李巧峽，潘朝朝，黃小霞，李紀(jì)綱，張正蓉，王 勃

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是一種茉莉酸(jasmonic acid，JA)類似物，作為一種重要的天然植物生長調(diào)節(jié)劑，其廣泛地存在于植物體中，在植物生長發(fā)育以及抗脅迫中發(fā)揮著重要的作用[1]，目前，已有大量研究證實(shí)，當(dāng)植物處于病蟲害、高溫、低溫、干旱、鹽堿、重金屬脅迫等逆境條件下時(shí)，外源噴施MeJA，其作為一種信號(hào)分子通過氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)[2]，在細(xì)胞質(zhì)中被酯酶水解為有生物活性的茉莉酸，大量茉莉酸與異亮氨酸形成復(fù)合物JA-Ile (jasmonoyl-isoleucine)，使植物體內(nèi)茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列與抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，如蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)等，使植物體內(nèi)產(chǎn)生一些防御性化學(xué)物質(zhì)，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、 過氧化氫酶(catalase, CAT)、 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)活性變化等。有關(guān)植物抗逆性研究表明外施MeJA 在一定程度上能減緩各種生物與非生物脅迫對(duì)植物造成的傷害[3]，有效地提高植株的抗逆能力[4-5]，隨著MeJA 在植物抗逆機(jī)制中重要作用的揭示，其防御方面的作用研究也得到人們的廣泛關(guān)注，生物與非生物脅迫下外施MeJA 對(duì)植物生長調(diào)節(jié)作用和生理特性的研究，已在多種植物中有報(bào)道，如月季(Rosa chinensis)[6]、狹葉黃芩(Scutellaria regeliana)[7]、小麥(Triticum aestivum)[8]、草地早熟禾(Poa pratensis)[9]、 金葉銀杏(Ginkgo biloba)[10]、柑橘(Citrus reticulata)[11]等。

紫花地丁(Viola philippica)屬于堇菜科堇菜屬多年生草本植物，在我國除青海、西藏外其他各省區(qū)均有分布，因其具有很好的抗氧化[12]、抗菌[13]、抗炎[14-15]、抗癌[16]、抗病毒[17]等功效，被廣泛用于醫(yī)藥、食品等方面。同時(shí)，紫花地丁具有抗鹽、抗干旱以及花型優(yōu)美、花色鮮艷等特性，被廣泛用于園藝栽培等方面。但是，紫花地丁在生長過程中，如果在溫度過高或通風(fēng)不良的情況下，葉片表面易長葉螨，嚴(yán)重影響紫花地丁的生長發(fā)育。目前，在其他植物中已發(fā)現(xiàn)MeJA 具有提高植物防御能力的積極作用，但是對(duì)紫花地丁生長發(fā)育及抗逆能力是否有提高還未見報(bào)道。因此，本研究以紫花地丁為材料，通過探究外源噴施不同濃度MeJA 對(duì)紫花地丁生長及生理生化的影響，為紫花地丁的合理栽培及抗逆機(jī)制研究等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紫花地丁種子，采自甘肅省省委黨校草坪，成熟的蒴果裝與信封袋中讓其自然風(fēng)干，然后與4 ℃下保存待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選顆粒飽滿的紫花地丁種子，播種至穴盤中，當(dāng)其種子萌發(fā)并有4 片真葉后，進(jìn)行移栽，將幼苗移栽至營養(yǎng)土 ∶ 蛭石 = 3 ∶ 1 (體積比)的塑料花盆中，每盆中移栽2 株幼苗，將幼苗放置在光暗周期比為12 h/12 h (時(shí)控開關(guān)控制)、溫度為22～28 ℃、濕度為48%、光照強(qiáng)度為9 600 lx 的培養(yǎng)架上進(jìn)行生長。待其生長穩(wěn)定，至少發(fā)育有6 片真葉時(shí)，每周在紫花地丁幼苗葉片的下表皮噴施不同濃度的MeJA (0、1.25、2.5、5、10 mmol·L-1)。每個(gè)濃度下8盆，設(shè)3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.3 螨害指數(shù)和誘抗效果

噴施外源MeJA 第7 周后觀察并統(tǒng)計(jì)紫花地丁受葉螨侵染的各級(jí)葉片數(shù)，并計(jì)算螨害指數(shù)與誘抗效果，取3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。參照吳委林等[18]的方法，根據(jù)植株受螨害的程度將其分為0、1、2、3、4 級(jí)，0 級(jí)：葉片未受螨害，植株生長正常；1 級(jí)：葉片表面出現(xiàn)少量淡黃色小斑點(diǎn)，受害輕微，螨害面積占葉片面積的25%以下；2 級(jí)：葉面出現(xiàn)黃色斑，黃斑面積占葉片面積的26%～50%；3 級(jí)：葉面黃褐斑較多成片，黃褐斑面積占葉片面積的51%～75%，葉片局部卷縮；4 級(jí)：葉片受害嚴(yán)重，黃褐斑面積占葉片面積76%以上，嚴(yán)重時(shí)葉片枯萎、脫落。

計(jì)算紫花地丁葉片的螨害指數(shù)與誘抗效果：

1.4 生長指標(biāo)測(cè)定

紫花地丁幼苗葉片數(shù)、葉柄長、葉長、葉寬凈生長的測(cè)定：先對(duì)MeJA 處理前植株的葉片數(shù)、葉柄長、葉長、葉寬進(jìn)行測(cè)定。計(jì)數(shù)葉片數(shù)量，使用刻度尺測(cè)定其葉柄長、葉長、葉寬，數(shù)值精確到mm。然后，不同濃度的MeJA 處理7 周后，再對(duì)紫花地丁植株的生長指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，處理前后各生長指標(biāo)的差值即為紫花地丁幼苗葉片數(shù)、葉柄長、葉長、葉寬的凈生長值。

1.5 抗氧化酶活性測(cè)定

取紫花地丁幼苗葉片0.2 g，洗凈后置于提前預(yù)冷的研缽中，分3 次將0.05 mol·L-1pH 7.8 的磷酸緩沖液0.6、0.5 和0.5 mL 加入到預(yù)冷的研缽中，在冰上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，在4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清，上清液即為粗酶液，將粗酶液儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中待測(cè)定。取3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定紫花地丁葉片中SOD的活性[19]， 愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性[20]， 紫外吸收法測(cè)定CAT 活性[21]。

1.6 MDA 含量的測(cè)定

參照Bailly 等[22]的方法，利用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA 的含量。

1.7 LOX 活性的測(cè)定

參照王祎等[23]的方法，采用紫外分光光度法測(cè)定LOX 酶活性。

1.8 葉綠素含量的測(cè)定

采用分光光度法參照Arnon 方法[24-25]，并作部分修改，采用丙酮提取法測(cè)定紫花地丁葉片中葉綠素的含量。

1.9 可溶性糖含量的測(cè)定

參照李合生[26]的方法，利用蒽酮比色法測(cè)定紫花地丁葉片中可溶性糖含量。

1.10 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0 分析軟件在P＜ 0.05 水平下統(tǒng)計(jì)分析不同濃度的MeJA 溶液對(duì)紫花地丁生長指標(biāo)及生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)，用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測(cè)定結(jié)果，數(shù)據(jù)用Origin 2018 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MeJA 對(duì)紫花地丁抗葉螨的影響

與對(duì)照組(CK)相比，外源噴施不同濃度的MeJA溶液后，紫花地丁葉片表面侵染的葉螨數(shù)量減少，螨害指數(shù)明顯降低(P＜ 0.05)。且隨著MeJA 濃度的升高，植株抗螨能力升高，當(dāng)其濃度在10 mmol·L-1時(shí)，植株幾乎無葉螨侵染，螨害指數(shù)為0.16，抗螨效果達(dá)到99.68% (表1)。

表1 外源不同濃度的MeJA 對(duì)紫花地丁抗葉螨的影響Table 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the resistance of Viola philippica to spider mites

2.2 外源MeJA 對(duì)紫花地丁營養(yǎng)生長的影響

外源噴施不同濃度的MeJA溶液，隨著MeJA 濃度的升高，與對(duì)照組(CK)相比，紫花地丁植株的葉片寬、葉片長、葉片數(shù)和葉柄長均先增加后減少，且都在濃度為2.5 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比，分別顯著增加了20.20%、23.39%、50.30%和23.99% (P＜ 0.05) (圖1)。

圖1 外源不同濃度的MeJA 對(duì)紫花地丁營養(yǎng)生長的影響Figure 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the vegetative growth of Viola philippica

2.3 外源MeJA 對(duì)紫花地丁葉片抗氧化酶活性的影響

外源噴施不同濃度的MeJA 溶液，紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的活性均呈現(xiàn)一致的變化，隨著MeJA 濃度的升高，3 種酶的活性都升高(圖2)，當(dāng)濃度為10 mmol·L-1時(shí)，SOD、POD、CAT 的酶活性最高，與對(duì)照組(CK)比較，紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的活性分別提高了136.36%、66.90%、124.19%，說明高濃度的外源MeJA 更能夠顯著地提高紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的酶活性(P＜ 0.05) 。

圖2 外源不同濃度的MeJA 對(duì)紫花地丁抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the antioxidant enzyme activities of Viola philippica

2.4 外源MeJA 對(duì)紫花地丁葉片中MDA 含量和LOX 活性的影響

MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，因此其含量高低可以衡量膜脂過氧化的程度。與對(duì)照組(CK)相比，隨著外源MeJA溶液濃度的升高，紫花地丁葉片中的MDA 含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)(圖3)。在MeJA濃度達(dá)到10 mmol·L-1時(shí)，MDA 含量最低，比對(duì)照組顯著降低了44.87% (P＜ 0.05)，表明高濃度的MeJA 溶液能夠減緩紫花地丁葉片中膜脂過氧化的程度。隨著MeJA濃度的升高，紫花地丁葉片中脂氧合酶(LOX)活性逐漸升高，與對(duì)照組相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1濃度處理的LOX 活性分別顯著提高了14.29%、24.49%、46.94%和87.76% (P＜ 0.05)，其中10 mmol·L-1處理的增幅最大。結(jié)果表明，外源噴施高濃度的MeJA 溶液，可顯著提高紫花地丁葉片中的LOX 活性。

圖3 外源不同濃度的MeJA 對(duì)紫花地丁葉片中丙二醛含量和脂氧合酶活性的影響Figure 3 Effect of exogenous MeJA concentrations on malondialdehyde content and lipoxygenase (LOX) activity in leaves of Viola philippica

2.5 外源MeJA 對(duì)紫花地丁葉片葉綠素和可溶性糖含量的影響

葉綠素是衡量光合作用的重要指標(biāo)，噴施不同濃度的MeJA 后，紫花地丁葉片中葉綠素含量較對(duì)照組均呈增加趨勢(shì)(圖4)。與對(duì)照組(CK)相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1濃度處理分別增加了3.07%、5.66%、14.72%和22.62%；隨著外源MeJA 濃度的升高，與未噴施MeJA 組相比，紫花地丁葉片中可溶性糖含量也逐漸升高，當(dāng)MeJA 濃度達(dá)到10 mmol·L-1時(shí)，可溶性糖含量最高，與對(duì)照組相比，增加了58.57%。

圖4 外源不同濃度的MeJA 對(duì)紫花地丁葉片葉綠素和可溶性糖含量的影響Figure 4 Effect of exogenous MeJA concentrations on the chlorophyll and soluble sugar content in leaves of Viola philippica

3 討論

MeJA 作為一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以促進(jìn)植株生長發(fā)育，提高植物的抗蟲能力等。研究表明[27]蘋果樹(Malus pumila)噴施適宜濃度的MeJA溶液可以充當(dāng)殺螨劑的作用，進(jìn)而有效地防治蜘蛛螨對(duì)果樹的病害，Mageroy 等[28]用MeJA 噴灑云杉(Picea abies)的樹皮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)云杉對(duì)殺樹甲蟲及其相關(guān)的植物病原真菌的抵抗力增強(qiáng)。孫燦[29]用不同濃度MeJA 處理黃瓜(Cucumis sativus)和葎草(Humulus japonicus)，隨著MeJA 溶液濃度的增加，植物葉片的葉長、葉寬、葉柄長、葉片數(shù)量、葉面積均增加。何偉偉等[30]設(shè)置了4 個(gè)不同濃度的MeJA 浸種處理玉米(Zea mays)籽粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeJA 濃度為0.5 μmol·L-1時(shí)，玉米籽粒發(fā)芽率和芽長達(dá)到最大值。晏姿等[31]用不同濃度MeJA 溶液浸泡種球及噴施香雪蘭(Freesia hybrida)，發(fā)現(xiàn)MeJA溶液促進(jìn)了香雪蘭株高的生長。這些研究結(jié)果表明，MeJA 可以誘導(dǎo)植物的抗蟲性，促進(jìn)植物種子萌發(fā)及植物的生長。本研究結(jié)果與上述研究一致，MeJA 也能增加紫花地丁植株對(duì)葉螨的抵抗力，同時(shí)促進(jìn)紫花地丁的生長發(fā)育。

外源噴施MeJA 可有效提高植物的抗逆境與抗病蟲害的能力，主要機(jī)制在于可直接影響與植物抗逆相關(guān)的一些生理指標(biāo)，如SOD、POD、CAT、LOX等酶活性，以及MDA 含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量等。SOD、POD、CAT 是植物抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在各種生物與非生物脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，SOD 可以將這些有毒物質(zhì)的活性氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，然后由POD 和CAT將過量的H2O2轉(zhuǎn)變成水和氧氣，從而有效緩解逆境對(duì)植物的傷害[32]。MDA 是膜質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，能反映植物受傷害的程度[33]，本研究結(jié)果表明隨著外源MeJA 濃度的增加，SOD、CAT、POD 活性均呈上升趨勢(shì)，MDA 含量降低，這與在其他植物[34-36]中的研究結(jié)果一致，說明MeJA可以通過增加紫花地丁中SOD、CAT、POD 的活性，使植物細(xì)胞內(nèi)的過氧化物及時(shí)清除，減少細(xì)胞膜脂過氧化，從而有效緩解葉螨對(duì)紫花地丁的傷害，提高紫花地丁的抗逆性。LOX 存在于植物的葉綠體膜中，在逆境脅迫下參與茉莉酸的合成，其活性的高低影響植物內(nèi)源茉莉酸類物質(zhì)水平，與植物的防御狀態(tài)密切相關(guān)。鞏莎[37]用MeJA 處理?xiàng)棙?Ziziphus jujube)，發(fā)現(xiàn)MeJA 能顯著提高LOX 等防御酶活性，且棗樹上日本龜蠟蚧(Ceroplastes japonicas)雌成蟲蜜露排泄量減少，表明MeJA 作為外源信號(hào)分子可以增強(qiáng)棗樹對(duì)害蟲的抵抗性。這與本研究結(jié)果一致，說明外源茉莉酸甲酯可以增強(qiáng)紫花地丁植株抗氧化酶活性和LOX 防御酶活性，有效增加植物的防御能力。

外源MeJA 可通過影響植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光合作用強(qiáng)度來提高植物的抗逆性，可溶性糖是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，研究表明植物中可溶性糖含量越多，植株抗逆能力越強(qiáng)[38]。葉綠素含量可以反映植物的光合作用強(qiáng)度，在一定程度上葉綠素含量越高，植株光合作用越強(qiáng)，逆境脅迫會(huì)使植物葉片葉綠素含量降低而影響光合作用。在本研究中，經(jīng)MeJA 處理后的紫花地丁可溶性糖含量和葉綠素含量均高于對(duì)照組，說明MeJA 處理后可顯著緩解螨害脅迫對(duì)紫花地丁造成的不良影響。鄔亞紅[39]研究發(fā)現(xiàn)用茉莉酸甲酯噴施辣椒(Capsicum annuum)后，辣椒葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量及可溶性糖含量隨著茉莉酸甲酯濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，辣椒葉片上的煙粉虱(Bemisia tabaci)的種群數(shù)量迅速下降。另外，研究發(fā)現(xiàn)用1.5 mmol·L-1的MeJA 處理接種白粉病的草地早熟禾(Poa pratensis)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白粉病斑面積減少，植株的植株體內(nèi)的葉綠素含量和可溶性糖的含量均增加[9]。因此，結(jié)合前人研究與本研究結(jié)果，表明MeJA 也可通過增加紫花地丁植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和葉綠素含量來提高其對(duì)葉螨的抵抗力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，葉面噴施適宜濃度的MeJA能增加紫花地丁對(duì)葉螨的抵抗力，減少病害，促進(jìn)紫花地丁的生長發(fā)育，當(dāng)MeJA 的濃度為2.5 mmol·L-1時(shí)，葉片數(shù)量、葉柄長、葉寬、葉長達(dá)到最大值；外源MeJA 濃度的升高，可以顯著增加CAT、POD、SOD、LOX 活性及葉綠素和可溶性糖的含量，紫花地丁的MDA 含量隨著外源MeJA 濃度的增高，而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在10 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最低。這些結(jié)果表明外源噴施MeJA 通過影響各種酶活性及相應(yīng)生理指標(biāo)，提高了紫花地丁對(duì)葉螨的抵抗性，從而有利于植物的生長發(fā)育。本研究為以后研究紫花地丁的合理栽培及抗逆機(jī)制研究等方面提供理論依據(jù)。