- HBcAg(編碼83 ～144aa)重組質(zhì)粒。同理利用P1 和P2 為引物擴增F1 片段，即HBcAg（編碼1 ～74 aa），使用引物P3 及P4 擴增F2 片段，即VP6 基因。通過Overlap PCR 法將F1 和F2 片段融合擴增得到HBcAg(編碼1 ～74aa)-VP6基因，膠回收PCR 擴增產(chǎn)物利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切回收并連接至pET32a-HBcAg (編碼83 ～144 aa)重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6。
1.4 重組蛋白的表達及純化
將測序正確的陽性菌液培養(yǎng)至OD600nm為0.6 ～0.8 時，加入誘導劑IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌體。超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳，觀察目的蛋白的表達情況。超聲裂解收集誘導的菌體沉淀按照蛋白純化試劑盒說明書進行純化。將純化后的蛋白溶液加入透析袋中，在4 ℃條件下透析，每6 ～8 h 更換1 次透析液，透析液中尿素的濃度依次為6、4、2、1、0 mol/L，測定透析后的蛋白濃度。
1.5 重組蛋白的Western blot 鑒定
將純化后的重組蛋白HBc-VP6 進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜，用1∶500 稀釋的BRV 陽性血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。加入1∶10 000 稀釋的HRP兔抗牛IgG 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。使用DAB 顯色液顯色。
1.6 透射電鏡成像
復性后的目的蛋白送至河北師范大學分析測試中心進行透射電鏡成像實驗，觀察病毒樣顆粒的形成情況。
1.7 小鼠免疫驗證
將24 只6 ～8 周齡的BALB/c 小鼠隨機平均分成3 組。即HBc-VP6 組、VP6 組和PBS 組。于第0 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后進行背部皮下多點注射。HBc-VP6 組接種50 μg/只的HBc-VP6 重組蛋白；VP6 組接種50 μg/只的VP6 重組蛋白；PBS 組接種等量的PBS。在第14、28 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與不完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后按照首次的免疫劑量和方式對各組小鼠進行免疫。于首免后第7、14、21、28、35、42、49 天進行尾靜脈采血。室溫放置1 h 后，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集血清存放于-20 ℃。
1.8 ELISA 檢測
通過間接ELISA 檢測血清中抗BRV 的特異性IgG 抗體。將純化的HBc-VP6 蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，包被96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，以1∶200 稀釋的血清為一抗，以HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，以TMB 底物顯色液顯色，多功能酶標儀檢測OD450值。
1.9 細胞因子檢測
采用商業(yè)化細胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中細胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度。標準孔各加不同濃度的標準品各50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后加待測樣品10 μL，輕輕晃動混勻后每孔加入酶標試劑100 μL，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復洗滌5 次，拍干。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加50 μL 終止液終止反應，450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
采用商業(yè)化細胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中IFN-γ 的質(zhì)量濃度。具體操作參照細胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度的操作方法并結(jié)合小鼠γ 干擾素酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進行檢測。
1.10 數(shù)據(jù)分析
應用GraphPad Prism8.0.1 軟件進行作圖與數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05 認為具有生物統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組質(zhì)粒的鑒定
重組表達質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到5 900 bp（載體）和1 014 bp（目的基因）2 條條帶（圖1），說明重組的HBcAg-VP6基因已成功插入到pET32a 載體中。
圖1 重組質(zhì)粒pET32a- HBcAg-VP6 的酶切鑒定Fig.1 Identification of pET32a-HBcAg-VP6 by enzyme digestion
2.2 重組蛋白的純化與復性
超聲裂解后收集的上清和沉淀進行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示重組蛋白HBc-VP6主要存在于包涵體中（見圖2）。純化并復性后的重組蛋白HBc-VP6 經(jīng)SDSPAGE 檢測可見僅在57 kD 左右的單一條帶（見圖3），經(jīng)BandScan 軟件分析蛋白純度可達80%以上，經(jīng)濃縮后重組蛋白HBc-VP6 的質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL。
圖2 重組蛋白的可溶性檢測Fig.2 Soluble detection of recombinant protein
圖3 HBc-VP6 蛋白純化的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of HBc-VP6 protein purification
2.3 目的蛋白的Western blot 檢測
Western blot 檢測結(jié)果顯示，純化復性后的蛋白HBc-VP6 在約57 kD 處出現(xiàn)單一的條帶（圖4），說明其可以和BRV 陽性血清發(fā)生良好的反應。
圖4 HBc-VP6 蛋白Western-blot 分析Fig.4 Western-blot analysis of HBc-VP6 protein
2.4 透射電鏡檢測重組蛋白HBc-VP6
純化復性后的重組蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（圖5），表明VP6 蛋白與HBc蛋白融合表達后，HBc-VP6 重組蛋白能自我折疊裝配成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。
圖5 透射電鏡檢測HBc-VP6 重組蛋白病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)Fig.5 Observation of virus-like particles of HBc-VP6 recombinant protein by negative-stain TEM
2.5 特異性抗體的ELISA 檢測
ELISA 結(jié)果顯示，重組蛋白HBc-VP6 和VP6首次免疫后第14 天加強免疫，產(chǎn)生的抗BRV 特異性抗體水平明顯升高（圖6）。首次免疫后第14天HBc-VP6 和VP6 抗體水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首次免疫后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于另外兩組（P＜0.01）。在整個過程中，HBc-VP6 組的抗體水平較高，PBS 組并未檢測到抗BRV 特異性抗體。
圖6 免疫后小鼠血清中BRV 特異性抗體IgG 的檢測Fig.6 Detection of BRV specific antibody IgG in serum of immunized mice
2.6 細胞因子的檢測
為了進一步檢測小鼠產(chǎn)生的免疫應答的類型和水平，本研究檢測免疫小鼠血清中Th1 型（IFN-γ）和Th2 型（IL-4）細胞因子的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首免后第7 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平高于VP6 組和PBS 組（P＜0.05）。首免后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于VP6 組（P＜0.01）。首免后第28 天VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組(見圖7)。
圖7 免疫后小鼠血清細胞因子IL-4 的檢測Fig.7 Detection of serum cytokines IL-4 in mice after immunization
細胞因子IFN-γ 檢測結(jié)果表明（見圖8），首免后第7 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平顯著高于PBS 組（P＜0.05），首免后第14 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平極顯著高于PBS 組（P＜0.01），但HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平無明顯差異。
圖8 免疫后小鼠血清細胞因子IFN-γ 的檢測Fig.8 Detection of serum cytokines IFN-γ in mice after immunization
3 結(jié)論與討論
犢牛腹瀉是養(yǎng)牛場飼養(yǎng)管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，而牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉最主要同時也是發(fā)生率最高的病原，7 日齡以內(nèi)犢牛最為易感［12-13］。因此用疫苗接種預防BRV感染就成為犢牛腹瀉防控的關鍵環(huán)節(jié)。VP6 蛋白作為決定輪狀病毒分組的特異性抗原有較強的免疫原性，是輪狀病毒感染血清抗體檢測重要的候選抗原［14］。VP6 蛋白作為RV 共同亞組的抗原蛋白，在原核表達系統(tǒng)中VP6 表達效率高，可作為重組亞單位疫苗抵抗不同基因型RV 的感染［15］。故本研究將VP6 蛋白插入到HBcAg 的免疫顯性區(qū)的基因中，使其在大腸桿菌BL21 中表達融合蛋白HBc-VP6，并通過Western blot 對所表達的融合蛋白進行鑒定。同時在小鼠模型中檢測了重組抗原的免疫原性和產(chǎn)生的免疫反應類型。
BRV 引起的腹瀉在新生犢牛最為常見，新生犢牛的保護機制主要是由泌乳免疫介導的，哺乳初期犢牛主要通過母乳獲得抗體，犢牛從母乳中獲取的BRV 特異性抗體IgG 在預防全身性感染中承擔重要作用［16-18］。本研究結(jié)果表明，最終檢測的HBc-VP6 組和VP6 組均能產(chǎn)生抗BRV 的特異性抗體IgG，且抗體水平顯著高于PBS 對照組(P＜0.01),同時HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于VP6 組，說明HBcAg 與外源基因VP6融合表達后，其自發(fā)組裝成的HBc-VLPs 不僅其本身具有較強的免疫原性，且相連后可與外源基因VP6增強外源基因的免疫原性。
IFN-γ 由Th1 型細胞分泌，在機體產(chǎn)生的細胞免疫過程中承擔重要的作用。IL-4 由Th2 型細胞產(chǎn)生，促進B 淋巴細胞的增殖和分化，在機體的體液免疫反應中承擔重要作用。為探討重組抗原HBc-VP6 誘導的免疫反應類型，本研究檢測了免疫小鼠血清中IFN-γ 和IL-4 的水平，結(jié)果顯示，HBc-VP6 組和VP6 組小鼠在免疫后第7 天既產(chǎn)生IFN-γ，同時也產(chǎn)生IL-4，且分泌水平顯著高于PBS 組(P＜0.01),這表明重組抗原能夠促進Th1 型和Th2 型細胞免疫反應，間接表明HBc-VP6 能同時促進細胞免疫和體液免疫反應。
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