張 彪，黃 娜，張萬利，王 碩，生 威,

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300072）

酪胺又稱對羥基苯乙胺，是酪氨酸在酪氨酸脫羧酶作用下產(chǎn)生的一元胺，作為常見的小分子生物胺，主要存在于肉及其制品、水產(chǎn)品以及發(fā)酵制品中[1-3]。研究表明適量的酪胺可促進新陳代謝，維持正常生理特征，但過量的酪胺可引起偏頭痛、心力衰竭、血壓飆升、哮喘和蕁麻疹等健康問題[4-6]，因此酪胺含量的檢測有可能成為評價肉類水產(chǎn)品新鮮度和發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的一個新指標(biāo)[7-9]。

目前國內(nèi)外酪胺的檢測方法主要為薄層色譜法[10]、離子交換色譜法[11]、毛細(xì)管電泳法[12]、高效液相色譜法[13-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、電化學(xué)傳感器法[17]和酶聯(lián)免疫吸附劑測定法[18]，上述儀器方法可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測酪胺的含量，但樣品的前處理復(fù)雜，衍生化物質(zhì)穩(wěn)定性差[19]，設(shè)備成本高昂，且需專業(yè)技術(shù)人才操作，而電化學(xué)傳感器法同儀器檢測方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差[20]?；诳乖?抗體特異性識別的酪胺免疫分析方法，主要為傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，但該方法穩(wěn)定性較差、檢測時間較長、靈敏度低[18,21]。因此有必要開發(fā)樣品前處理簡單、操作便捷、檢測快速、靈敏度高、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好的酪胺檢測新方法。

本實驗用純化酪胺多克隆抗體標(biāo)記上轉(zhuǎn)換納米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）制備信號探針，酪胺包被原偶聯(lián)磁性聚苯乙烯微球制備捕獲探針，在最優(yōu)的實驗條件下孵育捕獲探針與酪胺間接地相競結(jié)合信號探針表面抗體的反應(yīng)30 min后，利用磁力架將信號探針與捕獲探針的免疫復(fù)合物分離，多次清洗后，檢測免疫復(fù)合物的熒光強度，結(jié)果表明，熒光強度的差值與酪胺質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。本實驗運用磁分離技術(shù)建立酪胺的熒光免疫分析方法，節(jié)約檢測時間、提高檢測效率，可實現(xiàn)肉及其制品、發(fā)酵產(chǎn)品以及海產(chǎn)品中酪胺快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、培根、金鯧魚、奶酪、米酒、醬油 市購。

三氯乙酸（純度為99.0%） 天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；酪胺、組胺、苯乙胺、色胺、章魚胺、5-羥色胺、精胺、亞精胺、酪氨酸、四水合乙酸釔、乙酸銩、四水合乙酸鐿、聚苯烯酸、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二甘醇、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]卡二亞胺（N-ethyl-N’-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimide，EDC）、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA，分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；氟化銨、氫氧化鈉、十八烯酸（純度均不小于90%）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，HEPES）、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 天津國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磁性聚苯乙烯微球（magnetic polystyrene microspheres，MPMs） 天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。所有分離用有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500熒光分光光度計（配有980 nm外部激發(fā)器）日本Hitachi公司；高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器） 日本島津公司；純水儀 美國Millipore公司；WONDASIL C18SUPERB色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm） 島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaYF4Yb,Tm UCNPs與信號探針制備

參考Sheng Wei等[22]合成UCNPs的方法并進行修改以制備UCNPs。取38.0 mg四水合乙酸鐿、304.3 mg四水合乙酸釔、3.5 mg乙酸銩溶解于17.5 mL十八烯酸和6.0 mL油酸混合物中。攪拌加熱到160 ℃，維持30 min，再降溫到40 ℃，逐滴加入含148.0 mg氟化銨和100.0 mg氫氧化鈉的10 mL甲醇維持30 min，溫度升至90 ℃并維持約40 min除去甲醇，再升至110 ℃并維持約30 min除去溶液中的O2，加熱到310 ℃并維持60 min，冷卻至室溫后離心，乙醇清洗后在60 ℃烘干得油溶性UCNPs。油溶性UCNPs經(jīng)配體交換法獲得水溶性UCNPs。配體交換法需稱取1.5 g PAA，加入到含30 mL二甘醇三頸燒瓶中，在氬氣的保護下，加熱反應(yīng)溶液使燒瓶內(nèi)溫度升高至110 ℃，并保持劇烈攪拌反應(yīng)1 h；稱取90.0 mg油溶性UCNPs溶解于6.0 mL甲苯中，將此混合溶液快速加入到反應(yīng)液中，同時在110 ℃保持1 h后，繼續(xù)升高反應(yīng)體系的溫度至240 ℃保持1 h，反應(yīng)完畢后自然冷卻至室溫，離心收集沉淀產(chǎn)物。隨后用超純水離心洗滌沉淀物3 次后，放置干燥箱中干燥，得到水溶性聚丙烯酸上轉(zhuǎn)換材料（polyacrylic acid-upconversion nanoparticles，PAA-UCNPs）。

制備酪胺的免疫原需將20.0 mg BSA溶解于4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4），將含4.2 mg酪胺的100 μL DMSO溶液逐滴加入上述溶液，再逐漸加入13 μL體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛溶液，4 ℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)溶液經(jīng)透析袋于4 ℃透析3 d，獲得酪胺免疫原，放置－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

抗體在本實驗的前期制備[23]。選2 只雄性新西蘭大耳白兔（8～10 周齡、體質(zhì)量2.5～3 kg），首次免疫采用背部多點皮下注射和腿部肌肉注射免疫，采用多點皮下注射免疫的方式重復(fù)加強免疫5 次。初次免疫時，每只兔子的免疫劑量為1 mg免疫原（以BSA的量計算）；加強免疫時，每只兔子的免疫劑量為0.5 mg免疫原（以BSA的量計算）。從第3次免疫開始，每次免疫后隔1 周進行耳緣靜脈取血以測定抗體性能。最后一次免疫7 d后，股動脈取全血，4 ℃冰箱靜置過夜，4 ℃、10 000 r/min離心10 min獲得抗體血清，純化后分裝－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

參考Sheng Wei等[22]制備信號探針的方法并進行修改。將5.0 mg水溶性UCNPs、5.0 mg NHS和10.0 mg EDC溶解于2.0 mL MES溶液（0.01 mol/L、pH 5.5），30 ℃攪拌3 h活化UCNPs的羧基位點，以4 ℃、4 000 r/min離心10 min，沉淀超純水清洗3 次除去多余的NHS和EDC?；罨蟮腢CNPs復(fù)溶到2.0 mL HEPES溶液（0.01 mol/L、pH 7.2），加入適量體積的酪胺抗體進行偶聯(lián)。于4 ℃、4 000 r/min離心10 min獲得UCNPs與抗體的偶聯(lián)復(fù)合物，再用HEPES溶液清洗3 次后，復(fù)溶到2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% BSAHEPES溶液，于30 ℃持續(xù)反應(yīng)1 h以封閉UCNPs表面多余位點。于4 ℃、4 000 r/min離心10 min清洗后復(fù)溶，獲得1.0 mL UCNPs與酪胺抗體的偶聯(lián)復(fù)合物，即信號探針。

1.3.2 酪胺包被原與捕獲探針制備

參照Sheng Wei等[23]方法制得酪胺包被原。20.0 mg OVA溶解于4.0 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），將含3.7 mg酪胺的100 μL DMSO溶液逐滴加入上述溶液，再逐漸加入13 μL體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛溶液，4 ℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)溶液經(jīng)透析袋于4 ℃透析3 d，獲得酪胺包被原，置于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

5.0 mg MPMs溶解于1.0 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），加入10.0 mg EDC和5.0 mg NHS，在30 ℃活化表面羧基1 h。用PBS清洗3 次以除去經(jīng)外部磁力活化后MPMs的雜質(zhì)。MPMs用1.0 mL PBS復(fù)溶，并加入一定量制備好的酪胺包被原，且在30 ℃孵育4 h。經(jīng)外部磁力分離獲得酪胺包被原與MPMs的復(fù)合物，再復(fù)溶到體積分?jǐn)?shù)為20%的BSA-PBS以封閉MPMs表面未反應(yīng)的羧基，靜置1 h。經(jīng)外部磁力分離清洗后獲得酪胺的感應(yīng)探針，復(fù)溶到5.0 mL PBS備用。

1.3.3 熒光免疫分析方法

基于酪胺與感應(yīng)探針上包被原互相間接競爭結(jié)合信號探針表面的抗體后，磁分離感應(yīng)探針與信號探針的偶聯(lián)物，用分光光度計測定偶聯(lián)物中UCNPs的熒光強度，通過公式計算酪胺在不同質(zhì)量濃度下的熒光強度差，并以酪胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度差值為縱坐標(biāo)，建立酪胺的熒光免疫分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制50 μL質(zhì)量濃度分別為0.00、0.02、0.05、0.10、1.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L的酪胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次加入50 μL感應(yīng)探針和50 μL信號探針于2.0 mL離心管，加入PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）并定容到400 μL，搖床240 r/min勻速轉(zhuǎn)動反應(yīng)30 min。磁分離后棄上清液，清洗感應(yīng)探針與信號探針的偶聯(lián)物，復(fù)溶后通過下式計算熒光強度差值：

ΔI=I0－I1

式中：ΔI為熒光強度差值；I0為體系無酪胺的熒光強度；I1為不同質(zhì)量濃度酪胺對應(yīng)的熒光強度。

1.3.4 熒光免疫分析方法的特異性驗證

為考察本方法的特異性，檢測酪氨酸、亞精胺、亞精胺、組胺、組氨酸、章魚胺、色胺、苯乙胺和5-羥色胺等生物胺和酪胺結(jié)構(gòu)類似物，通過比較不同待測物產(chǎn)生的熒光強度差值與酪胺產(chǎn)生的熒光強度差值，評價該方法的特異性。

1.3.5 樣品處理

高效液相色譜檢測樣品的處理方法參考GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》[24]，熒光免疫分析處理樣品參考Sheng Wei等[23]方法。5.0 g含豬肉、培根、金鯧魚和奶酪的樣本與20.0 mL體積分?jǐn)?shù)3%的三氯乙酸溶液混合，于4 ℃、600 r/min高速渦旋5 min后，以4 ℃、10 000 r/min離心10 min。上清液加入20.0 mL正己烷后，高速渦流5 min去除脂肪。收集下層溶液，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性后，用PBS溶液適當(dāng)稀釋待測。醬油、米酒調(diào)至中性后，用PBS稀釋待測。

1.3.6 色譜條件

色譜柱：C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm）；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸-乙酸銨溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 UCNPs表征

油溶性與水溶性UCNPs的透射電鏡、粒徑分布、傅里葉紅外光譜與熒光光譜表征結(jié)果如圖1所示。圖1a和圖1b表明，油溶性與水溶性UCNPs均呈球形且分布均勻。油溶性UCNPs的粒徑分布約在23.5～32.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為28.3 nm；水溶性UCNPs的粒徑分布在24.5～33.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為29.6 nm（圖1c、d）。如圖1e所示，3 437、3 450 cm－1均對應(yīng)羥基的伸縮振動，油溶性UCNPs的傅里葉紅外光譜在2 928 cm－1出現(xiàn)峰值對應(yīng)甲基的伸縮振動，水溶性UCNPs的傅里葉紅外光譜在1 730 cm－1出現(xiàn)峰值，對應(yīng)羰基在2 928 cm－1峰值消失，分析原因為油溶性UCNPs經(jīng)配體交換后，水溶性UCNPs表面成功修飾羧基[25-26]。圖1f表明，所合成的UCNPs在980 nm激發(fā)波長下，能發(fā)射出單一的483 nm熒光，其可作為熒光檢測信號。

圖1 UCNPs材料表征Fig.1 Characterization of UCNPs

2.2 信號探針與感應(yīng)探針制備條件的優(yōu)化

信號探針與感應(yīng)探針的制備條件直接影響熒光免疫分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性[26]。如圖2a所示，固定50 μL質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL已活化的水溶性UCNPs，當(dāng)抗體添加量小于12 μg，抗體添加量增加時，水溶性UCNPs表面偶聯(lián)抗體量也逐漸增加；當(dāng)抗體添加量大于等于12 μg，偶聯(lián)量基本不變，但偶聯(lián)率呈現(xiàn)整體下降的趨勢，因此選擇添加12 μg酪胺抗體制備信號探針，固定50 μL 5.0 mg/mL已活化的MPMs，并添加不同質(zhì)量的包被原，結(jié)果如圖2b所示，因此選擇添加70 μg酪胺包被原制備感應(yīng)探針。

圖2 抗體（a）、包被原（b）添加量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of preparation conditions of antibody (a) and coated antigen (b) mass added

2.3 信號探針添加量與孵育時間的優(yōu)化

信號探針與感應(yīng)探針的比例直接影響熒光免疫分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，而孵育時間決定了該方法的檢測速度[27]。如圖3a所示，當(dāng)固定感應(yīng)探針的添加體積為40 μL，且信號探針的添加量增加時，反應(yīng)體系的熒光強度也隨之增加；信號探針添加體積為70 μL時，熒光強度達(dá)到最大；信號探針添加體積大于70 μL，熒光強度增加不顯著，因此選擇70 μL為信號探針的添加量。如圖3b所示，熒光強度隨著孵育時間延長而增大，后趨于穩(wěn)定；孵育時間為30 min時，熒光強度達(dá)到最大值；孵育時間大于30 min時，熒光強度基本不變，為了能夠快速檢測，孵育時間應(yīng)為30 min。

圖3 信號探針添加量（a）與孵育時間（b）的優(yōu)化Fig.3 Optimization of signal probe dosage (a) and incubation time (b)

2.4 熒光免疫分析方法的建立

利用建立的熒光免疫分析方法檢測酪胺，結(jié)果如圖4所示，未添加酪胺檢測時，體系的熒光強度為I0，不同質(zhì)量濃度的酪胺對應(yīng)不同的熒光強度I，隨著酪胺質(zhì)量濃度增加，檢測體系的熒光強度逐漸降低。以酪胺的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，熒光強度差值為縱坐標(biāo)，建立酪胺的熒光免疫分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=382.818 9lgx+649.831 8（R2=0.998 6），檢測限按照3 倍信噪比原則計算[28]，建立的方法檢測線性范圍為0.1～100.0 μg/L，方法檢測限為0.05 μg/L。

圖4 不同酪胺質(zhì)量濃度的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of tyramine at different concentrations

2.5 熒光免疫分析方法的特異性

為評價熒光免疫分析方法的特異性，對質(zhì)量濃度10 μg/L的酪胺及其同質(zhì)量濃度的結(jié)構(gòu)類似物、同類物進行檢測，并根據(jù)空白熒光強度計算相應(yīng)的熒光強度差值[29]，結(jié)果如圖5所示，酪胺熒光差值響應(yīng)高，亞精胺、精胺、組胺、酪氨酸、組氨酸、章魚胺、色胺、苯乙胺、5-羥色胺等類似物的響應(yīng)值從200逐漸降低至0，經(jīng)熒光免疫分析方法檢測，熒光差值響應(yīng)低，說明建立的熒光免疫分析方法能特異性檢測酪胺，其他生物胺和酪胺的結(jié)構(gòu)類似物均不會影響酪胺的檢測。

圖5 熒光免疫分析方法特異性分析Fig.5 Specificity analysis of fluorescence immunoassay

2.6 實際樣品檢測

為了進一步評價酪胺的熒光免疫分析方法檢測的準(zhǔn)確性和實際應(yīng)用性[28-29]，實驗進行樣品檢測和酪胺加標(biāo)回收實驗，結(jié)果如表2所示，未添加的樣品中均檢測出酪胺，而且熒光免疫分析方法的檢測結(jié)果與高效液相色譜法的檢測結(jié)果有很好的一致性。酪胺熒光免疫分析方法中，酪胺的添加回收率在86.44%～101.62%范圍內(nèi)，且變異系數(shù)小于10%；高效液相色譜法的酪胺添加回收率在87.40%～104.86%范圍內(nèi)，且變異系數(shù)小于10%。以上2 種方法的檢測結(jié)果在酪胺的本底值與添加量的2 種條件下均呈現(xiàn)一致性，因此本實驗建立的熒光免疫分析方法能夠應(yīng)用于肉及其制品、水產(chǎn)品以及發(fā)酵制品中酪胺的檢測。

表2 高效液相色譜法和熒光免疫分析方法檢測實際樣品中酪胺的結(jié)果（n= 3）Table 2 Comparison of results of HPLC and fluorescence immunoassay for tyramine in food samples (n= 3)

3 結(jié) 論

本實驗合成了在980 nm激發(fā)波長下具有483 nm特征發(fā)射峰的UCNPs作為信號標(biāo)記物，利用抗原-抗體的特異性識別作用和磁性微球的快速磁分離作用，建立快速、高特異性檢測食品中酪胺的熒光免疫分析方法，同時與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法相比，靈敏度更高、操作更簡單；與高效液相色譜方法相比，樣品前處理步驟不需要衍生化步驟，因此縮短了檢測時間。真實樣品中酪胺含量的測定結(jié)果與液相色譜檢測結(jié)果具有很好的一致性，說明本方法具有很好的實際應(yīng)用性。本實驗建立的熒光免疫分析方法可作為肉及肉制品、發(fā)酵產(chǎn)品以及水產(chǎn)品中酪胺的檢測工具。由于UCNPs的優(yōu)良光學(xué)特性，其作為信號標(biāo)記物可運用于食品中小分子危害物的高靈敏檢測方法中，因此有良好的應(yīng)用前景。