張 靖， 蘇 琳， 陳曉雨， 要 鐸， 趙麗華， 王英麗， 張忠海， 靳 燁*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古澳菲利食品股份有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾015000）

自由基與人的衰老以及很多疾病有關(guān)。機(jī)體各系統(tǒng)正常運(yùn)行時，體內(nèi)氧化還原反應(yīng)會產(chǎn)生內(nèi)源性自由基；機(jī)體細(xì)胞在光氧化、輻射、農(nóng)藥、抗癌藥物、重金屬、防腐劑等刺激下會產(chǎn)生外源性自由基；食物中雜質(zhì)和油脂的氧化、吸煙、過度暴曬和環(huán)境污染等都會激發(fā)過量的自由基[1]。體內(nèi)細(xì)胞自由基產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡靠氧化還原酶系統(tǒng)和非酶還原劑共同調(diào)節(jié)[2]。當(dāng)自由基的產(chǎn)生不受生理調(diào)控，抗氧化酶系統(tǒng)受損，小分子抗氧化劑耗盡時，自由基會單純增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，DNA、蛋白質(zhì)等生物分子被破壞，人體內(nèi)生物膜受損，遺傳信息改變，細(xì)胞膜流動性喪失以及酶失活，引起衰老，導(dǎo)致癌癥，并促進(jìn)老年癡呆、中風(fēng)等疾病的發(fā)生，甚至造成死亡[3]。為了防止氧化應(yīng)激造成的危害，各種抗氧化劑的研究和開發(fā)已成為化學(xué)工程和生物工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前使用的化學(xué)合成抗氧劑雖能抑制油脂氧化，但對人體健康存在隱患，使用受到限制[4]。因此人們逐漸將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)向從食源性動物蛋白質(zhì)和植物組織中提取天然抗氧化劑。國內(nèi)外研究人員已從蝦[5]、海參[6]、羊肉[7]、豬皮[8]、大米[9]、油 菜籽[10]、雞蛋清[11]、玉米[12]、豌豆[13]、杏鮑菇[14]等動植物來源的蛋白質(zhì)中提取出了具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)。食物蛋白質(zhì)來源的抗氧化肽安全性高，且具有相對分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定好、易吸收的特點(diǎn)，作為機(jī)體的食品認(rèn)定抗氧化劑，是近年來熱門的研究課題[15]。

作為羊肉加工的主要副產(chǎn)物，羊骨本身營養(yǎng)價(jià)值豐富，含有礦物質(zhì)、維生素、軟骨素等營養(yǎng)物質(zhì)，所含蛋白質(zhì)高達(dá)25%，氨基酸種類豐富且必需氨基酸（賴氨酸、亮氨酸等）含量高，是一種高營養(yǎng)廉價(jià)易得的肉類加工副產(chǎn)物[16]。長期以來，人們對羊骨的加工僅限于熬湯補(bǔ)鈣、制骨膠，其次就是做成動物飼料，羊骨生物活性物質(zhì)還未被深入研究。因此，本文中以羊骨為原料，通過酶解法制備羊骨抗氧化肽，以多肽生成量及羥自由基（·OH）清除活性為評價(jià)指標(biāo)，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定了最佳酶解工藝條件，通過超濾分離獲得高活性的抗氧化組分，并對不同相對分子質(zhì)量的肽段進(jìn)行氨基酸含量分析。旨在合理利用廢棄羊骨開發(fā)功能性食品，為研究羊骨抗氧化肽的活性、分離純化及生產(chǎn)提供一定的依據(jù)，提高資源綜合利用水平及產(chǎn)業(yè)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊骨：內(nèi)蒙古澳菲利食品股份有限公司提供。

風(fēng)味蛋白酶（30 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（1 200 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）：北京酷來搏科技有限公司產(chǎn)品；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·）：美 國Sigma公司產(chǎn)品；3 000和10 000超濾離心管：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；三氯乙酸（TCA）、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

安全智能型反壓高溫蒸煮鍋：北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司產(chǎn)品；GZX-9076MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒儀器有限公司產(chǎn)品；高速萬能粉碎機(jī)：廣州雷邁機(jī)械廠制造；pH計(jì)：PB-10SArtorius公司產(chǎn)品；SHA-B恒溫水浴振蕩器：常州國華電器有限公司產(chǎn)品；5810-R型低溫臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；TU-1810型紫外/可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；LA8080超高速全自動氨基酸分析儀：日本日立公司產(chǎn)品；LCJ-25C型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司產(chǎn)品；KDY-9830凱氏定氮儀：北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 羊骨預(yù)處理

1）羊骨粉制備工藝 羊骨→解凍→沸水煮15 min→剔除非骨骼成分（羊肉、筋腱、軟骨及其他膜性組織）→沖洗→高壓蒸煮（羊骨與蒸餾水質(zhì)量比為1∶1，125℃，30 min）→去上層脂肪→沖洗→干燥（110℃，6 h）→粉碎→過80目篩（于-20℃下保存）。

2）羊骨粉脫脂工藝 羊骨粉→加無水乙醇混勻（羊骨粉質(zhì)量與無水乙醇體積比為1 g∶5 mL）→攪拌（室溫，24 h，每8 h左右換一次樣液）→離心（4℃，3 000 r/min，15 min）→取沉淀→沖洗→烘干（60℃）→保存酶解備用（-20℃）。

1.3.2 酶解工藝流程 脫脂羊骨粉→按一定料液比加蒸餾水混勻→殺菌（0.1 MPa，121℃，15 min）→冷卻（至40℃以下）→調(diào)節(jié)pH→加酶→水浴酶解→滅酶（100℃，10 min）→冷卻→離心（4℃，8 000 r/min，15 min）→上清液減壓抽濾（0.45μm水系濾膜）→多肽溶液。

1.3.3 蛋白酶的篩選 選取酶解基準(zhǔn)條件為骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶添加量8 000 U/g，酶解時間3 h，酶解溫度50℃，選用5種蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶pH 6、胰蛋白酶pH 8、堿性蛋白酶pH 9、木瓜蛋白酶pH 7、中性蛋白酶pH 7）分別對脫脂羊骨粉進(jìn)行水解。以多肽生成量結(jié)合羥自由基（·OH）清除活性為指標(biāo)，篩選出合適的蛋白酶。

1.3.4 羊骨多肽單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用堿性蛋白酶水解脫脂羊骨粉制備抗氧化肽，以多肽生成量結(jié)合羥自由基（·OH）清除活性為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別固定其他因素，依次評價(jià)骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%、6%、8%、10%、12%）、酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）、pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、酶 解 溫 度（40、45、50、55、60℃）、酶 解 時 間（2、3、4、5、6 h）對脫脂羊骨粉酶解效果的影響。

1.3.5 羊骨多肽響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶解溫度50℃，以·OH清除率為響應(yīng)值（Y），以酶解pH（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）、骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）為自變量。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 多肽生成量的測定 參考李珂的方法進(jìn)行測定[17]。

1.3.7 羊骨多肽液的體外抗氧化活性測定 采用水楊酸法測定樣品·OH清除活性[18]，DPPH法測定樣品DPPH·清除活性[19]，F(xiàn)e3+還原能力的測定參考田旭靜的方法[20]。

1.3.8 超濾工藝制備梯級肽 通過響應(yīng)面優(yōu)化將最優(yōu)條件下制備的酶解液進(jìn)行離心（4℃，8 000 r/min，15 min）和過濾。將濾液經(jīng)截留相對分子質(zhì)量為3 000和10 000的超濾管進(jìn)行超濾分離（4℃，3 000 r/min，30 min），得到3種不同相對分子質(zhì)量的多肽組分（組分Ⅰ，Mr≤3 000；組分Ⅱ，3 00010 000），分別進(jìn)行體外抗氧化活性測定。

1.3.9 氨基酸分析測定 采用響應(yīng)面優(yōu)化的條件制備羊骨多肽，冷凍干燥。通過酸水解法測定脫脂羊骨粉和多肽液及其超濾組分氨基酸含量。分別準(zhǔn)確稱取50 mg（含10~20 mg蛋白質(zhì)）不同組分的樣品，用15 mL 6 mol/L HCl溶解，110℃條件下酸水解22 h，冷卻后過濾，用0.02 mol/L HCl定容至25 mL。取1 mL過濾液，60℃氮?dú)獯蹈?，加?.02 mol/L HCl（去離子水配制）漩渦振蕩至充分溶解，用0.22μm濾膜（水膜）過濾，最后采用LA8080超高速全自動氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示。采用Design-Expert v8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 5軟件作圖，IBM SPSS Statistics19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

多肽的抗氧化活性和酶解所用蛋白酶種類有關(guān)，不同蛋白酶對肽鍵的作用位點(diǎn)不同，所產(chǎn)生的多肽具有不同C端、N端和相對分子質(zhì)量。一些研究表明，C端具有大分子疏水性氨基酸時，多肽表現(xiàn)出高抗氧化活性，因此篩選適宜的蛋白酶是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟[21]。如圖1所示，在相同酶活力條件下，5種蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化能力存在顯著差異。其中，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的·OH清除率最大，酶解3 h后，其·OH清除率達(dá)（78.37±2.29）%，然后依次是木瓜蛋白酶（45.67±3.22）%、風(fēng)味蛋白酶（40.42±5.61）%、胰蛋白酶（36.3±2.57）%和中性蛋白酶（19.05±3.52）%。堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的多肽生成量也最高，為（111.86±0.25）mg/g（以骨蛋白質(zhì)計(jì)）。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最佳且多肽生成量最高，因此可以作為制備羊骨抗氧化肽的首選蛋白酶。

圖1 5種蛋白酶的酶解效果Fig.1 Enzymatic hydrolysis effect of five proteases

2.2 酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響 固定酶添加量8 000 U/g，pH 9.0，酶解溫度50℃，酶解時間3 h，研究不同骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%、6%、8%、10%、12%）對脫脂羊骨粉蛋白質(zhì)酶解物多肽生成量及·OH清除活性的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，多肽生成量呈先增后減趨勢，骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時，多肽生成量達(dá)到峰值（119.61±0.48）mg/g（以骨蛋白質(zhì)計(jì)），之后逐漸降低。這是因?yàn)檫m宜的骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)使蛋白質(zhì)與酶分子更好地接觸，提高酶解效率；但當(dāng)骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時，水解液黏度增大，底物與蛋白酶擴(kuò)散速率降低，蛋白質(zhì)鏈斷裂，反應(yīng)受到抑制，酶解效率下降，多肽生成量降低[22]。本實(shí)驗(yàn)中多肽溶液的·OH清除活性變化趨勢為：骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～8%時，·OH清除率呈顯著上升趨勢（P<0.05），繼續(xù)提高骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，·OH清除率保持平穩(wěn)，最高達(dá)到（85.28±2.79）%。由此可知過高的骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)會抑制蛋白酶的酶解效果，從而使得功能性肽釋放量減少[22]。因此為了獲取高活性抗氧化肽，必須嚴(yán)格控制酶解環(huán)節(jié)。由圖2可知，骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、10%和12%時，酶解液的·OH清除率差異不顯著（P>0.05），且骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%時多肽生成量最大，考慮到節(jié)約成本，故選擇8%為適宜骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on polypeptides amount and antioxidant activity of hydrolysates

2.2.2 酶添加量、pH對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響 固定骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，pH 9.0，酶解溫度50℃，酶解時間3 h，研究酶添加量分別為4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g時，堿性蛋白酶對脫脂羊骨粉蛋白質(zhì)酶解物多肽生成量及·OH清除活性的影響如圖3（a）所示。多肽生成量隨酶添加量的增加而逐漸增大，當(dāng)酶添加量為8 000 U/g時，酶解液中多肽生成量最大，為（119.89±0.61）mg/g（以骨蛋白質(zhì)計(jì)），繼續(xù)增加酶添加量反而使多肽生成量緩慢降低，可能是因?yàn)殡S著產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，減少酶與底物的接觸概率，導(dǎo)致水解進(jìn)程緩慢[23]。觀察酶解產(chǎn)物的·OH清除活性可以發(fā)現(xiàn)，酶添加量從4 000 U/g增加到6 000 U/g時，·OH清除率顯著增加（P<0.05），酶添加量為6 000 U/g時，·OH清除率達(dá)到最大值，隨后繼續(xù)增加酶添加量，酶解液·OH清除率逐漸下降（P>0.05）。合適的酶用量可提高羊骨蛋白質(zhì)的利用率，促進(jìn)羊骨抗氧化肽的生成；過高的酶添加量引起過度酶解，導(dǎo)致活性抗氧化肽過度降解，產(chǎn)生不具活性的氨基酸或小分子肽，同時提高促氧化肽的釋放概率[24]。綜合考慮多肽生成量和·OH清除率，選擇最適酶添加量為6 000 U/g。

固定骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，酶添加量6 000 U/g，酶解溫度50℃，酶解時間3 h，研究不同pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，反應(yīng)過程中控制pH始終在一個恒定的水平）對脫脂羊骨粉蛋白質(zhì)酶解物多肽生成量及·OH清除活性的影響，結(jié)果如圖3（b）所示。本實(shí)驗(yàn)酶解物的多肽生成量和·OH清除率都呈先增加后降低趨勢，且在pH為9.0時兩項(xiàng)測試指標(biāo)均達(dá)到峰值。由于酶解反應(yīng)pH的改變直接影響酶與底物的解離狀態(tài)以及蛋白酶活性中心構(gòu)象，從而影響酶的穩(wěn)定性，改變酶與底物的結(jié)合方式，使產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終影響酶解產(chǎn)物的性質(zhì)[25]。從圖3（b）可以看出，pH小于9.0時酶解產(chǎn)物的·OH清除率顯著增加（P<0.05），pH大于9.0后酶解產(chǎn)物的·OH清除率急劇下降（P<0.05），pH繼續(xù)升高會破壞蛋白酶的活性中心和空間結(jié)構(gòu)，使其催化活性降低。同時由于堿性蛋白酶最適pH為9.0，此時堿性蛋白酶的活性最高，酶解效果最好，酶解產(chǎn)物的·OH清除率最大，所以確定最佳酶解pH為9.0。

圖3 酶添加量、pH對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of enzymes amount and pH on polypeptides amount and antioxidant activity of hydrolysates

2.2.3 酶解溫度、時間對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響 固定骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，酶添加量6 000 U/g，酶解pH 9.0，酶解時間3 h，研究不同酶解溫度（40、45、50、55、60℃）對脫脂羊骨粉蛋白質(zhì)酶解物多肽生成量及·OH清除活性的影響，結(jié)果如圖4（a）所示。當(dāng)反應(yīng)體系處于40～50℃時，多肽生成量隨溫度上升而顯著增加（P<0.05），50℃時多肽生成量達(dá)到峰值，繼續(xù)升高溫度，反應(yīng)過程中多肽生成量明顯下降。由多肽溶液的·OH清除率變化趨勢可知，溫度為50℃和55℃時的酶解物·OH清除率最高，分別為（86.23±2.93）%和（84.1±2.14）%，此溫度段抗氧化活性沒有顯著性差異（P>0.05），溫度低于50℃或高于55℃時·OH清除率都偏低，結(jié)合多肽生成量的變化趨勢，可知在一定的多肽生成量下，多肽溶液含有適合且穩(wěn)定的多肽片段和氨基酸比例，從而具有良好的抗氧化活性。故選擇50℃為最適酶解溫度。

固定骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，酶添加量6 000 U/g，酶解pH 9.0，酶解溫度50℃，研究不同酶解時間（2、3、4、5、6 h）對脫脂羊骨粉蛋白質(zhì)酶解物多肽生成量及·OH清除活性的影響，結(jié)果如圖4（b）所示。酶解時間3 h以后，多肽生成量呈波動上升趨勢，在酶解6 h多肽生成量達(dá)到最大值。由于酶解初期，底物含量高，可以充分與酶反應(yīng)，所以隨著時間的不斷延長，其多肽生成量逐漸增大，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物被不斷消耗，反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，酶的活性受到抑制，酶解活動基本趨于平穩(wěn)甚至結(jié)束，導(dǎo)致多肽生成量趨于平緩[26]?！H清除率隨酶解時間的延長先增加后減少，在酶解3 h時·OH清除率最大，達(dá)到（90.68±2.18）%，隨酶解時間的延長，底物特異性位點(diǎn)基本被完全反應(yīng)，繼續(xù)酶解會導(dǎo)致底物的過度水解，抗氧化肽的過度降解和低活性氨基酸的生成，使多肽溶液抗氧化活性降低[27]。所以綜合考慮，選擇3 h為最適酶解時間。

圖4 酶解溫度、時間對酶解物多肽生成量及抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature and time on polypeptides amount and antioxidant activity of hydrolysates

2.3 酶解工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定酶解溫度50℃，以pH、酶添加量、酶解時間、骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)這4個因素為自變量，·OH清除率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.3.2 模型的建立與方差分析 利用軟件Design-Expert v8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

Y=90.46-0.63A+1.92B+2.24C+3.86D+0.31AB-0.073AC-1.19AD-1.73BC+0.60BD-0.54CD-7.16A2-5.47B2-3.75C2-4.88D2回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)所選模型的決定系數(shù)R2=0.983 9，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.966 6，模型P<0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.355 3>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，方程擬合度高。模型中B、C、D、A2、B2、C2、D2、BC對·OH清除率影響極顯著（P＜0.01），AD對·OH清除率影響顯著（P<0.05）。由表3可知，F(xiàn)（A）=4.17，F(xiàn)（B）=39.10，F(xiàn)（C）=53.29，F(xiàn)（D）=157.96，即各因素對羊骨粉酶解物抗氧化活性的影響順序?yàn)楣欠圪|(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解時間＞酶添加量>pH。

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 ANOVA of model regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析 結(jié)果如圖5所示，當(dāng)?shù)雀呔€趨于橢圓形時，表示兩因素交互作用顯著，圓形則結(jié)論相反[28]。圖5（a）等高線表現(xiàn)為近圓形，說明pH和酶添加量兩因素交互作用不明顯。圖5（b）等高線表現(xiàn)為圓形，說明pH和酶解時間兩因素交互作用不明顯。同時響應(yīng)面坡度的陡峭程度也反映出處理?xiàng)l件的改變對響應(yīng)值的影響[25]。圖5（e）、（f）顯示，骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)方向的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，說明骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對·OH清除率的影響比酶添加量和酶解時間對其的影響大。圖5（c）表示骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH對·OH清除率的影響，從等高線圖中可看出骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及pH之間交互作用顯著。隨pH的增加，·OH清除率的變化不大，說明pH對清除率的影響不明顯。在圖5（d）中，控制pH和骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為零水平，酶添加量和酶解時間相互作用顯著?！H清除率隨酶添加量和酶解時間的增加均呈先上升后緩慢下降的趨勢，且酶解時間的上升速度稍快于酶添加量的上升速度，說明酶解時間對·OH清除率的影響較大，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對·OH清除率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on·OH radical scavenging rate

2.3.4 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證 采用軟件對優(yōu)化后的回歸方程分析可知，當(dāng)酶解條件為pH 8.92、酶添加量6 317.25 U/g、酶解時間3.23 h、骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.81%、酶解溫度50℃時，此時的·OH清除率最高，其理論值為91.67%。按照該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為了方便操作，選取pH 8.9、酶添加量6 400 U/g、酶解時間3.25 h、骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.8%、酶解溫度50℃，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測定·OH清除率為（91.31±0.48）%，非常接近理論值，證明擬合模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確。

2.4 羊骨多肽液及超濾組分體外抗氧化活性測定結(jié)果

抗氧化肽通過清除活性氧自由基來保護(hù)人體，通過氫原子或電子傳遞延緩脂質(zhì)過氧化過程來延長食品貨架期[29]。由于氧化過程涉及一系列反應(yīng)步驟，蛋白質(zhì)水解物可以通過多種反應(yīng)機(jī)制表現(xiàn)出抗氧化活性，因此，必須進(jìn)行幾種不同的測定，以提供有關(guān)所測化合物總抗氧化能力的全面信息[30]。本實(shí)驗(yàn)通過測定酶解液及其超濾組分的·OH清除活性、Fe3+還原能力和DPPH·清除活性來評估羊骨抗氧化肽的抗氧化潛力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。所有組分均表現(xiàn)出不同程度的·OH、DPPH·清除能力和Fe3+還原能力，表明不同相對分子質(zhì)量的抗氧化肽活性存在差異。組分Ⅰ（Mr≤3 000）清除·OH、DPPH·能力和Fe3+還原力顯著高于其他組分，未經(jīng)超濾分離純化的酶解液抗氧化活性相對較低。張周莉[31]用超濾法對豬肩胛骨抗氧化肽進(jìn)行初步分離純化，發(fā)現(xiàn)Mr<5 000組分的抗氧化活性高于其他超濾組分。李嬌嬌[32]對鵝骨抗氧化肽進(jìn)行分離富集，發(fā)現(xiàn)各超濾組分的抗氧化活性大小順序依次為：Mr<5 000組分，5 0010 000組分。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)低相對分子質(zhì)量的多肽其抗氧化活性并不一定最好，李誠等[33]研究發(fā)現(xiàn)豬皮膠原蛋白抗氧化肽5 000

表4 堿性蛋白酶酶解物及其超濾組分的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of alkaline protease hydrolysates and their ultrafiltration components

2.5 氨基酸組成分析

多肽的抗氧化能力取決于肽的各種屬性，包括氨基酸組成、序列、結(jié)構(gòu)和濃度等，此外，Sah等[30]報(bào)道，含有Pro、His、Met、Tyr、Val、Lys和Cys的水解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的自由基清除能力。由表5可知，羊骨多肽粉末中氨基酸含量豐富，必需氨基酸質(zhì)量占總氨基酸質(zhì)量的27.03%，疏水性氨基酸多達(dá)39.96%。膜分離得到的不同組分抗氧化肽氨基酸組成一致，組分Ⅱ（3 00010 000）次之（31.56 g/hg），其次依次為未經(jīng)超濾分離的多肽粉末、組分Ⅰ（Mr≤3 000）、脫脂羊骨粉。組分Ⅰ（Mr≤3 000）的疏水性氨基酸所占比例最高，為43.13%，該肽段含有對疏水性組分有很強(qiáng)結(jié)合力的疏水性氨基酸（Pro、Phe、Met等）和非極性脂肪族氨基酸（Val），這些氨基酸增強(qiáng)了多肽與自由基的相互作用，提高其抗氧化活性[34]。由此可以推測組分Ⅰ（Mr≤3 000）具有較強(qiáng)的抗氧化功能，這與2.4中羊骨多肽液及超濾組分體外抗氧化活性測定結(jié)果一致。

表5 羊骨粉和多肽液及其超濾組分的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較Table 5 Comparison of amino acid contents in sheep bone,polypeptide solution and the ultrafiltration components

3 結(jié) 語

作者以提高肉類加工副產(chǎn)物羊骨利用率為目的，通過酶解脫脂羊骨粉制備抗氧化肽。經(jīng)堿性蛋白酶在pH 8.9、酶添加量6 400 U/g、酶解時間3.25 h、骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.8%、酶解溫度50℃條件下，得到具有抗氧化活性的多肽溶液，其·OH清除率為（91.31±0.48）%，F(xiàn)e3+還原能力為0.085±0.003，DPPH·清除率為（32.00±0.12）%。超濾組分Ⅰ（Mr<3 000）抗氧化活性最強(qiáng)且疏水性氨基酸所占比例最高，為43.13%。通過優(yōu)化酶解工藝處理羊骨，降低了蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，增加了活性多肽及氨基酸成分，酶解產(chǎn)物活性更強(qiáng)且易于吸收，該工藝操作簡單，加工成本不高。在本實(shí)驗(yàn)梯級肽制備和抗氧化活性研究基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步對小肽的純化和功能鑒定進(jìn)行深入研究，為羊骨的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。