楊微，陳志寶,2,3，陳操，魏艷梅，夏影，戴好富

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163000）（2.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江524088）（3.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東深圳 518108）（4.中國疾病預(yù)防控制中心，病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206）（5.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）又被稱為樺樹茸，隸屬于擔(dān)子菌門、蘑菇綱、銹革菌目、銹革菌科、褐臥孔菌屬[1]，大多生長在白樺、銀樺等樺樹的樹皮下，同時在其破損處形成肉瘤狀的菌核，作為一種珍稀藥用真菌，主要分布地區(qū)有北緯45～50 ℃芬蘭、北美、俄羅斯的西伯利亞，以及中國黑龍江和吉林等地[2]。它具有許多藥理活性，包括抵抗氧化應(yīng)激[3,4]、阻止病原體入侵[5]、抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]、產(chǎn)生抗炎因子[7]以及調(diào)節(jié)免疫功能[8]等作用，同時對多種疾病具有抑制作用，包括糖尿病、癌癥、心血管疾病等[9]。此外，樺褐孔菌也被當(dāng)作輔助品添加到中藥材、調(diào)味品、飲料、加工類肉品以及作為天然食用色素加入到食品中[10]。由于其功效和廣泛的應(yīng)用，近年來對它的研究力度也在不斷加大。

朊病毒?。≒rion Diseases）亦稱傳染性海綿狀腦病（Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSEs），是一類由朊病毒導(dǎo)致的可感染人和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病[11]。朊病毒可表現(xiàn)出與常規(guī)病毒不同的典型特征，對多種滅活作用顯示出超強(qiáng)的抵抗能力。該病的潛伏期較長，病死率為100%，發(fā)病機(jī)制尚不明確[12,13]。迄今為止，沒有有效的治療性藥物和預(yù)防性疫苗。研究表明樺褐孔菌可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[14,15]。在朊病毒病發(fā)生、發(fā)展過程中，同樣存在氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]，但尚未有文獻(xiàn)報道樺褐孔菌或其提取物對朊病毒病具有抑制作用。本文旨在使用樺褐孔菌乙醇粗提物處理朊病毒感染的細(xì)胞，對其進(jìn)行安全性評價，同時分析是否對朊病毒的復(fù)制具有抑制作用及其初步的作用機(jī)制，為朊病毒病的治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）生藥樣品，俄羅斯貝加爾湖地區(qū)；感染朊病毒毒株Chandler且能穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系SMB-S15，英國Roslin研究所。

CCK-8試劑盒，北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；過氧化氫檢測試劑盒、CuZn Mn-SOD活性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K、硝酸纖維素（NC）膜，美國Merck公司；ECL顯影試劑盒，美國Perkin-Elmer公司；PrP抗體，美國Santa Cruz公司；GCLC抗體、GCLM抗體，美國Proteintech公司；β-actin抗體，北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；化學(xué)發(fā)光成像儀器，中國上海勤翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的；恒溫水浴鍋，中國北京市精科華瑞儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樺褐孔菌乙醇粗提物的提取

選取質(zhì)地均勻的樺褐孔菌干燥子實體，將其碎成適當(dāng)?shù)男K后使用粉碎機(jī)粉碎。稱量干燥的樺褐孔菌粉末5 g，采用醇提法對其進(jìn)行提取，過濾，取上清液，濾渣反復(fù)提取幾次，合并濾液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，冷凍干燥機(jī)對其進(jìn)行冷凍干燥，最終得到黃色浸膏狀固體為樺褐孔菌乙醇粗提物。計算樺褐孔菌乙醇粗提物的得率。

樺褐孔菌乙醇粗提物得率公式按下列公式計算：

1.3.2 樺褐孔菌乙醇粗提物的正交試驗

為了得到樺褐孔菌乙醇粗提物的最佳工藝條件，選擇恰當(dāng)?shù)牧弦罕取⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度進(jìn)行4因素3水平正交試驗，最終確定樺褐孔菌乙醇粗提物的最優(yōu)提取工藝。L9(34)正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 樺褐孔菌乙醇粗提物抑制朊病毒復(fù)制作用及其抗氧化活性試驗

1.3.3.1 制備樺褐孔菌乙醇粗提物樣品

稱量干燥的樺褐孔菌粉末樣品，按照1.3.2確定的最優(yōu)提取工藝獲取乙醇粗提物。將其配置成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，分裝后置于暗處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 SMB-S15細(xì)胞培養(yǎng)

使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SMB-S15細(xì)胞，并置于33 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%左右時，按照1:2～1:5的比例傳代?？瞻讓φ战M不添加任何物質(zhì)，試驗組添加不同濃度的乙醇粗提物。

1.3.3.3 Western blot試驗

細(xì)胞裂解后變性處理，使用12% SDS PAGE電泳跑膠，半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂乳室溫封閉孵育2 h，TBST潤洗3次×10 min；再分別孵育PrP（6D11）、β-actin（1:5000稀釋）抗體于4 ℃過夜，TBST潤洗3次×10 min；室溫孵育辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記羊抗鼠二抗（1:5000稀釋）2 h，TBST潤洗3次×10 min；ECL顯色后，在化學(xué)發(fā)光成像儀中采集圖像。

1.3.3.4 CCK-8試驗

采用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞處理不同濃度乙醇粗提物后，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃反應(yīng)1 h，于450 nm處酶標(biāo)儀測吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

1.3.3.5 H2O2、SOD及抗氧化因子檢測

細(xì)胞處理后收集細(xì)胞沉淀塊，按照每100萬細(xì)胞加入100～200 μL過氧化氫檢測裂解液的比例加入裂解液，隨后充分勻漿以破碎并裂解細(xì)胞。4 ℃，12000 g離心5 min，取上清，按照H2O2檢測試劑盒方法測定過氧化氫含量。

收集細(xì)胞，用4 ℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌1～2遍。沉淀用預(yù)冷的PBS在4 ℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。隨后勻漿液4 ℃離心，取上清，按照SOD檢測試劑盒方法測定SOD抑制率。

抗氧化因子GCLM、GCLC的檢測參照1.3.3.3實驗方法

1.3.4 統(tǒng)計分析

本試驗中繪圖軟件為GraphPad Prism。免疫印跡圖像定量分析軟件為Image J。采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。p＜0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)意義，***代表p＜0.001，**代表p＜0.01，*代表p＜0.05，ns（no significance）代表無統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)值表示均為平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

工程管理專業(yè)實踐性強(qiáng)，需要培養(yǎng)具備土建類工程技術(shù)以及管理、經(jīng)濟(jì)、法律等基本知識，能運(yùn)用管理科學(xué)的理論、方法和手段，在工程建設(shè)和房地產(chǎn)領(lǐng)域從事工程技術(shù)、工程項目管理、工程咨詢、房地產(chǎn)經(jīng)營管理工作的應(yīng)用型高級管理人才[1]。然而我國以學(xué)科教育為本位的普通高等教育達(dá)不到專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)和就業(yè)要求[2～3]。目前，應(yīng)用型本科工程管理專業(yè)教學(xué)模式主要存在如下問題：

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化樺褐孔菌乙醇粗提物提取工藝

2.1.1 正交試驗結(jié)果

利用正交試驗對樺褐孔菌乙醇粗提物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選擇料液比（A）為1:6（A1）、1:8（A2）、1:10（A3），乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）為85%（B1）、80%（B2）、75%（B3），提取時間（C）為1.5 h（C1）、2.0 h（C2）、2.5 h（C3），提取溫度（D）為60 ℃（D1）、70 ℃（D2）、80 ℃（D3）作為正交試驗的優(yōu)化條件。

正交試驗結(jié)果如表2所示，以乙醇粗提物的得率為考察依據(jù)，通過測定所得的數(shù)據(jù)分析表明，乙醇粗提物得率的主要影響因素順序為A＞C＞D＞B，對乙醇粗提物的得率影響最大的是（A）料液比，得率最高時的料液比為1:10；對乙醇粗提物的得率影響最小的是（B）乙醇體積分?jǐn)?shù)，得率最高時乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%?；谡辉囼灲Y(jié)果，確定乙醇粗提物的最優(yōu)提取條件為A3B3C2D3（料液比1:10，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時間2 h，提取溫度80 ℃）。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The experimental results of orthogonal test

2.2 樺褐孔菌乙醇粗提物抑制朊病毒復(fù)制作用及其抗氧化活性研究

2.2.1 SMB-S15細(xì)胞中PrP蛋白的檢測

朊病毒病的致病因子為朊病毒（PrPSc），它具有感染性，不溶性及部分抗蛋白酶K（protein K，PK）消化的能力[17]。根據(jù)PrPSc這一特性，利用Western blot檢測蛋白酶K處理后SMB-S15細(xì)胞裂解液的朊蛋白（PrP）特異性條帶，便可觀察到PrPSc含量的變化。為了驗證SMB-S15細(xì)胞中的PrPSc，利用20 ng/mL的蛋白酶K處理細(xì)胞，隨后對其進(jìn)行PrP蛋白檢測。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)蛋白酶K處理后，SMB-S15細(xì)胞仍能檢測到PrP特異性條帶。該結(jié)果表明，SMB-S15細(xì)胞含有朊病毒PrPSc。

圖1 SMB-S15細(xì)胞蛋白酶K處理前后PrP蛋白變化情況Fig.1 Evaluation of PrP protein in SMB-S15 cells before and after treatment with proteinase K

藥物本身以及高濃度可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。為了避免這種情況，本試驗通過CCK-8方法檢測乙醇粗提物對細(xì)胞存活率的影響，選擇對細(xì)胞無毒副作用或毒副作用較小的安全質(zhì)量濃度范圍作為給藥質(zhì)量濃度。乙醇粗提物的細(xì)胞安全性評價結(jié)果如圖2所示，采用CCK-8試驗檢測24 h的細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為6.25×10-4mg/mL時，SMB-S15細(xì)胞的存活率為89.33%；而當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為1.25×10-3mg/mL，細(xì)胞存活率下降至87.33%，故最終得到乙醇粗提物的最大安全質(zhì)量濃度范圍為6.25×10-4mg/mL。

圖2 樺褐孔菌乙醇粗提物細(xì)胞安全性評價Fig.2 Evaluation of cellular safety of ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

2.2.3 樺褐孔菌乙醇粗提物對朊病毒復(fù)制的影響

據(jù)報道，樺褐孔菌生粉及提取物會對一些神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用，包括阿爾茲海默癥[18]、帕金森綜合征[19]、血管性癡呆[20,21]等，但樺褐孔菌對朊病毒病是否具有作用尚未有文獻(xiàn)報道。本試驗基于細(xì)胞安全性評價結(jié)果，使用Western blot試驗方法進(jìn)一步檢測乙醇粗提物對朊病毒復(fù)制的影響。結(jié)果如圖3所示，不同質(zhì)量濃度乙醇粗提物處理SMB-S15細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示乙醇粗提物對PrPSc的復(fù)制具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，藥物質(zhì)量濃度為6.25×10-4～3.91×10-5mg/mL時，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。綜上，在安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)乙醇粗提物對朊病毒感染細(xì)胞SMB-S15處理24 h后，對朊病毒的復(fù)制具有抑制作用。本試驗初步探究了乙醇粗提物對朊病毒復(fù)制的抑制或清除作用，這種作用可能是由于乙醇粗提物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，直接或間接影響朊病毒的復(fù)制，但其具體作用機(jī)理目前尚不明確。

圖3 樺褐孔菌乙醇粗提物抑制復(fù)制朊病毒作用Fig.3 Inhibition of prion replication by ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

2.2.4 樺褐孔菌乙醇粗提物的抗氧化活性

先前有文獻(xiàn)證明，樺褐孔菌生粉及其提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性[22,23]。為了進(jìn)一步探究樺褐孔菌乙醇粗提物是否通過其抗氧化作用從而抑制朊病毒的復(fù)制，本試驗檢測H2O2、SOD、GCLC、GCLM的水平。先前有研究證明，朊病毒感染的細(xì)胞中ROS的水平會明顯升高[16]，當(dāng)機(jī)體遭受各種有害刺激時，體內(nèi)的高活性物質(zhì)如活性氧（ROS）會大量產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生損傷。過氧化氫為ROS中的一類主要物質(zhì)，首先利用H2O2檢測試劑盒對細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，其含量也逐漸減少，藥物質(zhì)量濃度為6.25×10-4～1.56×10-4mg/mL時，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。該結(jié)果表明，乙醇粗提物能夠降低SMB-S15細(xì)胞中的超氧化物，抵抗氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害刺激。

圖4 樺褐孔菌乙醇粗提物處理SMB-S15細(xì)胞后H2O2水平分析Fig.4 H2O2 levels analysis of SMB-S15 cells treated with ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

為了進(jìn)一步確定乙醇粗提物是通過抗氧化作用抑制朊病毒的復(fù)制，本試驗檢測了幾種抗氧化因子。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的酶之一，是機(jī)體內(nèi)氧自由基的主要清除者，近年來成為許多氧化應(yīng)激引起的疾病的研究靶點。谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）及谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)節(jié)亞基（GCLM）是體內(nèi)還原性谷胱甘肽合成的限速酶，可以促進(jìn)谷胱甘肽的合成，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[24]。結(jié)果顯示，隨著乙醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，SOD的抑制率也逐漸增加，且在6.25×10-4mg/mL時具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5a）；GCLC及GCLM的蛋白含量也逐漸增加（圖5b）。以上結(jié)果表明，在抑制朊病毒復(fù)制作用的過程中，樺褐孔菌乙醇粗提物的抗氧化活性發(fā)揮了作用。

圖5 樺褐孔菌乙醇粗提物處理細(xì)胞后抗氧化因子水平分析Fig.5 Antioxidant factor levels analysis of SMB-S15 cells treated with ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

3 結(jié)論

3.1 本研究以樺褐孔菌生粉為原料，利用醇提法提取樺褐孔菌乙醇粗提物，正交試驗確定最佳提取條件。此外，采用CCK-8試驗，對樺褐孔菌乙醇粗提物進(jìn)行細(xì)胞安全性評價，得到其最大安全質(zhì)量濃度為6.25×10-4mg/mL；在此安全質(zhì)量濃度下，使用Western blot試驗，發(fā)現(xiàn)處理24 h后對朊病毒的復(fù)制具有抑制作用；通過檢測H2O2和幾種抗氧化因子，初步探究了這種抑制作用可能是通過其抗氧化活性產(chǎn)生的。

3.2 本試驗初步探究了樺褐孔菌對朊病毒病的影響及其潛在的作用機(jī)制，證明了樺褐孔菌乙醇粗提物對朊病毒病的致病因子PrPSc的復(fù)制具有抑制作用，且這種抑制作用是通過抗氧化活性產(chǎn)生的，但對于抗氧化作用機(jī)制的具體信號通路尚未清楚，還有待進(jìn)一步研究。樺褐孔菌作為一種天然產(chǎn)物，既能當(dāng)做食品添加劑，也可作為保健品，且毒副作用較小，這對未來的食品開發(fā)及疾病治療方面都有很大的潛力。本試驗為朊病毒病的治療提供了理論依據(jù)，同時也為后續(xù)樺褐孔菌對神經(jīng)保護(hù)方面的研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。