寇 靜 連莉陽(yáng) 張宏方 環(huán) 誠(chéng) 史琳娜 呂蕊花 賀太平

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，咸陽(yáng)市 712046，電子郵箱:78276628@qq.com)

痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes，PA)是一種生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的典型革蘭陽(yáng)性厭氧菌，其與皮膚疾病粉刺的形成息息相關(guān)，為痤瘡患者毛囊皮脂腺內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，被認(rèn)為是引起痤瘡病變的主要微生物，占所有檢測(cè)到微生物數(shù)量的89%[1]。目前認(rèn)為，微生物參與的致病機(jī)制主要與其形成的生物膜相關(guān)[2]。當(dāng)這些病原菌形成生物膜結(jié)構(gòu)時(shí),多糖鈣架多聚體構(gòu)成一個(gè)保護(hù)性外骨架，形成一個(gè)生物膜微環(huán)境，使得這些病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的致病性和對(duì)抗菌藥物的免疫性成倍地增加。PA作為痤瘡病灶中的優(yōu)勢(shì)菌群，其成膜能力的強(qiáng)弱對(duì)痤瘡的根治、復(fù)發(fā)有很大的影響。本課題組前期研究表明，中藥銀黃消痤對(duì)痤瘡有一定的治療作用[3]，但其對(duì)痤瘡病變中的優(yōu)勢(shì)菌群PA生物被膜抑制作用的相關(guān)機(jī)制，尚缺乏系統(tǒng)的研究報(bào)告。本研究探討中藥銀黃消痤抑制PA生物被膜的效果，為臨床治療痤瘡提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 受試菌株 PA均分離自于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的痤瘡患者皮損組織，采用剛果紅平板檢測(cè)桿菌胞間多糖黏附素合成情況，篩選出強(qiáng)產(chǎn)膜PA實(shí)驗(yàn)株為受試菌株，置于-80℃冰箱保存。

1.2 試劑 中藥銀黃消痤為陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制藥劑；TSB培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：190607)，MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20191202)，剛果紅瓊脂培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：190719)，腦心浸出液(brian heart infusion，BHI)培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190716)，普通的營(yíng)養(yǎng)瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：190718)；結(jié)晶紫染料(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：760213)。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液的制備：將1.1中分離的菌株接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37℃進(jìn)行培養(yǎng)48 h，再用TSB培養(yǎng)基于搖床上37℃厭氧培養(yǎng)48 h二次活化，3 500 r/min離心15 min棄上清，無(wú)菌生理鹽水洗滌，采用滅菌生理鹽水校正菌懸液濃度為吸光度值600=0.1(約0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?×108CFU/mL)[4]。

1.3.2 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：參照文獻(xiàn)[5]，分別取100 μL配制好的菌懸液接種于含100 μL MH肉湯培養(yǎng)基的96孔板，37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h(每個(gè)時(shí)間段設(shè)6個(gè)復(fù)孔)后，于酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)590 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各孔吸光度值檢測(cè)菌液濃度；棄去培養(yǎng)液，采用結(jié)晶紫染色法觀察細(xì)菌生物被膜形成情況，在590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，作為生物被黏膜附量。

1.3.3 藥品的配制與最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)/最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)的測(cè)定：采用96孔微量板二倍稀釋法分別測(cè)定中藥銀黃消痤對(duì)PA的MIC和MBC。將中藥銀黃消痤采用二倍稀釋法分別配制成終濃度為150 mg/mL、75 mg/mL、37.5 mg/mL、18.75 mg/mL、9.38 mg/mL、4.69 mg/mL、2.34 mg/mL、1.17 mg/mL、0.59 mg/mL、0.29 mg/mL、0.15 mg/mL、0.07 mg/mL的含藥營(yíng)養(yǎng)肉湯，按照所含藥物濃度從高到低的順序分別依次加入96孔微量板,每孔180 μL，另備2孔各加營(yíng)養(yǎng)肉湯180 μL。將1.3.1制備的PA菌懸液，分別加入微量板含藥孔以及1孔營(yíng)養(yǎng)肉湯(對(duì)照孔)中,每孔加20 μL菌懸液,以未加菌懸液的營(yíng)養(yǎng)肉湯孔為空白孔。將微量板置于厭氧密封袋中,加入?yún)捬醢l(fā)生袋,封口,37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)72 h，于酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，其中吸光度值無(wú)變化的最小藥物濃度設(shè)為MIC。分別取培養(yǎng)后96孔中培養(yǎng)液50 μL涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)72 h，無(wú)菌落生長(zhǎng)為最小殺菌濃度MBC。

1.3.4 中藥銀黃消痤對(duì)PA生物膜形成的影響:參照文獻(xiàn)[6]，配制中藥銀黃消痤終濃度分別為1/4 MIC和1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的含藥BHI培養(yǎng)基。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分為空白組、對(duì)照組和4個(gè)銀黃消痤組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，4個(gè)銀黃消痤組加入50 μL痤瘡丙酸桿菌菌懸液后用含相應(yīng)濃度中藥銀黃消痤的BHI培養(yǎng)基150 μL培養(yǎng)，對(duì)照組加入50 μL痤瘡丙酸桿菌菌懸液后用不含藥的BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)，空白組只加入50 μL BHI培養(yǎng)基，不加菌懸液。將96孔板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)板，于酶標(biāo)儀590 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，計(jì)算生物被膜形成抑制率。生物被膜形成抑制率(%)=(吸光度值對(duì)照組-吸光度值樣品測(cè)定孔)/吸光度值對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。再取24孔板，置入預(yù)先泡酸處理的蓋玻片，分為銀黃消痤組和對(duì)照組、空白組，按上述方法處理各組后，將24孔板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)72 h，取出玻片，結(jié)晶紫染色[7]，顯微鏡下觀察各組生物膜形態(tài)的變化。

1.3.5 中藥銀黃消痤抑制PA黏附的效果：取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔各加入100 μL PA菌懸液，分為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC和2 MIC 4個(gè)銀黃消痤組和BHI對(duì)照組，4個(gè)銀黃消痤組各加入相應(yīng)濃度的含藥BHI培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入BHI培養(yǎng)基100 μL，另設(shè)置無(wú)菌空白組加入BHI培養(yǎng)基200 μL。置于37℃厭氧條件下分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h后，棄去培養(yǎng)基，結(jié)晶紫染色，讀取酶標(biāo)儀590 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將所有數(shù)據(jù)錄入Microsoft Office Excel 2016軟件中進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PA的菌液濃度均呈上升趨勢(shì)，而在96孔板中的細(xì)菌生物被膜黏附量增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 PA菌液濃度及PA生物膜生長(zhǎng)量曲線圖

2.2 中藥銀黃消痤對(duì)PA的MIC及MBC 微量二倍稀釋法結(jié)果顯示，中藥銀黃消痤對(duì)PA的MIC為2.34 mg/mL，MBC為37.5 mg/mL。

2.3 中藥銀黃消痤對(duì)PA生物被膜形成的影響 干預(yù)72 h后，空白組未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組的生物被膜形成抑制率均高于1/4 MIC銀黃消痤組,且2 MIC銀黃消痤組的生物被膜形成抑制率均高于1/2 MIC與1 MIC銀黃消痤組(均P<0.05)，但1/2 MIC銀黃消痤組與1 MIC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。鏡下可見(jiàn)對(duì)照組和1/4 MIC銀黃消痤組菌體邊界模糊且相互重疊，形成團(tuán)塊，形成了具有獨(dú)立單位的典型生物被膜結(jié)構(gòu)，但隨著藥物濃度的增加，菌體逐漸趨于分散狀態(tài)，在2 MIC銀黃消痤組中只有少量細(xì)菌粘連，大部分呈散在分布，見(jiàn)圖2。

表1 5組PA生物被膜形成抑制率的比較(x±s)

圖2 5組PA生物被膜形成情況(結(jié)晶紫染色，×1000)

2.4 中藥銀黃消痤對(duì)PA生物膜黏附作用的影響 干預(yù)2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組PA生物被膜黏附作用均低于對(duì)照組，且干預(yù)4 h后1/4 MIC銀黃消痤組PA生物被膜黏附作用也低于對(duì)照組(P<0.05)，但中藥銀黃消痤對(duì)PA生物被膜黏附的抑制作用的濃度依賴(lài)性不明顯。見(jiàn)表2。

表2 5組PA生物被膜黏附情況的比較(x±s，吸光度值)

3 討 論

細(xì)菌生物被膜是由多糖基質(zhì)、纖維蛋白和脂質(zhì)蛋白等構(gòu)成的骨架保護(hù)結(jié)構(gòu)，可以對(duì)抗外界不利環(huán)境[8]。生物被膜不僅使細(xì)菌牢固附著于創(chuàng)面組織,還可以保護(hù)細(xì)菌免受抗生素、消毒劑和免疫系統(tǒng)的攻擊,導(dǎo)致感染持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、創(chuàng)面遷延不愈[9]。盡管目前痤瘡的確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但微生物被認(rèn)為是其發(fā)病的重要病因之一[10]，而微生物在毛囊中大量繁殖并形成生物被膜結(jié)構(gòu)是痤瘡發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制。PA為痤瘡患者毛囊皮脂腺內(nèi)第一優(yōu)勢(shì)菌群，與痤瘡的炎癥損害及嚴(yán)重程度有著很大關(guān)系。

目前，臨床上主要應(yīng)用抗生素及維A酸類(lèi)藥物等治療痤瘡，但不良反應(yīng)較多，且容易出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性。中藥由“活性成分群”構(gòu)成，按照一定要求配伍組合，通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮整合調(diào)節(jié)作用。有研究顯示，中藥主要是通過(guò)調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗病原微生物[11]，在臨床治療中我們亦發(fā)現(xiàn)中藥及中藥復(fù)方具有比較強(qiáng)的抗感染作用。近年來(lái)，使用中藥及其提取物治療痤瘡得到越來(lái)越多的關(guān)注，相關(guān)的機(jī)制研究日益增多[12-14]。中藥銀黃消痤是陜西中醫(yī)藥大學(xué)皮膚科院內(nèi)制劑，其處方以《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》中枇杷清肺飲為基礎(chǔ)加減化裁而成，全方由金銀花、黃芩、枇杷葉、黃連、連翹、野菊花、薏苡仁、白花蛇舌草、丹參等10余味藥物組成,其中金銀花、黃連、黃芩等中藥具有廣譜抗菌、抗炎等作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及部分真菌等均有抑制作用，并能增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能,減少炎性滲出[15]；白花蛇舌草能刺激體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生，并可增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力；丹參可活血化瘀，改善微循環(huán)[16]，減輕上皮角化，其有效成分丹參酮可抗炎、抑菌，并可對(duì)抗雄激素從而抑制皮脂分泌等。

本課題組前期臨床研究顯示，采用中藥銀黃消痤治療痤瘡患者，總有效率達(dá)到92%[3]，本研究結(jié)果顯示，干預(yù)72 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組的PA生物被膜形成抑制率均高于對(duì)照組和1/4 MIC銀黃消痤組(P<0.05)，提示一定濃度的中藥銀黃消痤能夠有效抑制PA生物被膜的形成。且干預(yù)2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組痤瘡丙酸桿菌黏附作用均低于對(duì)照組，干預(yù)4 h后1/4 MIC銀黃消痤組黏附作用也低于對(duì)照組(P<0.05)，提示中藥銀黃消痤濃度為1/2 MIC時(shí)，在干預(yù)早期即對(duì)PA的黏附作用具有抑制性，即使是使用1/4 MIC的低濃度中藥銀黃消痤，干預(yù)4 h后也可抑制PA的黏附作用。

綜上所述，一定濃度的中藥銀黃消痤對(duì)臨床分離PA的生長(zhǎng)和黏附有較強(qiáng)的抑制作用，這可為臨床用藥治療痤瘡頑疾提供參考。