申 茹，徐英輝，郭玉巖，麥艷珍，余 巧，毛一中

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，廣東 惠州 516025；2.惠州市藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 惠州516025；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

達(dá)原飲出自明代醫(yī)家吳又可所著《溫疫論》，是開達(dá)膜原的代表方，方中檳榔辛散濕邪，草果辛香化濁，厚樸芳香化濁，白芍、知母清熱滋陰，黃芩清熱燥濕，甘草調(diào)和諸藥[1]，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)采用達(dá)原飲能辛散、燥濕、化濁，直達(dá)膜原，主治瘟疫或瘧疾邪伏膜原之證[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)達(dá)原飲被應(yīng)用于新型冠狀病毒肺炎的治療。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》和全國24個省市自治區(qū)衛(wèi)生管理部門發(fā)布的地方方案中有9個明確提出了達(dá)原飲的應(yīng)用[3]，尤其是對早期新型冠狀病毒肺炎起到較好作用。新型冠狀病毒中醫(yī)學(xué)稱為戾氣、癘氣、疫癘之氣等[3]。新冠肺炎患者早期多有身熱不揚、干咳痰少、倦怠乏力、口干不欲飲，伴納差、便溏、惡心欲嘔等消化道癥狀，舌質(zhì)多暗或邊尖稍紅，舌苔厚膩。國家中醫(yī)專家組根據(jù)采集的四診信息，辨證研判新冠肺炎[4-5]屬于“濕毒疫”，早期為濕毒郁肺，進(jìn)而出現(xiàn)疫邪困脾閉肺、化熱的一系列邪伏膜原相關(guān)臨床表現(xiàn)，提出從宣肺透邪、化濕解毒來論治，推薦處方之一是開達(dá)膜原的代表方達(dá)原飲。為了更好的發(fā)揮達(dá)原飲的療效，擬將其開發(fā)成現(xiàn)代中藥新劑型胃內(nèi)漂浮片，提高生物利用度的同時，也便于攜帶和使用，提高患者順應(yīng)性。

達(dá)原飲原方采取水煎煮法，但未建立多指標(biāo)成分的含量控制方法，為了使該處方藥材中活性成分最大獲得量，本實驗采用回流提取法以芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、芒果苷和新芒果苷為檢測指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行考察，為后期制劑工藝的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2040C型3D Plus高效液相色譜儀（日本島津公司）；DTY-124/223型電子天平［萬分之一，華志（福建）電子科技有限公司］；PS-40A型超聲波清潔機(jī)（深圳市科潔超聲科技有限公司）； HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；Eppendorf移液器（德國艾本德公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；超純水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；磷酸（分析純，臺山市粵僑試劑塑料有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

芍藥苷對照品（批號：191208）、新芒果苷對照品（批號：200618）、芒果苷對照品（批號：200116）、黃芩苷對照品（批號：200117）、漢黃芩苷對照品（批號：200719）、黃芩素對照品（批號：191206）均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，純度大于98%。

白芍、黃芩、知母、厚樸、甘草、草果、檳榔均購于北京同仁堂惠州藥店有限責(zé)任公司，經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德教授鑒定為正品，具體藥材信息見表1。

表1 藥材信息表Tab. 1 Information table of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷等6種有效成分含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm，2 μm）（日本島津公司）；檢測波長：芍藥苷230 nm，黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素280 nm，芒果苷、新芒果苷258 nm；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：0.5 μL，流動相為0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫條 件（0～5 min，12.5%～19% B；5～7 min，19%～24%B；7～9 min，24%～27%B；9～12 min，27%～32% B；12～14 min，32%～50%B；14～16 min，50%～70%B）。

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱定6種有效成分對照品適量，加入85%乙醇制成含芍藥苷85.93 μg/mL、黃 芩 苷372.88 μg/mL、漢 黃 芩 苷91.53 μg/mL、 黃 芩 素11.69 μg/mL、 芒 果 苷22.88 μg/mL、新芒果苷115.93 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 稱取達(dá)原飲處方量（白芍 3 g、黃芩 3 g、知母 3 g、厚樸 3 g、甘草 1.5 g、炒草果仁 1.5 g、檳榔 6 g）藥材粉末（過2號篩），加入20倍量85%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并濾液，定容，搖勻，即得。

2.1.4系統(tǒng)適用性試驗 取對照品、供試品、陰性對照溶液，按“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品和對照品均能得到較好的分離，陰性對照溶液在相應(yīng)保留時間無干擾。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.5線性關(guān)系考察 精密稱取6種有效成分對照品適量，用85%乙醇配制成對照品溶液，依次稀釋成6個不同濃度，分別進(jìn)樣0.5 μL，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab. 2 Regression equation，correlation coefficient and linear range

2.1.6方法學(xué)考察 6種有效成分精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗RSD均小于3%，符合相關(guān)要求。加樣回收率試驗結(jié)果顯示芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、芒果苷、新芒果苷平均加樣回收率分別為102.8%、101.9%、98.5%、99.2%、99.3%、99.7%，RSD均小于3%。

2.2 達(dá)原飲胃漂浮片提取工藝研究

2.2.1計算綜合得分 綜合得分：W=A× 0.2 +B×0.3 +C× 0.15 +D× 0.05 +E× 0.15 +F× 0.15[6]

A：芍藥苷含量；B：黃芩苷含量；C：漢黃芩苷含量；D：黃芩素含量；E：芒果苷含量；F：新芒果苷含量。

2.2.2提取方法考察 稱取達(dá)原飲處方藥材粉末6份，各加入20倍量85%乙醇，分別采用回流法1 h、超聲法1 h、冷浸法24 h、濾過，定容，按“2.1.1”項下色譜條件檢測6種有效成分含量，計算綜合得分，結(jié)果見圖2。

圖2 提取方法考察Fig.2 Extraction method study

由圖2可知，采用回流法1 h綜合得分最高，故選擇回流法為最佳提取方法。

2.2.3單因素考察 （1）溶劑濃度的篩選 稱取達(dá)原飲胃漂浮片處方量藥材，固定液料比為20∶1（mL/g），提取1 h，分別采用75%、85%、95%乙醇為提取溶劑，提取1次進(jìn)行試驗，按“2.1.1”項下方法測定含量并計算綜合得分，結(jié)果見表3。

表3 溶劑濃度考察結(jié)果Tab. 3 Single factor results of solvent concentration

（2）提取時間的篩選 稱取達(dá)原飲胃漂浮片處方量藥材，固定液料比為20∶1（mL/g），85%乙醇，分別提取0.5、1、1.5 h，提取1次進(jìn)行試驗，按“2.1.1”項下方法測定含量并計算綜合得分，結(jié)果見表4。

表4 提取時間考察結(jié)果Tab. 4 Single factor results of extraction time

（3）提取次數(shù)的篩選 稱取達(dá)原飲胃漂浮片處方量藥材，固定液料比為20∶1 （mL/g），85%乙醇，提取1 h，分別提取1次、2次、3次進(jìn)行試驗，按“2.1.1”項下方法測定含量并計算綜合得分，結(jié)果見表5。

表5 提取次數(shù)考察結(jié)果Tab. 5 Single factor results of extraction times

（4）料液比的篩選 稱取達(dá)原飲胃漂浮片處方量藥材，85%乙醇，提取1 h，分別選擇15∶1、18∶1、20∶1 （mL/g），提取1次進(jìn)行試驗，按“2.1.1”項下測定含量并計算綜合得分，結(jié)果見表6。

表6 料液比單因素考察結(jié)果Tab. 6 Single factor results of solid-liquid ratio

2.2.4正交試驗

在單因素考察基礎(chǔ)上，選擇溶劑濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察對象，采用L9（34）正交試驗對達(dá)原飲胃漂浮片藥材提取工藝進(jìn)行考察，篩選出最佳提取工藝，試驗結(jié)果見表7 ～ 9。

表7 因素與水平表Tab. 7 Factor and level table

由表8直觀分析結(jié)果可知，回流提取法中各因素對6種有效成分含量綜合得分影響的大小順序是溶劑濃度>提取時間>料液比>提取次數(shù)。達(dá)原飲胃漂浮片藥材最佳提取工藝為A2B3C2D2，即85%乙醇，料液比為20∶1，提取時間為1 h，提取2次。由表9方差分析結(jié)果表明，因素A具有顯著性差異，P<0.05，其它因素不顯著。因此，確定達(dá)原飲胃漂浮片藥材提取最佳工藝：取達(dá)原飲7味處方量藥材，加入20倍量的85%乙醇回流提取2次，每次1 h。

表8 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab. 8 Orthogonal experimental design and results

表9 正交試驗方差分析表Tab. 9 Variance analysis of orthogonal experimental design

2.2.5驗證試驗 將達(dá)原飲胃漂浮片處方量藥材放大10倍，按正交試驗優(yōu)化出的最佳提取工藝進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果見表10。

表10 驗證試驗結(jié)果Tab. 10 Verification testing results

由表10可知，三批工藝驗證試驗芍藥苷含量均值為2.94%，黃芩苷含量均值為12.84%，漢黃芩苷含量均值為2.92%，黃芩素含量均值為0.15%，芒果苷含量均值為2.58%，新芒果苷含量均值為1.72%，RSD值均小于1%，證明達(dá)原飲胃漂浮片藥材提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

達(dá)原飲由檳榔、草果、厚樸、白芍、黃芩、知母和甘草七味藥組成。檳榔為君藥，主要活性成分為檳榔堿，檳榔堿在高溫下容易分解，采用回流提取法會導(dǎo)致檳榔堿含量減少，且檳榔堿是小分子生物堿，在C18柱上幾乎無保留，難以成為穩(wěn)定的質(zhì)控指標(biāo)[7-9]。參照《中國藥典》及文獻(xiàn)報道，白芍有效成分為芍藥苷[10-11]；黃芩中主要活性成分為黃酮類化學(xué)成分，其中黃芩苷、漢黃芩苷及黃芩素活性明顯[12-13]；知母的有效成分為芒果苷和新芒果苷[14-15]。以多指標(biāo)成分評價可有效控制達(dá)原飲的質(zhì)量，據(jù)此，本實驗以芍藥苷等6種活性成分為指標(biāo)優(yōu)化達(dá)原飲胃漂浮片提取工藝。

將達(dá)原飲供試品溶液通過HPLC二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，6種活性成分分別在230、280和258 nm波長下基線平穩(wěn)，完全分離，且色譜峰面積最大，故選擇芍藥苷最大吸收波長為230 nm，黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素最大吸收波長為280 nm，芒果苷和新芒果苷最大吸收波長為258 nm。

采用HPLC法對6種有效成分含量進(jìn)行測定，考察不同系統(tǒng)和比例的流動相，如甲醇-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液對分離效果的影響，結(jié)果顯示乙腈-0.05%磷酸分離效果最好，并對該系統(tǒng)不同體積比進(jìn)行優(yōu)選，確定梯度洗脫程序6種有效成分保留時間適當(dāng)，13 min內(nèi)全部分離，且峰形好，分離度和理論塔板數(shù)均符合《中國藥典》要求。

4 結(jié)論

本實驗以芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、芒果苷和新芒果苷為指標(biāo)成分，采用單因素及正交試驗法對達(dá)原飲胃漂浮片藥材進(jìn)行提取工藝考察，確定最佳提取工藝為20倍量的85%乙醇提取2次，每次1 h，且回流提取法操作簡單易行，為后期達(dá)原飲胃漂浮片的制備和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。