丁雙玉 任 毅 宮國義 張海英 郭紹貴 于泳濤 李茂營 張 潔 許 勇*

（1 北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2 北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業(yè)農村部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京蔬菜種質改良實驗室，北京 100097）

西瓜（Citrullus lanatus）是我國重要的園藝作物，秋茬栽培西瓜果實膨大期常出現(xiàn)低溫脅迫導致果實膨大速度慢，糖度下降，影響西瓜的產量和品質。因此，研究低溫影響下西瓜果實糖分積累的響應基因對于提高秋茬西瓜的產量和品質具有重要意義。

低溫會引起作物果實的生理生化水平發(fā)生變化（Keller &Steffen，1995），其中可溶性糖含量變化是重要的理化指標之一（Shao et al.，2013）。關于低溫引起作物果實糖分變化的研究已有較多報道，糖與低溫逆境的關聯(lián)現(xiàn)象最先在馬鈴薯塊莖上被發(fā)現(xiàn)（Gounaris，2001），而后在甜瓜（郝敬虹等，2009）、番茄（王麗娟和李天來，2011）、黃瓜（Gu et al.，2017）、甘蔗（Selvarajan et al.，2018）中也檢測到果實可溶性糖含量變化與低溫關聯(lián)。低溫弱光可降低果實含糖量，郝敬虹（2009）在甜瓜果實膨大期進行夜間9 ℃處理，結果表明低溫顯著降低了果糖（Fructose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、棉籽糖（Raffinose）和水蘇糖（Stachyose）含量；王麗娟和李天來（2011）發(fā)現(xiàn)，低溫下番茄膨大期果實中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量均較常溫處理下降。

果實糖分積累與溫度密切相關，已有研究主要集中于低溫下不同種質資源糖代謝酶活性和可溶性糖含量的變化，材料遺傳背景差異較大，尚未利用突變體材料挖掘糖分積累關鍵基因的表達和可溶性糖含量的關系。低溫條件下果實糖含量變化的分子機理尚未取得突破，尤其是在西瓜中被低溫抑制的關鍵糖代謝酶基因調控果實糖分積累的分子機制還鮮見報道。研究低溫條件下西瓜果實發(fā)育階段糖代謝關鍵酶基因的作用及調控機制具有重要的理論與實踐意義。

堿性α-半乳糖苷酶AGA2（alkaline alphagalactosidase）是將西瓜果實棉籽糖家族寡糖（raffinose family oligosaccharides，RFOs）水解為蔗糖的關鍵酶（Ren et al.，2021），本試驗通過對低溫弱光條件下aga2突變體果實進行轉錄組測序，以期明確aga2果實在低溫弱光條件下糖含量下降與糖代謝關鍵酶基因表達之間的關系，為西瓜果實響應低溫弱光環(huán)境的糖代謝調控機制的建立以及后續(xù)進行的遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

aga2是堿性α-半乳糖苷酶（AGA2）基因突變株系，由北京市農林科學院蔬菜研究中心西瓜課題組提供，2019年7月下旬定植于北京市農林科學院蔬菜研究中心試驗農場，常規(guī)田間生產管理；低溫處理（low temperature，簡稱LT）比正常溫度的對照（normal temperature，簡稱NT）定植時間晚7 d，9月下旬開始授粉，授粉后20 d左右開始感受低溫。由于晚7 d定植，低溫處理的aga2果實生長期間溫度為10～25 ℃，有效積溫700 ℃左右，光照強度為100 μmol·m-2·s-1左右；正常溫度的對照aga2突變體果實生長期間溫度為25～35 ℃，有效積溫900 ℃左右，光照強度為300 μmol·m-2·s-1左右。授粉后34 d，果實進入糖分積累的最后階段，分別取不含種子的中心果肉，3次重復，分別標記為LT34M-1、LT34M-2、LT34M-3、NT34M-1、NT34M-2、NT34M-3，置于-80 ℃冰箱保存。

糖含量測定依據 Hu等（2009）的方法，并加以改進。取樣品3 g在研缽中充分研磨后加入 5 mL 80%乙醇，再研磨3 min，置于10 mL離心管中，80 ℃水浴保溫30 min，取出冷卻至室溫，離心后收集上清液，殘渣在80 ℃水浴中反復再抽提2次，合并3次抽提液，轉入旋轉蒸干儀中，在45 ℃低溫蒸干，用1 mL超純水溶解，轉入1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，0.45 μm水相濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱，柱溫35 ℃，2410示差折光檢測器，流動相比例為70%乙腈∶30%超純水，流速為1.0 mL ·min-1，糖分標準品均購自sigma公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖標準品保留時間分別為：5.544、6.716、8.247、12.200 min。

提取aga2突變體果實總RNA，RNA樣品經純度、濃度和完整性檢測等，構建 cDNA分子文庫，再對文庫的質量進行檢測。轉錄組文庫構建、高通量測序和序列組裝工作均由北京奧維森基因科技有限公司完成。利用Illumina二代高通量測序平臺，采用PE150測序策略得到raw reads pairs，對各樣本的原始測序數(shù)據進行過濾質控后得到clean reads pairs，分別利用Tophat 2和Cufflinks完成比對和轉錄本拼接分析，對所有基因進行定量分析，計算各基因的表達水平，定量指標為 TPM（transcripts per million reads）。利 用 DESeq2軟 件進行基因差異表達分析，以Padjust ＜0.05和|log2（fold change）|≥1為標準篩選差異表達基因（differential expressed gene，DEG）。將差異表達基因與 GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據庫進行比對，對差異表達基因進行功能富集分析，采用Goseq軟件進行 GO富集分析，此方法基于Wallenius non-central超幾何分布，能更準確地計算出差異基因所富集的GO term的概率。Pathway顯著性富集分析以KEGG數(shù)據庫中Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出差異表達基因顯著性富集的Pathway，以Padjust ＜0.05為閾值，滿足此條件則認為此GO功能/KEGG通路存在顯著富集情況。

對轉錄組測序中的候選基因進行qRT-PCR驗證，并利用 Primer 5.0軟件設計擴增引物（表1），采用qPCR的方法對其表達水平進行驗證。將各個處理的樣品總RNA反轉錄合成cDNA，以此為模板，進行qPCR反應，以西瓜Actin為內參，采用2–ΔΔCt法計算相對表達量（Livak &Schmittgen，2001），每個目的基因分別進行3次生物學重復和3次技術重復。

表1 qPCR反應所用引物

2 結果與分析

2.1 低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實表型及糖含量的變化

正常溫度和低溫弱光下的突變體西瓜果實表型差異明顯（圖1），低溫弱光下授粉34 d后的突變體果實明顯不成熟。由圖2可知，正常溫度下突變體的果實糖含量比低溫弱光下高50%左右，其中蔗糖（Suc）含量比低溫弱光下高1倍以上；二者蔗糖、果糖（Fru）、葡萄糖（Glc）含量均表現(xiàn)出極顯著差異，棉籽糖（Raf）含量差異不顯著。

圖1 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實表型差異

圖2 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實糖含量差異

2.2 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體差異表達基因概況

差異表達基因火山圖可以比較直觀地反映本組差異基因分布（圖3），比較LT34M vs NT34M的差異表達基因，將差異基因的閾值標準設定為：|log2（fold change）|≥1且Padjust ＜0.05，得到突變體西瓜果實中差異表達基因1 676個，其中上調基因686個，下調基因990個，下調基因個數(shù)約為上調基因的1.4倍，說明低溫弱光下突變體西瓜中更多基因被抑制表達。

圖3 差異表達基因火山圖

2.3 aga2 突變體西瓜果實中差異表達基因富集的主要代謝途徑

GO是一種廣泛應用于生物信息領域甚至整個生物領域的分類系統(tǒng)。它主要按照以下3個功能進行分類：細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）。差異基因GO富集的柱狀圖可以直觀地反映富集在生物過程、細胞組分和分子功能GO term上差異基因的數(shù)量分布。圖4顯示，LT34M vs NT34M中的下調差異基因主要富集在生物過程中的碳水化合物代謝過程（63個），下調差異基因主要富集在分子功能中的轉移酶（126個）、己糖轉移酶（27個）、糖基轉移酶（29個）、醇基磷酸轉移酶（66個）以及激酶（69個）5個亞類。

圖4 下調基因GO富集柱狀圖

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據庫的方法，可將基因及其表達信息作為一個整體網絡進行研究。通過KEGG分析LT34M vs NT34M的DEGs，共富集到112個通路，選擇富集程度靠前的代謝通路散點圖展開分析。下調基因主要富集在激素信號轉導（25個）、甾體生物合成（6個）、光合作用（7個）、二萜類生物合成（5個）、DNA復制（6個）、半乳糖代謝（6個）、次級代謝產物的生物合成（61個）以及類黃酮生物合成（3個）等代謝通路上。本試驗重點分析了差異基因中負調控的半乳糖代謝途徑，篩選此代謝通路上的差異表達關鍵基因，為后續(xù)研究西瓜果實糖代謝關鍵基因對溫度響應表達提供線索。

2.4 aga2 突變體西瓜果實中關鍵候選基因的篩選及半乳糖代謝途徑的分析

通過對差異基因進行GO注釋以及KEGG通路分析，并且根據差異基因表達量的變化以及差異表達倍數(shù)，篩選出在低溫弱光條件下與西瓜果實糖分積累相關的候選基因（表2）。聚類熱圖可以直觀地反映出正常溫度和低溫弱光下突變體西瓜果實中關鍵基因的變化情況，如圖5所示，經過標準化處理后差異基因類似或相同的表達模式聚類到一起。上調表達的基因主要是MYB、NAC、WRKY家族中的基因，下調表達的基因主要是肌醇半乳糖苷合酶（galactinol synthase，GAS）（Cla009222）和AGA（Cla019238、Cla022883）等半乳糖代謝途徑中的關鍵基因。半乳糖代謝是糖分積累的重要途徑，GAS合成棉籽糖合成前體—肌醇半乳糖苷（Galactinol），隨后棉籽糖通過AGA水解成蔗糖和半乳糖（Galactose）。

圖5 差異基因表達的聚類分析結果

表2 差異表達候選基因信息

通過分析差異基因通路及其表達量發(fā)現(xiàn)（圖6），低溫弱光下突變體中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表達均被下調，它們的差異倍數(shù)分別是15.0、2.7、3.5倍。

圖6 KEGG中半乳糖代謝途徑基因表達量分析

2.5 qRT-PCR分析

將圖4中的DEGs進行qRT-PCR實時分析，以西瓜Actin基因（Cla97C02G026960）作為內參進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR中的DEGs的相對表達量與轉錄組水平相符（圖7），各基因在正常溫度和低溫弱光下的表達量趨勢一致，表明轉錄組水平分析結果可信。

圖7 差異表達基因qRT-PCR相對表達量

3 討論與結論

不同作物中糖代謝關鍵酶基因響應低溫條件下糖分積累的研究顯示，低溫可誘導果實中酸性轉化酶（acid invertase，AI）、中性轉化酶（neutral invertase，NI）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）的表達（余芳 等，2014）。在以蔗糖運輸為主的作物報道中，低溫可導致日本梨蔗糖含量下降和己糖積累，分別與蔗糖磷酸合成酶基因（PpSPS1）轉錄減少及酸性轉化酶基因（PpAIV1）表達增加有關（Itai &Tanahashi，2008）；對番茄進行夜間9 ℃亞低溫處理后發(fā)現(xiàn)果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量較常溫對照均下降，且果實中酸性轉化酶和中性轉化酶活性與葡萄糖和果糖的含量呈極顯著正相關，蔗糖合成酶活性與蔗糖含量呈極顯著正相關（王麗娟和李天來，2011）；玉米（Strand et al.，2003）、馬鈴薯（Wang et al.，2009）、桃（Wang et al.，2013）從轉錄組水平報道了低溫可以抑制蔗糖合成基因的轉錄表達，從而影響果實糖分積累。對于低溫弱光下棉籽糖家族寡糖運輸形式的葫蘆科作物糖含量變化的報道相對較少。甜瓜果實中水蘇糖和肌醇半乳糖苷含量下降主要是由于低溫抑制了甜瓜中肌醇半乳糖苷合酶（GAS）活性（郝敬虹，2009）；也有研究發(fā)現(xiàn)低溫下黃瓜葉肉細胞中的蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉籽糖、水蘇糖含量上升，其中肌醇半乳糖苷的上升是由于黃瓜肌醇半乳糖苷合酶中的GAS II和GAS III響應低溫上調表達所導致（曹文華，2015）；陸慢（2018）證實了4 ℃低溫脅迫后黃瓜中可溶性糖含量上升是由于3種水蘇糖合成酶基因（stachyose synthase，STS）轉錄本響應低溫從而上調表達。植物體內糖含量在低溫下的變化與糖代謝酶關鍵基因的轉錄水平密切相關。本試驗以aga2突變體西瓜果實作為材料，從轉錄組水平探索低溫下果實糖含量變化，即從響應低溫的GAS、AGA基因表達量的變化解釋了aga2果實糖含量顯著下降的現(xiàn)象。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)上調表達的基因主要是MYB（Cla018501、Cla004362、Cla010413、Cla013099、Cla000899）、NAC（Cla010201、Cla011761）、WRKY（Cla018026、Cla013967、Cla009557、Cla003370）等轉錄因子，MYB、NAC、WRKY轉錄因子中抵御低溫脅迫的基因在多種作物中被報道，MYB轉錄因子如西瓜中ClMYB46和Cla007586（高凌云，2016；曹蕾，2017）、蘋果中MdMYB88和MdMYB124等（謝銀鵬，2018）、玉米中的ZmMYB31（Li et al.，2019）等顯著上調表達響應低溫逆境。NAC轉錄因子如花生AhNAC2和AhNAC3基因（劉旭和李玲，2009）、芒 果Mi NACs（余海霞等，2016）、野生黃瓜HdNACs（趙艷青 等，2019）等上調表達抵御低溫。WRKY基因家族中分別發(fā)現(xiàn)了15個葡萄VvWRKYs（Wang et al.，2014）、10個番茄SlWRKYs（Chen et al.，2015）和12個西瓜ClWRKYs（Yang et al.，2018）均受低溫脅迫而顯著上調表達。

本試驗中半乳糖代謝途徑通路中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）在低溫下均顯著下調表達。西瓜中糖分積累模式是：UDP-半乳糖（UDP-galactose）和肌醇（Myoinositol）在肌醇半乳糖苷合酶的作用下合成肌醇半乳糖苷并生成UDP，肌醇半乳糖苷和蔗糖在棉籽糖合酶作用下合成棉籽糖和肌醇，韌皮部運輸?shù)拿拮烟潜沪?半乳糖苷酶（AGA）在果實中水解成蔗糖和半乳糖（圖6）（Carmi et al.，2003；Ren et al.，2021），蔗糖被果實韌皮部表達的糖轉運蛋 白ClVST1（vacuolar sugar transporter）卸載到果肉細胞間隙（Ren et al.，2020），棉籽糖的水解產物α-半乳糖（α-galactose）是UDP-葡萄糖（UDP-glucose）的合成底物，UDP-葡萄糖能與果糖在蔗糖磷酸合成酶作用下合成蔗糖?？梢?，α-半乳糖苷酶不但直接水解棉籽糖生成蔗糖，還提供了合成蔗糖原料UDP-葡萄糖的合成前體α-半乳糖（崔霞霞 等，2018）。aga2突變體中被敲除的ClAGA2基因在正常溫度和低溫弱光情況下均不表達，而低溫弱光下突變體表現(xiàn)出含糖量降低，說明突變體糖分積累并不完全依賴于此基因的表達，推測可能存在冗余蛋白能夠互補ClAGA2的功能且被低溫弱光抑制，使得aga2突變體西瓜糖分積累下降。分析差異基因通路及其表達量發(fā)現(xiàn)低溫弱光下突變體中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表達均顯著下調，說明Cla009222、Cla019238、Cla022883基因很可能是參與低溫弱光介導的控制棉籽糖在西瓜果實中卸載的關鍵基因。推測低溫抑制了該基因的表達從而抑制了α-半乳糖苷酶家族的整體活性，進而影響了棉籽糖水解為蔗糖，從而導致了低溫弱光下突變體果實的糖含量下降。這與郝敬虹（2009）在低溫下甜瓜中糖代謝酶的研究結果相似。綜上所述，推測響應低溫弱光的GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）共同下調表達可能是導致突變體西瓜果實光合產物不能充分完成糖代謝最終造成果實糖含量下降的主要原因。

本試驗通過轉錄組數(shù)據分析，推測低溫條件下西瓜果實糖含量下降的內在因子很可能是棉籽糖合成與卸載的關鍵酶基因下調表達所致，為西瓜果實響應低溫脅迫的糖代謝調控網絡研究奠定了基礎。