白少川，李 楠，王德賀，葛琳涵，郭艷麗，樊寶良，李蘭會

（河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071001）

Sevebrovsky［1］在1922 年首次提出雛雞主翼羽與覆主翼羽生長速度不同形成的快羽和慢羽表型為伴性性狀，受1 對等位基因K 和k+控制，并且慢羽對快羽為不完全顯性［2］。羽型被廣泛應用到雞配套系生產(chǎn)的商品代性別鑒定上，且不存在顯性白基因的上位效應，使之應用比羽色更廣［3］。在核心育種群中需要純合快慢羽雞，其中母雞的表型直接反映了基因型，而純合公雞ZKZK或雜合公雞ZKZk+均表現(xiàn)為慢羽。無論是建立專門的品系還是血統(tǒng)純化過程中，純合慢羽公雞的選擇，都是必不可少的。近年來，國內地方品種相繼建立羽型自別雌雄的配套系生產(chǎn)，但不同品種雞的羽型對生產(chǎn)性能的效應有一定差異［4-5］。

慢羽K 基因具有復雜的分子結構［6-7］，該區(qū)域不僅包含k+ 位點中分別位于Z 染色體（NC_006127.5）的催乳素受體基因（PRLR）和精子鞭毛2 基因（SPEF2），還存在由于同源重組形成的部分重復基因dPRLR和dSPEF2。張秀玲［8］利用重復基因的斷裂連接點建立了慢羽公雞羽型基因型的半定量PCR 檢測方法。Iraqi 等［9］和Elferink等［6］分別通過Southern blot 和定量PCR 認為K基因有180 kb 的串聯(lián)重復序列，但慢羽PRLR、SPEF2、dPRLR和dSPEF2等4 個基因的排列構成未見試驗報道。PRLR和SPEF2基因5'末端以“頭碰頭”形式連接，并有長477 bp 的共有區(qū)域；dPRLR與dSPEF2的3'末端“尾對尾”連接形成融合基因，推斷4 個基因的排列構成。融合基因由SPEF2內含子4 的1 546 bp 處與PRLR第12 外顯子的578 bp 處連接形成。Zhao 等［10］發(fā)現(xiàn)融合基因具有雙向轉錄特征。Ayako 等［11］發(fā)現(xiàn)dSPEF2基因的多個轉錄本，其4 個新的外顯子位于dPRLR反義鏈的內含子區(qū)；dPRLR基因3'末端的4 個polyA 位于dSPEF2反義鏈的內含子區(qū)。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)動植物基因組中很多基因同時存在正義轉錄本和反義轉錄本［12-14］。反義轉錄物參與早期胚胎發(fā)育過程中的細胞增殖與遷移［15］，以及癌變調控［16-18］。由于反義轉錄物可與互補的正義鏈形成雙鏈RNA，導致RNA 干擾、RNA 編輯或RNA 掩蔽［19］，對鄰近基因的表達產(chǎn)生影響［20］。

本試驗通過半定量PCR 檢測PRLR和SPEF2基因5'末端共有區(qū)域477 bp 片段拷貝數(shù)，明確慢羽K位點基因的連接方式；通過特異性反轉錄確定共有區(qū)域477 bp 片段和融合基因的轉錄特征，以期為深入挖掘慢羽雞K 基因的分子結構和調控機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

18 胚齡和19 胚齡太行雞胚毛囊、肝臟均采集于河北農(nóng)業(yè)大學孵化室；Trans2K? Plus DNA Marker、TransFast? Taq DNA Polymerase 為北京全式金公司產(chǎn)品；Super GelRed 和2xES Taq MasterMix(Dye)為保定康為世紀公司產(chǎn)品；pMD? 19-T Vector Cloning Kit和S1 Nuclease 為大連寶生物公司產(chǎn)品，引物合成及測序由蘇州金唯智公司完成。

1.2 RNA 和DNA 提取及cDNA 合成

使用TransZol Up（北京全式金）提取太行雞毛囊總RNA，EasyPure? Genomic DNA Kit（北京全式金）提取太行雞肝臟DNA，電泳檢測提取DNA 和RNA 的完整性，調整DNA 和RNA 濃度分別為50和1 000 ng/μL； 使用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（北京全式金）將RNA 反轉錄為cDNA。

1.3 引物設計和PCR 反應

NCBI 下載ev21全長序列（KY235336.1），利用Primer Premier 5.0 設計引物659-S 和659-A 檢測樣品ev21陰陽性。參考杜小龍［21］研究結果合成477-A 和477-S 引物擴增PRLR和SPEF2的5'共有區(qū)域，以半定量PCR 方法明確PRLR和SPEF2基因連接方式。參考張樂超［22］融合基因（fusion）和SPEF2基因檢測引物，檢測其轉錄。

PCR 反應體系：2×ES Taq MasterMix(Dye) 5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補齊10 μL。PCR 反應程序：預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，各自退火溫度退火30 s，延伸72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)（除半定量PCR 24 個循環(huán)），終延伸72 ℃10 min，4 ℃保存。樣品羽型和性別檢測參考張秀玲［8］和胡銳穎［23］的檢測方法。試驗用引物信息見表1。

表1 試驗用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉錄方向

1.4.1PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域拷貝數(shù)檢測半定量PCR 擴增太行雞PRLR與SPEF25'共有區(qū)域。反應體系為Mix 5 μL，477-S、477-A 各0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足10 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，24 個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止反應。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，ImageJ 軟件分析目的條帶灰度值。

1.4.2PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域轉錄方向檢測利用477-S 和477-A 特異引物分別對RNA 反轉錄，得到的cDNA 稀釋20 倍。以此cDNA 為模板依照1.4.1 的PCR 條件和體系進行35 個循環(huán)的擴增，檢測PRLR和SPEF2共有區(qū)域轉錄方向。將目的條帶純化回收與pMDTM19-T 載體連接。構建好的載體進行大腸桿菌轉化，菌液送金唯智公司測序，明確轉錄產(chǎn)物。

1.5 Fusion 基因的轉錄方向的檢測

分別以Fusion-S 和Fusion-A 進行為引物進行特異性反轉錄，將得到的cDNA 為模板用雙引物擴增，1%瓊脂糖凝膠檢測PCR 結果，檢測FUSION基因是否雙向轉錄；將目的片段純化回收并連接測序，明確擴增產(chǎn)物是否為目標基因序列。

同樣進行引物SPEF2-S 和SPEF2-A 以及659-S和659-A 的特異反轉錄PCR（RT-PCR），檢測SPEF2和ev21基因的轉錄方向，分別作為單向和雙向轉錄對照。

1.6 S1 酶切法檢測基因轉錄方向

以通用引物反轉錄獲得cDNA，將cDNA 產(chǎn)物進行S1 核酸酶酶切，酶切體系：cDNA 1 μg，10×S1 buffer 2 μL，S1 0.06 μL， 滅菌水加到20 μL；酶切溫度23 ℃，時間為20 min。另外，取10 μL 酶切產(chǎn)物加入0.5 mL/L EDTA。將cDNA、酶切產(chǎn)物和加EDTA 產(chǎn)物分別為模板進行SPEF2特異性RTPCR。設置3 組通用引物反轉錄cDNA 的S1 用量和酶切時間：0.06 μL S1，酶切20 min；0.10 μL S1，酶切20 min；0.06 μL S1，酶切30 min，然后以ev21和fusion 引物進行PCR 擴增，分析S1 酶切檢測轉錄方向的效果。

2 結果與分析

2.1 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉錄方向鑒定

2.1.1PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域拷貝數(shù)檢測對PRLR與SPEF2共有區(qū)域477 bp 片段進行半定量PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠檢測，結果如圖1 所示擴增條帶單一清晰，無拖尾現(xiàn)象。純合慢羽公雞（7和8 泳道）、雜合慢羽公雞（1 和2 泳道）、快羽公雞（3 泳道）、慢羽母雞（4 泳道）和快羽母雞（5和6 泳道）的條帶亮度存在差異。

圖1 PRLR 和SPEF2 基因共有區(qū)域半定量PCR 凝膠檢測Fig.1 Semi-quantitative PCR gel detection of shared region for PRLR and SPEF2 gene

試驗共檢測31 只純合慢羽公雞、34 只雜合慢羽公雞、35 只慢羽母雞、28 只快羽公雞和33 只快羽母雞的477 bp 電泳條帶灰度值，得到5 種類型雞的灰度比值依次為2.5∶2.0∶1.6∶1.6∶1（見表2）。

表2 PRLR 和SPEF2 基因共有區(qū)域477 bp 灰度值Table 2 Gray value of 477 bp in PRLR and SPEF2 common region

2.1.2PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域轉錄方向檢測分別以477-S 和477-A 引物進行特異性RT-PCR，結果如圖2 所示：泳道1 和2 分別是以477-S 和477-A 特異反轉錄cDNA 的PCR 產(chǎn)物?；厥占兓瘮U增條帶，連接測序，發(fā)現(xiàn)477-S 特異反轉錄cDNA的PCR 產(chǎn)物與目的序列完全一致，而477-A 的PCR主要擴增產(chǎn)物為非特異擴增。

圖2 477 bp 特異性反轉錄的PCR 產(chǎn)物凝膠檢測Fig.2 Gel assay of PCR product for 477 bp from specific reverse transcription

2.2 Fusion 基因轉錄方向的檢測

Fusion-S 和Fusion-A 特異反轉錄融合基因的PCR 產(chǎn)物（圖3A）可見清晰單一條帶；659-S 和659-A 特異反轉錄ev21 的PCR 產(chǎn)物（圖3B），條帶單一，雙向均有目的產(chǎn)物；SPEF-S 和SPEF-A 特異反轉錄SPEF2 產(chǎn)物（圖3C），可見2 條單一條帶。

圖3 特異反轉錄的PCR 凝膠檢測Fig.3 Gel assays of PCR for specific reverse transcription

對fusion、ev21 和SPEF2的擴增條帶克隆測序。fusion測序結果比對（圖4）顯示，上下游引物各自的特異RT-PCR 擴增獲得的片段與目的序列完全一致，說明fusion基因為雙向轉錄。

ev21 的雙向特異RT-PCR 產(chǎn)物序列比對發(fā)現(xiàn)上下游引物的特異轉錄產(chǎn)物存在SNP 位點。SPEF2的產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)SPEF-A 的RT-PCR 產(chǎn)物序列與原序列完全匹配，而SPEF-S 的RT-PCR 產(chǎn)物為非特異擴增。

圖4 Fusion 特異反轉錄擴增與原序列比對結果Fig.4 Sequences comparison of specific RT-PCR for Fusion

2.3 S1 酶切產(chǎn)物PCR 結果

將通用引物反轉錄產(chǎn)物進行S1 酶切后為模板進行SPEF2目的片段擴增，結果見圖5A。1、4、7 和10 泳道為模板cDNA 未經(jīng)處理的擴增，可見目的條帶；2、5 和8 泳道為模板經(jīng)0.06 μL S1 酶切20 min 的擴增，有目的條帶；3、6 和9 泳道為模板加EDTA 抑制劑的酶切產(chǎn)物擴增，未見目的條帶。

圖5B 為ev21的擴增，未經(jīng)處理cDNA 模板（1泳道）、0.06 μL S1 酶切20 min 模板（2 泳道）和0.06 μL S1 酶切30 min（4 泳道）的ev21 均出現(xiàn)目的條帶，而0.10 μL S1 酶切20 min（3 泳道）未出現(xiàn)目的條帶。圖5C 為Fusion 的擴增，未經(jīng)處理cDNA 模板（1 泳道）和0.06 μL S1 酶切20 min 模板（2 泳道）出現(xiàn)目的條帶，0.10 μL S1 酶切20 min（3 泳道）和0.06 μL S1 酶切30 min（4 泳道）未出現(xiàn)目的條帶。

圖5 S1 酶切cDNA 模板PCR 擴增凝膠檢測Fig.5 Gel detection of PCR of cDNA digested by S1

3 結論與討論

3.1 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉錄方向

雞Z 染色體的PRLR與SPEF2基因“頭碰頭”連接，有477 bp 的共有區(qū)域。如果慢羽雞的dPRLR和dSPEF2重復基因插入不影響PRLR和SPEF2的連接及其與下游基因連接，那么dPRLR和dSPEF2整合在PRLR和SPEF2內部，并且PRLR與dSPEF2以及dPRLR與SPEF2均在5'連接處存在477 bp 共有區(qū)域，因此，慢羽雞Z 染色體上有2 個拷貝的共有區(qū)域。公母雞性染色體分別為ZZ 和ZW 型，所以477 bp 共有區(qū)域在純合慢羽公雞、雜合慢羽公雞、慢羽母雞、快羽公雞和快羽母雞基因組中拷貝數(shù)分別為4、3、2、2 和1。因此，PCR 檢測477 bp 擴增條帶灰度值在以上5 種雞的比例理論上為4∶3 ∶2 ∶2 ∶1，檢測結果為2.5 ∶2.0 ∶1.6 ∶1.6 ∶1。雖然與預期比例4∶3∶2∶2∶1 存在差異，PCR 的模板起始濃度、擴增效率、擴增的平臺效應以及軟件分析的試驗誤差等都對試驗結果產(chǎn)生影響，但試驗結果一定程度上證明了預期理論值，可以推斷慢羽K 基因中PRLR和dPRLR反向定位在Z 染色體，分別與dSPEF2和SPEF2的5'末端以“頭碰頭”方式連接。慢羽K 基因分子構造特征的明確為深入挖掘其分子調控機制奠定基礎。

試驗進一步檢測PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域的轉錄方向發(fā)現(xiàn)，只有477-S 引物特異RT-PCR 成功獲得目的片段，而477-A 出現(xiàn)非特異擴增，表明該區(qū)域僅在反義鏈的轉錄，即PRLR基因有轉錄，而SPEF2無轉錄。

3.2 Fusion 基因轉錄方向

dPPLR由PRLR基因的第1 ～11 外顯子以及第12 外顯子的558 bp 構成，SPEF2基因的第1 ～5 外顯子重復構成dSPEF2［6］，dSPEF2和dPPLR的3'末端區(qū)域稱為融合基因Fusion，該末端連接區(qū)域是慢羽K 基因的特異斷裂連接點，為慢羽雞分子檢測的靶點。

本試驗對fusion、ev21及SPEF2進行特異性RT-PCR，結果顯示Fusion 和ev21上下游引物分別反轉錄得到的cDNA 均可成功擴增出目的條帶，且2 個擴增產(chǎn)物與原序列一致，說明fusion和ev21均為雙向轉錄。這與Zhao 等［10］發(fā)現(xiàn)fusion具有雙向轉錄產(chǎn)物一致，但尚需RACE 試驗進一步明確轉錄本結構特征。由于雙鏈RNA 可能形成RNA 干擾，即雙鏈RNA 誘發(fā)同源mRNA 高效特異性降解［24］。據(jù)此猜測fusion 可能影響PRLR和SPEF2的轉錄，進而影響羽型，但是具體調控機制還需后續(xù)試驗進行驗證。

戴振清［25］發(fā)現(xiàn)ev1的反義轉錄產(chǎn)物lnc-ALVE1-AS1 在禽白血病病毒抗性品系雞中的表達高于易感品系，與ev1序列高度相似的ev21整合在PRLR基因內含子中，可能存在相似的反向轉錄產(chǎn)物參與抗禽白血病病毒感染過程。以SPEF-A 進行特異性反轉錄的cDNA 為模板進行PCR 擴增獲得產(chǎn)物與SPEF2原序列完全匹配，而SPEF-S 由于上游引物出現(xiàn)錯配導致產(chǎn)生非特異擴增，說明SPEF2為單向轉錄。通過以上結果發(fā)現(xiàn)，特異性反轉錄因引物設計容易出現(xiàn)假陽性，還需后續(xù)測序比對，才能準確鑒定基因的轉錄方向。

3.3 酶切法檢測基因轉錄方向

S1 核酸酶是單鏈特異的核酸內切酶，在最適環(huán)境下，能將單鏈核酸或雙鏈核酸中的單鏈部分降解成為可溶性5'-單核苷酸，但對雙鏈核酸相對不敏感［26］。本試驗以3 種方式處理的cDNA 為模板（空白對照、S1 酶切處理和酶切后添加EDTA 抑制劑）擴增SPEF2，證明S1 酶切檢測轉錄方向的可行性。結果顯示S1 處理與否均能擴增出目的條帶，說明S1 酶切cDNA 并未將單向轉錄的SPEF2轉錄本降解，SPEF-S 引物非特異性的擴增產(chǎn)物與特異性產(chǎn)物可能形成部分雙鏈，導致S1 酶切沒有降解單向轉錄的SPEF2轉錄本。EDTA 處理的cDNA 均未擴增出條帶，由于EDTA 螯合了反應體系中的Mg2+，不僅抑制了S1 核酸酶的活性，也抑制了PCR 擴增的Taq酶的活性。調整酶量和酶切時間進行試驗，結果顯示酶量及酶切時間對試驗結果有較大影響，S1核酸酶過量也會水解雙鏈RNA；S1 酶切30 min 造成酶切結果的不穩(wěn)定性。表明通過S1 核酸酶酶切來判斷基因轉錄方向有很大的局限性。

本試驗通過半定量PCR 明確了雞慢羽K 基因中PRLR和dPRLR反向定位在Z 染色體上，分別與dSPEF2和SPEF2的5' 末端以“頭碰頭”方式連接；通過特異性反轉錄證明了PRLR和SPEF2的5'端共有區(qū)域只有PRLR發(fā)生轉錄，以及dPRLR和dSPEF2的“尾對尾”3'末端為雙向共轉錄；另外，發(fā)現(xiàn)S1 核酸酶酶切法驗證基因轉錄方向存在局限性。本研究為深入探究慢羽雞K 基因的分子結構特征、挖掘其功能調控提供理論參考。