謝星 劉楚君 陳晉元 賀兆源 盧陽 王冉 謝愷舟

摘要：建立了鵝肉中青霉素G殘留的柱前衍生-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。鵝肉通過加速溶劑萃?。ˋSE 350），0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH值8.0）提取，所得提取液過HLB（60 mg/3 mL）固相萃取柱凈化，凈化液經(jīng)N2吹干后，乙醇復(fù)溶，三甲基硅烷基重氮甲烷（TMSD）衍生，所得衍生產(chǎn)物供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）檢測分析，色譜柱為TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），采用EI模式，全掃描（SCAN）和選擇離子監(jiān)測（SIM）方式定性，選擇反應(yīng)監(jiān)測（Auto SRM）方式結(jié)合外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，鵝肉中青霉素G在4.50～100.00 μg/kg添加范圍時，回收率為80.67%～91.02%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.57%～2.58%，日內(nèi)RSD為2.72%～4.47%，日間RSD為3.51%～5.14%。鵝肉中青霉素G檢測限為1.50 μg/kg，定量限為4.50 μg/kg，該方法靈敏度高，定性、定量準(zhǔn)確，適用于鵝肉中青霉素G殘留的確證檢測。

關(guān)鍵詞：鵝肉;青霉素G;殘留;柱前衍生;氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：TS251.7?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0132-06

收稿日期：2020-09-06

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-41-G23）;江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（編號：PAPD）。

作者簡介：謝 星（1989—），女，江蘇揚(yáng)州人，博士，助理研究員，主要從事動物產(chǎn)品安全研究。Email：yzxx1989@163.com。

通信作者：謝愷舟，博士，教授，主要從事動物產(chǎn)品品質(zhì)、安全與獸藥殘留檢測方法研究。E-mail：yzxkz168@163.com。

青霉素G主要作用于革蘭氏陽性菌，是臨床上常用的一類抗生素。對家禽而言，青霉素G可以預(yù)防敏感菌所致的全身（局部）感染 [1]，應(yīng)用過程中常存在使用不合理和不規(guī)范現(xiàn)象，導(dǎo)致禽肉中青霉素G殘留量超標(biāo)，最終危害人體健康。因此，各國對動物性組織中青霉素G殘留限量制定了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，其中，歐盟、日本、加拿大和中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定雞組織中青霉素G的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）均為50 μg/kg [2-5]。本研究參考上述MRL標(biāo)準(zhǔn)建立鵝肉中青霉素G殘留的確證檢測方法。

目前，國內(nèi)外關(guān)于檢測動物性食品中青霉素G的方法雖然已有微生物法 [6]、免疫分析法 [7]、薄層色譜法 [8]、高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV） [9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS） [10]等，但使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）檢測動物性組織中青霉素G殘留的方法還未有報道。與其他方法相比，柱前衍生-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、前處理簡單和快速。因此，本研究旨在建立GC-MS/MS檢測鵝肉中青霉素G殘留的確證分析方法，為動物源性食品中青霉素G殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有Trace 1300型氣相色譜儀、TSQ 8000型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Triplus RSH自動進(jìn)樣器）（美國Thermo Fisher公司）、加速溶劑萃取儀（ASE 350型，美國Thermo Fisher公司）;電子分析天平（AE260S型，瑞士Mettler Toledo公司）;漩渦混合器（G560E型，美國Scientific Industries有限公司）;全自動多管渦旋振蕩器（TBOYS型，美國Troemner有限責(zé)任公司）;烘箱（FD115型，德國Binder公司）;氮吹儀（N-EVAP-112型，美國Organomation公司）;超純水制備儀[Smart2-Pure型，賽默飛世爾科技（中國）有限公司];實驗室pH計[FE20型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]等。

青霉素G鉀標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，CAS號為113-98-4，美國SIGMA-ALDRICH有限公司）;三甲基硅烷基重氮甲烷[TMSD，CAS號為18107-18-1，阿拉丁試劑（上海）有限公司];乙腈、甲醇（色譜純，美國Merck有限公司）;乙醇（色譜純，美國Fisher公司）;十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、正己烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;超純水 [電阻率為18.2 MΩ·cm（25 ℃），符合國家實驗室用水標(biāo)準(zhǔn)（GB 6682—1992）]。

1.2 主要溶液的配制

準(zhǔn)確稱取青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品10.20 mg（純度為98%）置于10 mL的棕色容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，并將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用乙醇分別準(zhǔn)確逐級稀釋成100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取67.7 g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和1.5 g磷酸二氫鉀（KH2PO4），采用超純水溶解并定容至1 000 mL，配成0.2 mol/L pH值8.0的磷酸鹽緩沖溶液。

10%氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉固體1.0 g，用超純水溶解并定容至10 mL，配成10 mg/g氫氧化鈉溶液。

1%甲醇乙腈溶液：量取5 mL甲醇于500 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配成1%甲醇乙腈溶液。

80%乙腈：量取20 mL水于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配成80%乙腈溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗鵝飼養(yǎng)與樣品采集

隨機(jī)選取70日齡揚(yáng)州鵝（揚(yáng)州天歌鵝業(yè)發(fā)展有限公司）公鵝10羽、母鵝10羽，單籠飼養(yǎng)，試驗期間均飼喂不添加任何藥物的全價飼料（揚(yáng)州市揚(yáng)大飼料廠提供），自由飲水。飼養(yǎng)14日后屠宰，采集試驗鵝胸大肌肌肉作為空白樣品，分裝并密封，置于-34 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱?。?.0±0.02） g均質(zhì)好的空白樣品和4.0 g硅藻土置于研缽中，將其研磨成小顆粒，填入22 mL萃取池，萃取池置于ASE 350進(jìn)行提取，設(shè)置參數(shù)，壓力：10.34 MPa;加熱溫度：30 ℃;靜態(tài)提取時間：5 min;沖洗溶劑總量：40%;每個樣品之間自動沖洗1次;氮氣吹掃時間：60 s;首先用正己烷去除樣品中的脂肪，提取1次，棄掉提取液;其次用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH值8.0）提取樣品中的目標(biāo)物，提取2次，收集提取液，待用。

1.3.3 樣品凈化與濃縮

將“1.3.2”節(jié)中收集的提取液經(jīng)過HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）凈化，自動固相萃取步驟見表1。收集的洗脫液置于氮吹儀中35 ℃吹干，待用。

1.3.4 樣品復(fù)溶與衍生化

將“1.3.3”節(jié)中氮吹至干的凈化收集液加入100 μL乙醇溶解，渦旋混勻1 min，然后加入400 μL TMSD，密封，于30 ℃烘箱中避光反應(yīng)30 min后取出，乙醇定容至1.0 mL，然后轉(zhuǎn)移至2.0 mL具塞離心管中，渦旋混勻1 min，常溫下12 000 r/min離心10 min，經(jīng)過0.22 μm有機(jī)相針頭式濾器過濾，濾液供GC-MS/MS檢測。

1.3.5 氣相色譜與質(zhì)譜條件

毛細(xì)管色譜柱：TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Thermo Fisher公司）;載氣：高純氦氣（>99.999%，413.7 kPa），流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣口溫度：280 ℃;分流模式：不分流進(jìn)樣;分流流量：50.0 mL/min;不分流時間：1.0 min;載氣模式：恒流模式;載氣流速：1.0 mL/min;2 min后開閥，載氣節(jié)省時間2 min，載氣節(jié)省流量20.0 mL/min;進(jìn)樣體積：1.0 μL。程序升溫步驟見表2。

電離模式：電子轟擊離子源（EI）;電子束能量（電離能）：70 eV;碰撞氣：高純氬氣（>99.999%，275.8 KPa）;離子源溫度：280 ℃;傳輸線溫度：280 ℃;溶劑延遲：5.0 min;采集數(shù)據(jù)模式：全掃描（SCAN）和選擇離子監(jiān)測（SIM）方式定性，選擇反應(yīng)監(jiān)測（Auto SRM）方式定量。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按“1.3.2”節(jié)處理方法制備空白鵝肉基質(zhì)提取液，分別移取適量的空白基質(zhì)提取逐級稀釋青霉素G的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使青霉素G的添加濃度為定量限（LOQ）、15.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg/kg。將各濃度樣品按“1.3.3”節(jié)、“1.3.4”節(jié)樣品前處理方式進(jìn)行GC-MS/MS檢測分析，每個濃度重復(fù)測定6次，取平均值。以青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液在空白基質(zhì)中添加濃度為橫坐標(biāo)（x），以青霉素G衍生產(chǎn)物的定量離子對m/z 174.1>114.1*的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并作為待測樣品的定量曲線。

1.3.7 樣品加標(biāo)回收率和精密度測定

準(zhǔn)確稱取2.0 g均質(zhì)好的空白鵝肌肉樣品，按“1.3.2”節(jié)的方法將空白樣品與硅藻土充分研磨均勻，加入青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，使其最終在每個空白樣品中的添加濃度為LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL，每個添加濃度設(shè)6個平行，按“1.3.3”節(jié)、“1.3.4”節(jié)的方法處理進(jìn)行GC-MS/MS檢測，最終將檢測結(jié)果帶入空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得濃度，計算樣品加標(biāo)回收率。將LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL濃度樣品在1 d內(nèi)不同時間用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線和1周內(nèi)不同天和不同標(biāo)準(zhǔn)曲線用均用同一臺GC-MS/MS重復(fù)測定6次，分別計算日內(nèi)和日間精密度。

1.3.8 靈敏度測定

采用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋低濃度的青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液，用已建立的GC-MS/MS 方法進(jìn)行檢測。每個濃度進(jìn)行6次重復(fù)測定，計算平均信噪比（S/N）。當(dāng)S/N≥3時，所對應(yīng)的青霉素G濃度作為該方法的檢測限（LOD）;當(dāng)S/N≥10時，所對應(yīng)的青霉素G濃度作為該方法的定量限（LOQ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 母離子和子離子的確定

準(zhǔn)確吸取青霉素G與TMSD衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 μg/mL）用電子轟擊離子源（EI）進(jìn)行全掃描（Full SCAN）和選擇離子掃描（SIM），獲得衍生產(chǎn)物的全掃描色譜圖和質(zhì)譜圖，根據(jù)質(zhì)譜圖分析特征離子結(jié)構(gòu)，同時，參照Preu等提出的青霉素G與重氮甲烷反應(yīng)的質(zhì)譜圖結(jié)構(gòu)和梯度試驗 [11]，挑選質(zhì)荷比（m/z）比較大且豐度比較高的母離子，最終得到衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。由圖1可知，青霉素G衍生產(chǎn)物的母離子是m/z 174.1。

確定好母離子（即定量離子）后，就需考慮子離子（即定性離子）的選擇。采用Auto SRM優(yōu)化儀器方法，查看母離子在不同碰撞能下產(chǎn)生的子離子碎片強(qiáng)度信息，選擇合適的碰撞能和較大強(qiáng)度的碎片離子作為子離子。由母離子與子離子組合為監(jiān)測離子對。為對青霉素G衍生產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量，本研究選擇3個響應(yīng)強(qiáng)度較高且穩(wěn)定存在的監(jiān)測離子對。青霉素G三甲基硅甲酯的保留時間和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.2 色譜圖

空白鵝肉樣品總離子流色譜圖（TIC）和定量、定性離子的質(zhì)量色譜圖（MC）及空白鵝肉添加50.0 μg/kg 青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖（TIC）和定量、定性離子的質(zhì)譜圖（MC）。由圖2、圖3可知，在優(yōu)化的樣品前處理和GC-MS/MS條件下，青霉素G與TMSD反應(yīng)的衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)良好地分離，峰形正常良好，保留時間在10.85 min。

2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同空白基質(zhì)中添加濃度為橫坐標(biāo)（x），青霉素G衍生產(chǎn)物的定量離子對m/z 174.1 > 114.1*的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。由圖4可知，青霉素G線性范圍為4.50～200.0 μg/kg時，回歸方程為y=27 567x-38 053，決定系數(shù)r2為0.999 6。

2.4 添加回收率和精密度

青霉素G在空白鵝肌肉的添加濃度為LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL時，青霉素G的添加回收率及精密度見表4。由表4可知，青霉素G在鵝肌肉中的添加濃度范圍在LOQ～2.0 MRL之間時，青霉素G在鵝肌肉中的添加回收率為80.67%～91.02%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.57%～2.58%，日內(nèi)RSD為2.72%～4.47%，日間RSD為3.51%～5.14%。

2.5 檢測限與定量限

經(jīng)靈敏度測定，鵝肌肉中青霉素G的檢測限（LOD）為1.50 μg/kg、定量限（LOQ）為4.50 μg/kg。

3 討論

3.1 毛細(xì)管色譜柱的選擇

由于青霉素G屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，其β-內(nèi)酰胺環(huán)的羰基α-碳上有一個酰胺基側(cè)鏈，而在它稠和的環(huán)上有1個2位-羧基 [12]，故青霉素G屬于強(qiáng)極性化合物。因為GC-MS/MS只能檢測極性低、沸點低的化合物，所以不能直接檢測青霉素G，需將其進(jìn)行衍生化反應(yīng)，降低其極性，才能用GC-MS/MS檢測。由于不知衍生產(chǎn)物的極性大小，所以本試驗采用盲摸原則（色譜柱極性由弱到強(qiáng)）和固定相相似性原則（固定相與待測物極性的相似性）進(jìn)行操作。試驗初期先采用實驗室現(xiàn)有的非極性毛細(xì)管色譜柱TG-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，5%-二苯基-95%-二甲基硅氧烷），發(fā)現(xiàn)無法檢測到未知衍生物，然后又參考Preu等在GC-MS檢測牛肉中的青霉素G時，選用Rtx-1（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）非極性毛細(xì)管色譜柱 [11]，結(jié)果青霉素G峰形良好。綜合來看，青霉素G衍生物極性很弱，需選用比TG-5MS極性還要低的毛細(xì)管色譜柱。本試驗最終選擇TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm，100%聚二甲基硅氧烷）毛細(xì)管色譜柱檢測鵝肉中的青霉素G殘留，發(fā)現(xiàn)青霉素G峰形更好，與Preu等報道的結(jié)果 [11]一致。這是因為TG-1MS為完全非極性毛細(xì)管色譜柱，惰性更高，可保證良好峰形和靈敏度，適用于難以分析的化合物;可降低基線噪聲，提高信噪比;耐受溫度可達(dá)330 ℃或350 ℃，高溫操作時也不會出現(xiàn)柱流失。

3.2 衍生化試劑的選擇與衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

衍生化試劑種類很多，包括甲硅烷基化試劑、?；噭?、烷基化試劑及酯化試劑等。重氮甲烷是烷基化試劑中常用的甲基化試劑，主要將羧酸轉(zhuǎn)化為甲酯（重氮鏈），然后通過GC-MS/MS進(jìn)行測定。Preu等 [11]、伊冰 [13]都曾用重氮甲烷衍生青霉素G，前者采用的是GC-MS結(jié)合內(nèi)標(biāo)法，結(jié)果良好，后者是GC結(jié)合外標(biāo)法，結(jié)果較差。雖然重氮甲烷與羧酸類化合物反應(yīng)迅速，但需現(xiàn)用現(xiàn)配，否則會在色譜圖中產(chǎn)生雜峰，且不易制備和分解較快，同時具有高毒性、熱不穩(wěn)定性和易爆炸性等性質(zhì) [14]。本試驗也對此進(jìn)行驗證，最終效果不理想，得出重氮甲烷并不是實驗室常用衍生試劑的最佳選擇，需要找一個更安全、穩(wěn)定的替代試劑。三甲基硅烷基重氮甲烷（TMSD）與重氮甲烷具有相同的衍生能力，而且TMSD具有無毒、安全、穩(wěn)定的性質(zhì)，更方便合成藥物用于分析，也更適用于實驗室操作。TMSD主要是通過用三甲基甲硅烷基取代一個氫來克服重氮甲烷的缺點 [15-16]。雖然TMSD是重氮甲烷的安全替代品，但用TMSD作為青霉素G的衍生化試劑目前尚未見報道，因此需驗證TMSD能否與青霉素G發(fā)生反應(yīng)。本試驗首先將TMSD、青霉素G及二者的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜點板并在紫外分析儀下照射，觀察是否發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生產(chǎn)物的點處于最前端，證明有反應(yīng)發(fā)生，然后用GC-MS/MS 測定分析;同時參考Presser等 [16]、Ranz等 [17]、Rompa等 [18]采用TMSD衍生羧酸類物質(zhì)并用GC進(jìn)行分析檢測的方法，試驗結(jié)果良好。故本試驗最終采用GC-MS/MS結(jié)合外標(biāo)法檢測鵝肉中青霉素G殘留，選擇TMSD作為衍生化試劑，不需購買內(nèi)標(biāo)物，降低試驗成本，無需現(xiàn)用現(xiàn)配，保存周期長且不易分解，縮短樣品前處理過程，結(jié)果良好。綜上所述，本試驗選用TMSD作為衍生化試劑是最佳選擇。此外，本試驗對青霉素G衍生產(chǎn)物在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，由圖5可知，整體呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢，但8～12 h波動較大，可能與其反應(yīng)是否充分有關(guān)，然后從12 h往后青霉素G衍生產(chǎn)物開始分解。因此，青霉素G衍生產(chǎn)物最好能在24 h內(nèi)完成檢測分析。

3.3 氣相色譜和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

本試驗參照Preu等建立的方法 [11]，所得目標(biāo)物的峰形不好，且出峰時間較長，約21.08 min，因此需要優(yōu)化氣相色譜參數(shù)。通過反復(fù)優(yōu)化試驗，所得目標(biāo)物的峰形較好，且出峰時間大大縮短，最終篩選出氣相色譜最佳條件為：初始溫度100? ℃，1 min;

30 ℃/min升至220 ℃，1 min;30 ℃/min升至280 ℃，5 min。進(jìn)樣口溫度：280 ℃;不分流進(jìn)樣模式;不分流時間：1.0 min;50.0 mL/min的分流流量;恒流模式;載氣流速1.0 mL/min;2 min后開閥，載氣節(jié)省2 min，載氣節(jié)省20.0 mL/min流量;進(jìn)樣體積1.0 μL。

眾所周知，未知化合物的定性主要是通過將目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品Full SCAN獲得的質(zhì)譜圖與Nist譜庫比對。由于青霉素G衍生產(chǎn)物質(zhì)譜圖在譜庫中不存在，所以主要根據(jù)Preu等提出的質(zhì)譜圖和大量的預(yù)試驗確定的目標(biāo)物來進(jìn)行優(yōu)化試驗 [11]。故本試驗最終采用Full SCAN和SIM方式對青霉素G衍生物進(jìn)行定性，掃描范圍m/z 50～360（圖1）;TSQ 8000采用Auto SRM方式進(jìn)行定量掃描，選擇m/z 174.1>91.1和m/z 174.1>142.1為定性離子對，m/z 174.1>114.1*為定量離子對，確保定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本試驗優(yōu)化并建立了鵝肉中青霉素G殘留的GC-MS/MS檢測方法。鵝肉中青霉素G回收率高于80.67%，LOD、LOQ分別為1.50、4.50 μg/kg。該檢測方法靈敏度高、定性、定量準(zhǔn)確，可滿足鵝肉中青霉素G殘留確證檢測的要求。

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