付 博，張 潔，張蒙蒙，都亞飛，王 靜*，彭建斐*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，鄭州市花園路116號 450002 3.湖南省煙草公司懷化市公司，湖南省懷化市鶴城區(qū)湖天南路446號 418000

煙草根結(jié)線蟲病是世界各國煙草生產(chǎn)中最重要的線蟲病害之一［1-3]。由于我國大部分煙田長期連作，土壤中的線蟲基數(shù)逐年增多，根結(jié)線蟲病目前已成為我國煙草產(chǎn)區(qū)的主要病害［4-6]。根結(jié)線蟲主要侵染煙草根系并形成根結(jié)或結(jié)癭，破壞根組織的分化和生理活動，導(dǎo)致植株出現(xiàn)葉尖、葉緣干枯內(nèi)卷癥狀。根結(jié)線蟲侵染煙草根部造成的傷口還會促進(jìn)其他真菌和細(xì)菌性病害的侵染，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)質(zhì)量。然而生產(chǎn)上為防控?zé)煵莞Y(jié)線蟲病使用的化學(xué)殺蟲劑危害人畜健康并污染生態(tài)環(huán)境［7]，隨著人們對煙葉安全性的日益關(guān)注，煙草根結(jié)線蟲病的生物防治也越發(fā)重要［8-9]。生物防治具有持效期長、對生態(tài)安全、對人畜友好等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展模式中發(fā)揮著重要的作用［10]。翟 明 娟 等［11]研 究 發(fā) 現(xiàn) 綠 色 木 酶（Trichoderma viride）發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正致死率高達(dá)98%，田間防效達(dá)到64.9%；黃金玲等［12]通過盆栽研究發(fā)現(xiàn)巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）對番茄根結(jié)線蟲病的防效達(dá)60%；唐佳頻等［13]報道南極土壤來源的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）生防效果可以達(dá)到71.67%，顯示出生物防治在根結(jié)線蟲綠色防控中的巨大應(yīng)用前景［14]。目前，淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）、堅強(qiáng)芽胞桿菌（Bacillus firmus）、穿刺巴氏 桿 菌（Pasteuria penetrans）、蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌（Bacillus cereus）等［15-17]生防微生物已在多個國家被開發(fā)成商品制劑并用于根結(jié)線蟲的生物防治。此外，貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）也被應(yīng)用于多種作物根結(jié)線蟲病的生物防治中，Burkett-Cadena等［18]報道貝萊斯芽胞桿菌FZB42菌株能夠減少番茄根部線蟲卵和幼蟲數(shù)量，且能有效減輕番茄灰霉病的發(fā)生；Xiang等［19]報道貝萊斯芽胞桿菌Bve2菌株能夠降低棉花根系中根結(jié)線蟲卵囊的數(shù)量，并能顯著增加棉花的產(chǎn)量。但目前關(guān)于煙草根結(jié)線蟲病生物防治的相關(guān)研究還較少，亟需探索對煙草根結(jié)線蟲具有生物活性的新生防資源。為此，本研究中對前期篩選出的生防細(xì)菌進(jìn)行種類鑒定，并對其防治效果及生防機(jī)理進(jìn)行初步研究，旨在為新型生物殺線蟲劑的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 煙草品種、供試菌株及煙草根結(jié)線蟲根結(jié)

供試煙草品種為云煙87。TB-68菌株由煙草根結(jié)線蟲卵囊上分離獲得。在河南省洛陽市宜陽縣嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲病的煙田中采集煙株發(fā)病根結(jié)［前期鑒定為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）]，用于室內(nèi)離體活性測定和盆栽防效測定。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂17 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3 試劑

總糖含量測定試劑盒以及考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測試盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定

將TB-68菌株在NA培養(yǎng)基上劃線，32℃培養(yǎng)15 h，觀察菌落特征并進(jìn)行掃描電鏡觀察和革蘭氏染色，觀察其菌體大小、形狀、有無芽胞。利用CTAB法提取TB-68菌株的基因組DNA，采用通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增其16S rDNA基因序列。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對。采用Mega 5.0軟件對TB-68菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.2 室內(nèi)離體活性測定

從煙草根結(jié)線蟲病煙田取發(fā)病根結(jié)并用清水沖洗干凈，剪成0.5～1.0 cm小段，1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉消毒2 min，用玻璃棒拍打、收集卵粒，經(jīng)無菌水沖洗并離心得2 000粒/mL的卵粒懸液，將卵粒懸液置于28℃的恒溫箱中孵化5～7 d后收集二齡幼蟲，經(jīng)沖洗與離心得2 000條/mL的線蟲懸液。將TB-68菌株接種于NB培養(yǎng)基，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，10 000 r/min離心2 min，用0.22μm的微孔濾膜濾除菌體，得發(fā)酵濾液原液，并依次稀釋制備5倍和10倍稀釋液。分別測定發(fā)酵濾液原液、5倍和10倍稀釋液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死作用和對卵孵化的抑制作用。具體方法：吸取200μL菌株發(fā)酵濾液加入到1.5 mL離心管中，再向其中加入50μL線蟲懸液混合均勻，以空白液體培養(yǎng)基為對照，重復(fù)6次，置于25℃培養(yǎng)箱中，48 h后觀察二齡幼蟲的死亡情況，通過滴加4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaOH溶液判斷線蟲的死活［20]，計算線蟲死亡率和校正死亡率［21]。吸取200μL菌株發(fā)酵濾液和50μL卵懸液至1.5 mL離心管中，以空白液體培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)6次，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，7 d后調(diào)查各處理中孵化出的二齡幼蟲的數(shù)量，計算孵化率和卵孵化抑制率［21]。

1.2.3 室內(nèi)盆栽防效測定

將TB-68菌株接種于NB液體培養(yǎng)基，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD值為0.8～1.0，得TB-68發(fā)酵液。采用漂浮育苗，待煙苗長到5～6片真葉時，選取健壯、長勢一致的幼苗移栽于裝有無菌土的花盆（10 cm×12 cm）中，每盆移栽1株煙苗，移栽3 d后進(jìn)行灌根和施藥處理，具體方法：（1）TB-68發(fā)酵液100 mL/株灌根；（2）TB-68發(fā)酵液200 mL/株灌根；（3）0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）阿維菌素顆粒劑2 g/株穴施；（4）空白培養(yǎng)基對照。灌根和施藥5 d后接種根結(jié)線蟲，在距離煙草根2 cm處的無菌土中對稱打2個1 cm深的小孔，注入二齡幼蟲懸液，每株接種1 000條。每處理10個重復(fù)，澆透水后放在28℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，移栽60 d后，根據(jù)GBT23222—2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法進(jìn)行病情調(diào)查，并計算根結(jié)指數(shù)和防治效果［22]。

根結(jié)指數(shù)＝Σ（各級病株數(shù)×級別）/調(diào)查總株數(shù)

防治效果＝（對照根結(jié)指數(shù)-處理根結(jié)指數(shù)）/對照根結(jié)指數(shù)×100%

1.2.4 TB-68菌株生防機(jī)理初步研究

將從病田取回的根結(jié)用清水沖洗干凈，剪成0.5 cm的小段，在體視鏡下用滅菌的牙簽輕輕挑取卵囊，用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉表面消毒1 min，用無菌水沖洗3次。參考1.2.2方法制備TB-68發(fā)酵濾液原液，測定TB-68發(fā)酵濾液處理對根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響。各處理取飽滿且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入1 mL TB-68發(fā)酵濾液，以加入等量的無菌LB培養(yǎng)基為對照，密封置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照說明書要求測定卵囊總糖和總蛋白的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 h，TB-68菌株的菌落均呈乳白色不透明、表面粗糙、質(zhì)地緊密、中央有凹陷、邊緣不規(guī)則形態(tài)，菌體呈短桿狀，大小為2.33μm×0.58μm，革蘭氏染色陽性，芽胞中生（圖1）。測定TB-68菌株的16S rDNA的序列，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，相似性最高的為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。利用其近緣序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，TB-68菌株與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）處于進(jìn)化樹的同一分支（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將TB-68菌株鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。

2.2 TB-68菌株對煙草根結(jié)線蟲的室內(nèi)離體活性測定

由表1可見，隨著TB-68菌株發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加，線蟲的死亡率逐漸降低，卵孵化率逐漸增高。其中，TB-68發(fā)酵濾液原液處理中根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率達(dá)94.5%，顯著高于其他處理和對照，校正死亡率達(dá)91.7%，其5倍稀釋液和10倍稀釋液處理中的線蟲死亡率也顯著高于對照，校正死亡率分別為67.2%和39.2%。此外，TB-68菌株發(fā)酵濾液原液處理中的卵孵化率最低，為12.8%，而對照中的卵孵化率為70.5%；卵孵化抑制率達(dá)到81.8%，5倍稀釋液和10倍稀釋液處理的卵孵化抑制率分別為59.6%和39.4%。

表1 TB-68菌株發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲的室內(nèi)離體活性測定①Tab.1 In vitro activity test of TB-68 fermentation filtrate on tobacco root knot nematode in greenhouse （%）

2.3 室內(nèi)盆栽防效測定

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表2），TB-68發(fā)酵液200 mL/株灌根處理和100 mL/株灌根處理對煙草根結(jié)線蟲均有一定的防治效果，根結(jié)指數(shù)均明顯低于對照。其中，TB-68發(fā)酵液200 mL/株灌根處理的根結(jié)指數(shù)為27.9，防治效果達(dá)64.4%，接近0.5%阿維菌素的防治效果；TB-68發(fā)酵液100 mL/株灌根處理的根結(jié)指數(shù)為38.6，防治效果為50.8%。由此可見，TB-68菌株具有較好的生防潛力。

表2 TB-68菌株對南方根結(jié)線蟲盆栽防治效果的影響Tab.2 Control efficiency of TB-68 strain against Meloidogyne incognita in pots

2.4 TB-68菌株發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響

由圖3可見，TB-68發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲卵囊總糖含量和總蛋白含量分別為8.1 g/L和22.1 g/L，對照組根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量量分別為14.9 g/L和50.6 g/L，分別比對照顯著降低45.6%和56.3%，說明TB-68菌株發(fā)酵濾液處理能夠顯著降低根結(jié)線蟲卵囊的總糖含量和總蛋白含量。

3 討論

本研究中鑒定前期從煙草根結(jié)線蟲卵囊上分離得到的生防細(xì)菌TB-68菌株為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），并發(fā)現(xiàn)TB-68菌株發(fā)酵液200 mL/株的灌根處理對煙草根結(jié)線蟲病的室內(nèi)防治效果較高（64.4%），接近0.5%阿維菌素2 g/株穴施處理的防治效果，可為煙草根結(jié)線蟲病的防控提供新的生防資源，對該病的綠色防控具有重要意義。此外，生防菌株的定殖能力是其發(fā)揮防效的前提，也是評價該菌株生防潛力的重要因素［23]。根據(jù)Al-Ali等［24]的研究，貝萊斯芽胞桿菌在番茄根際周圍具有較強(qiáng)的定殖能力，從而表現(xiàn)出良好的防治效果，推測本研究中TB-68菌株在煙田中較高的防效可能與TB-68菌株在煙草根際土壤的穩(wěn)定定殖能力有關(guān)，下一步將驗(yàn)證TB-68菌株的田間防治效果及其在土壤中的定殖能力，以期為TB-68菌株的開發(fā)利用提供依據(jù)。

本研究中還發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌TB-68發(fā)酵濾液對煙草根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有較強(qiáng)的致死作用，且對其卵囊孵化具有較強(qiáng)的抑制作用，推測TB-68菌株發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的生物活性，從而抑制煙草根結(jié)線蟲病的發(fā)生。另外，研究中發(fā)現(xiàn)TB-68發(fā)酵濾液能夠顯著降低線蟲體內(nèi)的總糖和總蛋白含量。糖是線蟲化學(xué)感受器的重要組成物質(zhì)進(jìn)而影響著線蟲的趨向性，線蟲體表的蛋白質(zhì)角質(zhì)層可保持線蟲體內(nèi)水分穩(wěn)定并能阻止生防菌或其他有害物質(zhì)的侵入［25]。因此，TB-68菌株很可能是通過其發(fā)酵濾液干擾線蟲糖和蛋白質(zhì)的代謝活動，破壞了煙草根結(jié)線蟲卵和二齡幼蟲的體壁及內(nèi)部結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而導(dǎo)致線蟲死亡，該推測與Choi等［26]報道的結(jié)果相符。

4 結(jié)論

從煙草根結(jié)線蟲卵囊上分離得到的1株生防細(xì)菌TB-68，通過形態(tài)及分子特征分析將其鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。該菌株發(fā)酵濾液原液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率達(dá)91.7%，卵孵化抑制率達(dá)到81.8%，室內(nèi)盆栽防治效果達(dá)64.4%，并能顯著降低根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量，在煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方面具有較大應(yīng)用潛力。