蔡 偉，余陳歡，羅益遠(yuǎn) ，劉 姝

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 中藥學(xué)院，浙江 寧波 315500； 2.杭州醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗動物中心，浙江 杭州 310053）

南方紅豆杉Taxus chinensis（Pilg.）Rehd. var.mairei（Lemee et Levl.）Cheng et L. K.Fu是目前我國常用中藥材，味辛、甘，性大溫，歸胃、肝經(jīng)，具有解毒、散結(jié)、止痛等功效，臨床上用于治療肺癌、乳腺癌、宮頸癌等，現(xiàn)代研究表明其有效成分主要為紫杉醇等紫杉烷類成分以及黃酮、多糖類等成分[1]。紫杉醇抗腫瘤作用時常常產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，且易產(chǎn)生耐藥性，限制了其在臨床上的使用[2]。隨著抗腫瘤中藥的深入研究，部分中藥及其活性成分的實(shí)驗結(jié)果表明其具有良好的增效減毒作用[3-5]。

本課程組前期研究了南方紅豆杉中總黃酮、總多糖及其與紫杉醇配伍對4T1、A549、MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響以及對荷瘤小鼠移植瘤生長的抑制情況，發(fā)現(xiàn)總多糖能夠增強(qiáng)紫杉醇體外對4T1、A549、MCF-7細(xì)胞以及體內(nèi)對S180荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用，體內(nèi)總多糖減輕紫杉醇抗腫瘤時的骨髓抑制毒副作用[6]。結(jié)果表明紫杉醇可以通過配伍南方紅豆杉總多糖達(dá)到增效減毒作用，但該作用的具體機(jī)制尚不明確。

因此，本研究通過建立S180小鼠荷瘤模型，采用HE染色、TUNEL染色、免疫組化、Western blot等方法對南方紅豆杉總多糖與紫杉醇聯(lián)用抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步高效、綜合利用南方紅豆杉資源提供研究思路，并且為減少紫杉醇臨床用量、耐藥性等提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 RM2235型石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司）；TM 3型石蠟包埋機(jī)（英國Shandon Histocentre公司）；BX20型熒光顯微鏡攝像機(jī)（日本奧林巴斯公司）；TGL-16G型低溫高速離心機(jī)（上海飛鴿公司）；165-1801型電泳槽（美國伯樂公司）；WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀（ATTO CORPORATION）；YT-613型拷片機(jī)（湖北省孝感亞光運(yùn)用電子技術(shù)研究所）；DSHZ-300型多用途水浴恒溫震蕩器（江蘇太倉實(shí)驗儀器廠）；LD-UPWF型純水儀（美國密理博公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國上海精宏醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.1.2材料與試劑 紫杉醇（臨用前生理鹽水稀釋，HPLC ≥ 98%，上海金穗生物科技有限公司，批號：124977-28-5）；過硫酸銨、丙烯酰胺、中性樹膠（西格瑪公司）；考馬斯亮藍(lán)G250和R250（上海研域試劑有限公司，批號：140306）；蛋白酶K（上海江萊生物科技有限公司，批號：140306）；石蠟（浙江東騰蠟業(yè)有限公司）；二甲苯（分析純）（嘉興市中昊化工有限公司）；麗春紅（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限）；PVDF膜（上海麗臣生物科技有限公司）；Trizol（美國英杰生命技術(shù)公司）。

山羊抗小鼠二抗（HRP標(biāo)記）購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；免疫組化檢測EnVisionTM試劑盒購自丹麥DAKO公司；β-catenin抗體（BA0426）、CDK4抗 體（BA0310） 、Survivin抗 體（BA1420）購自武漢博士德生物技術(shù)有限公；Cyclin-Dl抗體（sc-8396）、Bcl-2抗體（sc-492）、Bax抗體（sc-526）購自美國Santacruz公司。

1.1.3藥材 南方紅豆杉采自浙江省寧?？h雙峰鄉(xiāng)種植基地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)俞冰副教授鑒定為正品南方紅豆杉Taxus chinensis（Pilg.）Rehd. var.mairei（Lemee et Levl.）Cheng et L. K.Fu，總多糖由浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校實(shí)驗室提取分離，純度 > 50%[6]。

1.1.4動物、瘤株 鼠肉瘤S180腫瘤細(xì)胞由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子醫(yī)學(xué)中心提供；ICR小鼠，40只，雌雄各半，體質(zhì)量為（20 ± 3）g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2014-0033，使用許可證：SYXK（浙）2014-0113。

1.2 方法

1.2.1分組、造模與給藥 將凍存的鼠肉瘤S180腫瘤細(xì)胞懸液接種到ICR小鼠腹腔內(nèi)傳代，無菌條件下抽取腹水，冰浴條件下滅菌生理鹽水稀釋，混勻制成1×106個/mL腫瘤細(xì)胞混懸液（鏡下計數(shù)）。取ICR小鼠40只，雌雄各半，按混交均勻表隨機(jī)分為4組，每組10只。將S180腫瘤細(xì)胞混懸液按每只0.2 mL接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下。3組給藥組分別按紫杉醇0.025 mg/g、紅豆杉多糖1.332 mg/g、紫杉醇0.025 mg/g +紅豆杉多糖1.332 mg/g進(jìn)行分組灌胃給藥，另1組給予生理鹽水，作為模型對照組，接瘤后連續(xù)給藥7 d，停藥后第2天，將腫瘤塊完整剝下[6]，稱量離體瘤塊重量，計算各組抑瘤率：抑瘤率（%） =[（模型組平均瘤重－實(shí)驗組平均瘤重）/模型組平均瘤重] × 100%。

1.2.2HE染色腫瘤組織病理檢測 上述腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋切片（厚度：4 μm），HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織病理特征。

1.2.3TUNEL染色檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡 上述腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚度：4 μm），TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞核呈棕色或黃色顆粒狀；陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色，無棕色顆粒。每張切片在顯微鏡200倍視野下，計數(shù)200個以上細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，換算成凋亡標(biāo)記指數(shù)。凋亡指數(shù)（%） =（視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)）×100%，然后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4免疫組化染色法檢測腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-Dl、CDK4、Bcl-2、Bax以 及Survivin蛋白的表達(dá) 上述腫瘤組織在中性緩沖福爾馬林（pH = 7.4）固定12 h后取材脫水、石蠟包埋、切片，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。鏡下觀察結(jié)果：在細(xì)胞漿和/或核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細(xì)胞。

β-catenin、Bcl-2、Bax和Survivin染色結(jié)果陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于移植瘤的腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)，少量在移植瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞。Cyclin-Dl陽性表達(dá)在移植瘤的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，CDK4陽性表達(dá)主要于移植瘤的腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)。

陽性計數(shù)如下：每張切片在200倍視野下計數(shù)，計數(shù)200個細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，換算成陽性率：陽性率（%）=（視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)）×100%，然后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.5Western blot檢測分析Bcl-2、Bax和Survivin蛋白水平 在采用免疫組化染色初步定性Bcl-2、Bax、Survivin蛋白表達(dá)后，進(jìn)一步采用Western blot對Bcl-2、Bax、Survivin蛋白進(jìn)行定性和定量檢測分析。取出冷凍保存的腫瘤組織，按Western blot檢測步驟進(jìn)行實(shí)驗，對X光片上的蛋白帶進(jìn)行掃描和半定量分析。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤重及抑瘤率結(jié)果

聯(lián)合用藥組對比模型組、紫杉醇組及多糖組，瘤重減少，腫瘤抑制率增加（P< 0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組瘤重及抑瘤率（±s, n = 10）Tab. 1 Tumor weight and tumor inhibition rate in each group （±s, n = 10）

表1 各組瘤重及抑瘤率（±s, n = 10）Tab. 1 Tumor weight and tumor inhibition rate in each group （±s, n = 10）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 瘤重/mg 抑瘤率/%模型對照組 1.22 ± 0.14 -紫杉醇組 0.87 ± 0.16* 28.69 ± 1.64*多糖組 0.91 ± 0.14 25.41 ± 0.00*聯(lián)合用藥組 0.58 ± 0.08*#& 52.46 ± 4.92*#&F 38.52 685.10 P 0.000 0.000

2.2 腫瘤組織病理HE染色結(jié)果

腫瘤組織的HE染色結(jié)果顯示（見圖1），模型組腫瘤組織表現(xiàn)出典型的腫瘤病理特征，即腫瘤細(xì)胞豐富、密集，細(xì)胞核大、不規(guī)則，細(xì)胞漿少等。與模型組相比，用藥后腫瘤細(xì)胞數(shù)減少，核皺縮，其中多糖組、紫杉醇組視野范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)減少較多，并出現(xiàn)較大的間隙；聯(lián)合用藥組相比紫杉醇組、多糖組，腫瘤細(xì)胞數(shù)目更少，形成的間隙更大。

圖1 S180小鼠腫瘤組織HE染色照（±s, n = 3, × 200）Fig.1 HE staining photograph of tumor tissue in S180 mice（±s, n = 3, × 200）

2.3 腫瘤組織細(xì)胞凋亡結(jié)果

腫瘤組織TUNEL染色結(jié)果（見圖2），模型組幾乎全是細(xì)胞核被蘇木素染為藍(lán)色的活細(xì)胞，僅見少數(shù)幾個棕色凋亡細(xì)胞，紫杉醇組、多糖組、聯(lián)合用藥組棕色凋亡細(xì)胞數(shù)量多于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。

圖2 各組對S180小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響（±s, n = 3, × 200）Fig.2 Effect of each group on apoptosis of tumor tissue in S180 mice（±s, n = 3, × 200）

2.4 免疫組化染色檢測腫瘤組織內(nèi)β-catenin、Cyclin-Dl、CDK4、Bcl-2、Bax以 及Survivin蛋 白表達(dá)水平

給藥后，聯(lián)合用藥組相比模型組、紫杉醇組、多糖組腫瘤組織內(nèi)β-catenin、Cyclin-Dl、Survivin蛋白表達(dá)減少（P< 0.05）；CDK4、Bcl-2蛋白給藥后，聯(lián)合用藥組相比模型組、多糖組減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。同時腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白，聯(lián)合用藥組相比模型組、多糖組增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），結(jié)果見表2、圖3。

表2 各組S180小鼠腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-D1、CDK4、Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)（±s, n = 3）Tab. 2 The expression of β-catenin, Cyclin-D1, CDK4, Bcl-2 , Bax and Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

表2 各組S180小鼠腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-D1、CDK4、Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)（±s, n = 3）Tab. 2 The expression of β-catenin, Cyclin-D1, CDK4, Bcl-2 , Bax and Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 β-catenin Cyclin-D1 CDK4 Bcl-2 Bax Survivin模型組 94.4 ± 11.3 84.5 ± 8.1 81.1 ± 9.3 87.5 ± 9.9 57.3 ± 5.4 90.4 ± 8.2紫杉醇組 15.2 ± 1.2* 42.5 ± 4.1* 63.2 ± 5.8* 22.6 ± 3.3* 79.0 ± 8.5* 81.8 ± 6.5多糖組 33.5 ± 2.2*# 75.2 ± 6.2# 72.9 ± 8.2 91.1 ± 8.4# 51.7 ± 6.2# 72.4 ± 3.2*聯(lián)合用藥組 9.7 ± 0.8*#& 28.8 ± 3.6*#& 54.4 ± 6.3*& 19.3 ± 2.2*& 77.2 ± 8.1*& 56.3 ± 5.3*#&F 447.90 208.30 27.30 338.80 37.27 57.70 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 Western blot檢測Bcl-2、Bax、Survivin蛋白表達(dá)水平

由表3、圖4可知，聯(lián)合用藥組相比模型組、紫杉醇組、多糖組腫瘤組織內(nèi)Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)水平減少，同時Bax、Bax/Bcl-2比值增大，與免疫組化觀察結(jié)果基本一致，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。

圖4 各組S180小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2、Survivin電泳條帶 （±s, n = 3）Fig.4 Electrophoresis of Bax, Bcl-2 and Survivin in tumor tissue of S180 mice in each group（±s, n = 3）

表3 S180腫瘤組織中Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)相對水平 （±s, n = 3）Tab. 3 The relative expression of Bax, Bcl-2, Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

表3 S180腫瘤組織中Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)相對水平 （±s, n = 3）Tab. 3 The relative expression of Bax, Bcl-2, Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Survivin模型組 0.29 ± 0.04 0.47 ± 0.06 0.65 ± 0.07 1.09 ± 0.11紫杉醇組 0.58 ± 0.07* 0.35 ± 0.01* 1.89 ± 0.22* 0.58 ± 0.06*多糖組 0.36 ± 0.03*# 0.44 ± 0.03# 0.80 ± 0.07*# 0.72 ± 0.07*聯(lián)合用藥組 0.91 ± 0.11*#& 0.29 ± 0.03*#& 3.29 ± 0.36*#& 0.42 ± 0.06*#&F 79.76 24.82 158.70 67.57 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

目前大多數(shù)抗癌藥機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤增殖，細(xì)胞凋亡信號通路調(diào)控異常是造成腫瘤耐藥現(xiàn)象的主要原因之一。凋亡信號通路主要有死亡受體介導(dǎo)途徑和線粒體凋亡途徑[7]，線粒體凋亡途徑一個重要步驟是線粒體膜電位下降引起線粒體膜一系列生化改變。Bcl-2家族蛋白主要作用位點(diǎn)在線粒體膜上，分為Bax、Bak等促凋亡蛋白以及Bcl-2等抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡發(fā)生中，Bax/Bcl-2比值是比單純抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白改變更為關(guān)鍵的指標(biāo)之一，比值升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。本研究結(jié)果觀察到紅豆杉總多糖與紫杉醇及其配伍給藥后，抗凋亡蛋白Bcl-2的數(shù)量明顯下降，而促凋亡蛋白Bax數(shù)量明顯上升，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P<0.05）。提示南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇促S180荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡作用與凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2家族相關(guān)，可能是通過線粒體途徑產(chǎn)生作用。

Cyclin-D1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，比其它Cyclin蛋白更敏感的一個指標(biāo)，被公認(rèn)為原癌基因[9-10]，Cyclin通過結(jié)合并激活CDK4，經(jīng)一系列反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。Wnt/β-catenin （β-連環(huán)蛋白）通路是調(diào)控細(xì)胞周期的重要通路，正常成熟細(xì)胞中沒有Wnt信號，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)被降解。胞漿內(nèi)β-catenin增多，是腫瘤發(fā)生過程的關(guān)鍵事件之一[12]。其大致關(guān)系是Wnt信號通路中β-catenin水平增加，激活Cyclin-D1基因表達(dá)，Cyclin-D1水平升高，激活CDKs，經(jīng)一系列反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞增殖導(dǎo)致腫瘤[13-14]?；诖?，本實(shí)驗檢測經(jīng)典Wnt信號通路中β-catenin表達(dá)水平，并觀察其下游靶蛋白Cyclin-Dl的表達(dá)以及被Cyclin-Dl特異性激活的CDK4。由實(shí)驗結(jié)果推測，初步認(rèn)為南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇影響腫瘤細(xì)胞周期的機(jī)制可能是通過對經(jīng)典Wnt信號通路負(fù)調(diào)控產(chǎn)生抗腫瘤作用。

Survivin蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，在幾乎所有腫瘤中均有分布，不僅具有抗凋亡作用，還有促增殖作用[15-17]。Survivin抑制細(xì)胞凋亡時，Cyclin-Dl同時過度表達(dá)，兩者協(xié)同作用使細(xì)胞增殖失控，Survivin與Cyclin-D1存在正相關(guān)。本實(shí)驗觀察到相比模型組、紫杉醇組，聯(lián)合用藥后Survivin與Cyclin-D1蛋白表達(dá)均下降（P< 0.05）。

4 結(jié)論

南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)S180荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生凋亡效應(yīng)，該效應(yīng)可能是通過線粒體途徑等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，對經(jīng)典Wnt信號通路負(fù)調(diào)控作用等抑制細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)，然機(jī)體凋亡機(jī)制復(fù)雜，其明確的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。